人细小病毒B19三种基因型的实时荧光定量PCR检测方法及其通用检测引物、TaqMan探针 ...的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种对人细小病毒B19三种基因型同时进行定性、定量检测的实时荧光定量PCR检测方法及其通用检测引物、TaqMan探针与试剂盒。本发明通用检测引物、TaqMan探针可结合实时荧光定量PCR实现准确定性、定量待测样本中三种基因型B19病毒DNA的目的，基于此形成的针对B19病毒三种基因型的NAT检测方法明显优于现有的检测技术，具有准确度高、低污染、检测速度快、对仪器设备要求低和成本低廉等优点，除临床检测和血液筛查外，还能对科研以及生产中对原料血浆和血液制品中B19病毒的污染状况进行定性和定量分析，对保障血液制品的病毒安全性具有重要意义。
【专利说明】人细小病毒BI 9三种基因型的实时荧光定量PCR检测方法及其通用检测引物、TaqMan探针与试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】中核酸的分子生物学检测方法，特别是涉及人细小病毒B19三种基因型的实时荧光定量PCR检测方法及其通用检测引物、TaqMan探针与试剂盒。
【背景技术】
[0002]人细小病毒B19 (B19病毒)与输血安全和血液制品的病毒安全性密切相关。B19病毒是目前确认的唯一可致人类疾病的细小病毒。B19病毒感染后临床表现多样。儿童B19病毒感染以传染性红斑(EI)多见，又称“第五病”。成人感染常为隐性感染，或者仅出现轻微发热、头痛等类似感冒的症状，免疫功能缺陷患者感染可以导致慢性贫血，血液病人感染可以引起短暂性再生障碍危象(TAC)，孕妇感染则可以导致流产、死产和水肿性死胎等。B19病毒感染还可以引发很多并发症，包括嗜血细胞综合征、肺炎、肾小球肾炎、神经系统症状、肝炎、过敏性紫癜、血管炎、心肌炎、心包炎等。除上述症状和疾病外，B19病毒还被认为与多种自身免疫病有关，包括系统性红斑狼疮、巨细胞动脉炎、结节性多动脉炎、特发性血小板减少性紫癜等。
[0003]B19病毒急性感染期，患者血液中病毒含量可高达IO11-IO14拷贝/mL。部分病毒感染者经过急性感染期后，病毒不被清除而形成持续感染，血液中病毒含量在IO3-IO7拷贝/mL之间，病毒在体内持续时间可长达几个月甚至几年。
[0004]B19病毒传播途径除主要经呼吸道传播 外，也可通过输血、血液制品传播，且因为接受输血和应用血液制品的人群常常有血液病、免疫缺陷或其它疾患存在，病毒感染后更容易导致疾病的发生。因此，血液、血制品感染途径具有更重要的临床意义。
[0005]近年来，国际组织及发达国家对于原料血浆及血液制品中B19病毒的污染均采取了一定的监控措施。国际血浆蛋白治疗协会(PPTA)是全球血浆采集和治疗产业的代表机构。PPTA在2003年制定相关标准:混合血浆中细小病毒B19DNA含量不能超过105IU/mL，并将核酸检测技术(nucleic acid amplification technology,NAT)作为检测B19病毒载量的一种在线控制措施执行。美国食品与药品监督管理局(FDA)于2009年建议混合血浆中B19病毒的含量控制在< 104IU/mL的水平，将NAT方法作为在线控制措施，并且要求使用的NAT技术能检出B19病毒的全部基因型(即能同时检出B19病毒的三种基因型)。欧洲药典对于抗D免疫球蛋白及S/D灭活血浆也做出要求，B19病毒载量低于104IU/mL。
[0006]NAT是一种新兴的血液传染病检测方法，其敏感性和特异性均很高，可用于B19病毒感染的早期诊断及B19病毒分子流行病学调查。除此之外，还被血液制品生产企业用来进行原料血浆和血液制品生产的质量控制。目前，国内外常用来检测B19病毒的NAT技术主要为聚合酶链反应技术(polymerase chain reaction,简称PCR)和实时突光定量PCR技术。
[0007]PCR是一种利用DNA变性和复性原理在体外进行特定的DNA片段高效扩增的技术，可检出微量靶序列。在模板DNA、弓丨物和四种脱氧核糖核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。仅需用极少量模板，在一对引物介导下，可扩增至100万-200万份拷贝。PCR反应分三步:变性、退火及延伸。以上三步为一循环，每一循环的产物作为下一个的模板，这样经过多个循环，可得到大量复制的特异性DNA片段。
[0008]实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，由于该技术不仅实现了 PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、自动化程度更高、可有效解决PCR污染问题等特点，目前已得到广泛应用。所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。TaqMan荧光探针:PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’ 一 3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
[0009]为制备高特异性、高敏感性、重复性好的B19病毒荧光定量PCR检测试剂盒，其关键在于获得针对B19病毒各种基因型及分离株的特异、敏感的通用引物及通用探针。目前，常用的检测技术只针对B19病毒的I型，无法实现对B19病毒全部基因型的检测。
【发明内容】
[0010]本发明的目的是提供一种特异性和灵敏度较高、省时省力的人细小病毒B19三种基因型同时进行定性、定量检测的实时荧光定量PCR检测方法及其通用检测引物、TaqMan探针与试剂盒。
[0011]本发明所提供的一对用于对人细小病毒B19 (B19病毒)三种基因型进行实时荧光定量PCR检测的通用型引物，其上游引物的核苷酸序列如序列表中SED ID NO:1所示，下游引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0:2所示。
`[0012]将上游引物命名为P(NSl-1)，序列表中的SEQ ID NO:1由20个碱基组成，该序列位于B19病毒NSl基因自5’端第1638-1657位碱基；将下游引物命名为P (NS1-2)，SEQ IDNO:2由23个碱基组成，该序列为B19病毒NSl基因自5’端第1736-1758位碱基的反向互补序列。
[0013]由上述引物衍生的引物序列也属于本发明的保护范围。所述衍生序列是指在SEQID N0:1和/或SEQ ID NO:2的基础上经过一至十个碱基的取代、缺失或添加得到的引物序列。
[0014]上述引物既适用于B19病毒三种基因型的实时荧光定量PCR检测中，也可用于该病毒的常规PCR检测技术中，其检测对象是B19病毒的NSl基因。若以待测样品中提取的DNA为模板，在上述弓丨物的引导下进行PCR扩增，扩增产物中若有12Ibp大小的条带，则样品中含有B19病毒。
[0015]本发明还提供了用于对B19病毒三种基因型同时进行实时荧光定量PCR检测的通用型TaqMan探针。
[0016]本发明所提供的TaqMan探针，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:3所示；所述探针为经过荧光标记的，其5’端标记有报告荧光基团，3’端标记有淬灭荧光基团。[0017]所述报告荧光基团可为HEX、FAM等，优选为HEX ;所述荧光淬灭基团可为ECLIPSE、TAMRA 等，优选为 ECLIPSE。
[0018]为防止PCR扩增时被延伸，所述探针的3’端还需经磷酸化处理。
[0019]将序列表中SEQ ID NO:3所示的TaqMan探针命名为TaqManProbe (NSl)，序列表中的SEQ ID NO:3由26个碱基组成，该序列为B19病毒NSl基因自5’端第1655-1680位喊基。
[0020]由上述TaqMan探针序列的衍生序列也属于本发明的保护范围。所述衍生序列是指在SEQ ID NO:3的基础上，在序列的5’端和/或3’端再添加、减少一个或多个碱基得到的序列。
[0021]本发明所提供的同时检测B19病毒三种基因型的实时荧光定量PCR检测试剂盒，包含上述用于对人细小病毒B19 (B19病毒)三种基因型进行实时荧光定量PCR检测的通用型引物和TaqMan探针。
[0022]具体的，该试剂盒可为将用于对人细小病毒B19 (B19病毒)三种基因型进行实时荧光定量PCR检测 的引物、TaqMan探针混合液120 μ L (含P (NSl-1) 48 μ L，P (NS1-2) 48 μ L, TaqManProbe (NSl) 24 μ L)、定量 PCR 反应 Mix 液(Platinum QuantitativePCR SuperMix-UDG) 480 μ L、B19_pUC19 标准品(I X 104、I X 103、I X 102、I X IO1 拷贝 / μ L4个梯度，每个梯度各30 μ L)、和阴性对照(B19病毒核酸阴性的血浆)150 μ L共同包装，得到可同时对人细小病毒Β19 (Β19病毒)三种基因型进行定性、定量检测的实时荧光定量PCR检测试剂盒。
[0023]本发明还提供了一种针对原料血浆或血液制品用上述实时荧光定量PCR检测试剂盒同时对Β19病毒三种基因型进行检测的方法，可包括以下步骤:
[0024]I)标准曲线的建立:用携带121bp B19病毒NSl基因保守区的质粒作为标准品，梯度稀释成 I X ?ο10、I X IO9、I X 108、I X 107、I X IO6、I X 105、I X IO4、I X 103、I X IO2 拷贝 / μ L，将质粒作为模板，在试剂盒中通用型引物和TaqMan探针的引导下进行Β19病毒NSl基因的实时荧光定量PCR检测，检测结束后，以各标准品的浓度Log值对其相应Ct值作图，绘制标准曲线；
[0025]2)以原料血浆或血液制品为待测样本，提取待测样本的DNA，以提取的DNA为模板，在试剂盒中通用型引物和TaqMan探针的引导下进行B19病毒NSl基因的实时荧光定量PCR检测；
[0026]3)根据待测样本的荧光信号的变化及强度，对待测样本中的B19病毒NSl基因进行定性、定量检测，出现荧光扩增曲线表明样本中含有B19病毒NSl基因，未出现荧光扩增曲线表明样本中不含有B19病毒NSl基因，再根据样本的荧光信号强度和步骤I)中的标准曲线，得到样本中B19病毒NSl基因的含量。
[0027]在上述检测方法中，所述步骤I)和步骤2)中的20 μ L实时荧光定量PCR反应体系可包括:1 XPlatinum Quantitative PCR SuperMix-UDG, 500nM P(NS1-1)，500nMP (NS1-2)，250nM TaqManProbe (NSl)，模板 3 μ L，加 ddH20 M 20 μ L0
[0028]所述步骤I)和步骤2)中的实时荧光定量PCR反应条件可为:先50°C 2min,95°C 2min ;然后95°C 9s,60°C 30s，共40个循环。在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。[0029]从技术上，上述使用实时荧光定量PCR检测试剂盒同时对B19病毒三种基因型进行检测的方法同样适用于临床样本或面向献血人群的血液筛查样本。但本发明声明放弃与此应用相关的权利，因此，所述检测方法偏向应用于对于原料血浆及血液制品中B19病毒污染的监控，以对从原料到成品的生产环节进行B19病毒检测。
[0030]本发明提供了人细小病毒B19三种基因型同时进行定性、定量检测的实时荧光定量PCR检测方法及其通用检测引物、TaqMan探针与试剂盒。该方法是通过提取待测样品的DNA，再结合通用检测引物、TaqMan探针和实时荧光定量PCR检测技术，可达到准确定性、定量待测样本中三种基因型B19病毒DNA的目的。该方法是以待检样品中的核酸为检测对象，准确度、灵敏度及稳定性均较好。本发明具有以下优点:
[0031]1、首次建立了人细小病毒B19三种基因型的实时荧光定量PCR检测方法，利用此检测方法可以对原料血浆及相关生物制品进行批量检测。
[0032]2、本检测方法与人细小病毒B19三种基因型的其它常规检测方法如病毒的分离培养鉴定、B19病毒抗体ELISA法和Nest-PCR相比，灵敏度较高，取样便捷，检测效率得到了大幅提高，并且有效地防止了操作过程中的实验污染。
[0033]3、本检测方法与人细小病毒B19三种基因型的其它常规检测方法，如病毒的分离培养鉴定、B19病毒抗体ELISA法和Nest-PCR相比，具有操作程序简单易用的特点，并可进一步制成检测试剂盒，操作程序化，适合推广和应用。
[0034]4、本检测方法不仅能够评价人细小病毒B19三种基因型的感染状况，同时也为人细小病毒B19三种基因型的流行病学、致病机理等相关领域的研究提供了依据。
[0035]综上所述，本发明可实现对人细小病毒B19三种基因型同时进行定性、定量检测，是因为本发明对比了 GenBank中B19病毒三种基因型代表株(GenBankN0.:prototype:M13178 ；Lali:AY044266 ；V9:NC-004295)的基因序列，设计了针对 NSl 基因保守区的可同时检测B1 9病毒三种基因型的引物与探针。通过提取待测样品的DNA，再结合PCR技术或实时荧光定量PCR检测技术，可达到准确定性或定量检测样本中B19病毒DNA的目的。本发明B19病毒三种基因型的NAT检测方法明显优于现有的检测技术，具有准确度高、低污染、检测速度快、对仪器设备要求低和成本低廉等优点，适合推广和应用。本发明设计了能同时检测B19病毒全部三种基因型的通用引物和探针，除了可用于临床检测及献血/浆人群进行血液筛查外，还可用于科研以及生产中对原料血浆和血液制品中B19病毒的污染状况进行定性和定量分析，对保障我国血液制品的病毒安全性具有重要意义。
[0036]下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
【专利附图】
【附图说明】
[0037]图1为PCR扩增三种基因型的人细小病毒B19NS1基因保守区的2%琼脂糖凝胶电泳检测结果
[0038]图2为以标准品质粒为模板进行实时荧光定量PCR的扩增曲线
[0039]图3为以标准品质粒为模板进行实时荧光定量PCR的标准曲线
[0040]图4为以样品为模板进行实时荧光定量PCR的扩增曲线
[0041]图5为B19病毒实时荧光定量PCR检测方法特异性检测的扩增结果
[0042]图6为B19病毒实时荧光定量PCR检测方法准确性和稳定性检测的扩增结果[0043]图7为B19病毒实时荧光定量PCR检测方法灵敏度检测的扩增结果【具体实施方式】
[0044]下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见:((Molecular Cloning:A Laboratory Manual))(Sambrook, J.,Russell,David ff.,MolecularCloning:A Laboratory Manual, 3rd edition, 2001, NY, Cold Spring Harbor)。
[0045]所述百分比浓度如无特别说明均为质量/体积(W/V)百分比浓度或体积/体积(V/V)百分比浓度。
[0046]实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。
[0047]所用引 物和TaqMan探针均由大连宝生物公司合成,标准品质粒由中美泰和生物技术(北京)有限公司合成。
[0048]实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。
[0049]实施例1、用于可同时对人细小病毒B19 (B19病毒)三种基因型进行定性、定量检测的实时荧光定量PCR检测引物及TaqMan探针的设计
[0050]根据GenBank 中 B19 病毒三种基因型代表株(GenBank N0.!prototype:Ml3178 ；Lali:AY044266 ；V9:NC-004295)的基因序列，利用DNA Man软件进行比对后，根据引物、TaqMan探针设计原则，选取121bp的NSl基因保守区域序列(如序列表中SEQ ID NO:4所示)作为检测序列，设计同时检测B19病毒三种基因型的实时荧光定量PCR检测引物及TaqMan探针，得到序列如下:
[0051]上游引物P(NSl-1):5’-CGGGACCAGTTCAGGAGAAT-3’(序列表中 SEQ ID NO:l),Tm值为 57.40C ；
[0052]下游引物P(NSl-2):5’-CCCAACTAACAGTTCACGAAACT-3’(序列表中 SEQ ID NO:2),Tm 值为 56.6°C ；
[0053]TaqManProbe(NSl):5’HEX-AATCATTTGTCGGAAGCCCAGTTTCC-ECLIPSE3’(序列表中SEQ ID NO:3)，Tm 值为 60.9°C。
[0054]将上游引物命名为P(NSl-1)，序列表中的SEQ ID NO:1由20个碱基组成，该序列位于B19病毒NSl基因自5’端第1638-1657位碱基；将下游引物命名为P (NS1-2)，SEQ IDNO:2由23个碱基组成，该序列为B19病毒NSl基因自5’端第1736-1758位碱基的反向互补序列。
[0055]将TaqMan探针命名为TaqManProbe (NSl)，序列表中的SEQ ID NO:3由26个碱基组成，该序列为B19病毒NSl基因自5’端第1655-1680位碱基。
[0056]将上述TaqMan探针的5’端标记报告荧光基团HEX，3’端标记淬灭荧光基团ECLIPSE，并将探针的3’端进行磷酸化处理。
[0057]实施例2、用本发明的引物对人细小病毒B19三种基因型进行常规PCR检测
[0058]1、提取B19病毒的DNA[0059]将分别包含三种基因型的B19病毒国际标准品血浆(NIBSC code:09/110)作为待测样品(三个样品)，用High Pure Viral Nucleic Acid Kit (Roche)并参照试剂盒说明书提取B19病毒DNA。
[0060]2、常规PCR检测
[0061]分别以步骤I提取的不同基因型的B19病毒核酸为模板，在本发明引物P(NSl-1)和P(NSl-2)的引导下PCR扩增121bp的NSl基因保守区，25 μ L PCR反应体系为:10XPCR缓冲液(配方:Tris.HCl (ρΗ8.3)100mM,KC1500mM,MgCl215mM)2.5 μ L, dNTPs (2.5mM each)2μ L,400nM P (NS1-1)，400nM P (NS1-2)，DNA 模板 5 μ L，5U Taq 酶(TaKaRa)，加 ddH20 至25 μ L。PCR 反应条件为:先 94°C 5min ;然后 94°C 30s, 60°C 30s, 72°C lmin，共 35 个循环；最后72°C 10min，4°C终止反应。反应结束后，将PCR扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳检测(100V电泳40min)，检测结果如图1所示(泳道M:Marker DL500，泳道A:B19病毒I型，泳道B:B19病毒2型，泳道C:B19病毒3型，泳道D:阴性对照)，结果分别加有B19病毒三种基因型的样品经PCR扩增均得到了 121bp的目的条带，与预期结果相符，表明本发明的引物可用于人细小病毒B19三种基因型的常规PCR (定性)检测。
[0062]实施例3、用本发明的引物及TaqMan探针进行B19病毒的实时荧光定量PCR检测
[0063]1、B19病毒DNA的提取
[0064]取两份原料血衆和一份血液制品作为待测样品，使用High Pure Viral NucleicAcid Kit (Roche)并参照试剂盒说明书提取样品DNA。
[0065]2、实时荧光定量PCR标准品的制备
[0066]本发明构建阳性标准品质粒`的目的基因片段为121bp的B19病毒NSl基因保守区，克隆载体为PUC19载体，载体大小为2686bp，Amp+抗性，将B19病毒NSl基因保守区连接入pUC19载体多克隆位点的Sal I和BamH I酶切位点之间，将携带有B19病毒NSl基因保守区的重组质粒命名为B19-pUC19。利用Primer Premier5.0软件对此序列进行评价,在符合实时荧光定量PCR实验对TaqMan探针及引物的要求的情况下，送与中美泰和生物技术(北京)有限公司合成B19-pUC19全基因，全基因序列如序列表中SEQ ID NO:5所示。
[0067]对全基因合成的阳性质粒进行扩大培养，转化大肠杆菌DH5CI感受态细胞，经Amp+抗性筛选，挑取单菌落小量制备质粒DNA，即得到阳性标准品。用紫外分光光度计准确定量后，根据以下公式计算出其拷贝数，进行10倍梯度稀释，浓度依次为ΙΧΙΟ'ΙΧΙΟ9、I X 108、1X 107、1X 106、1X 105、1X 104、1X 103、1X IO2 拷贝 / μ L，作为标准品保存于-200C备用。
【权利要求】
1.用于对人细小病毒B19(B19病毒)三种基因型进行实时荧光定量PCR检测的通用型引物，其上游引物(命名为P(NSl-1))的核苷酸序列如序列表中SED ID NO:1所示，下游引物(命名为P(NSl-2))的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示；或， 由SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2经过一至十个碱基的取代、缺失或添加得到的衍生序列表示的引物。
2.用于对B19病毒三种基因型同时进行实时荧光定量PCR检测的TaqMan探针，命名为TaqManProbe (NSl)，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:3所示。
3.根据权利要求2所述的TaqMan探针，其特征在于:所述探针为经过荧光标记的，其5’端标记有报告突光基团,3’端标记有淬灭突光基团；所述报告突光基团可为HEX、FAM,优选为HEX ;所述荧光淬灭基团可为ECLIPSE、TAMRA，优选为ECLIPSE。
4.根据权利要求2或3所述的TaqMan探针，其特征在于:所述探针的3’端还需经磷酸化处理。
5.根据权利要求2或3或4所述的TaqMan探针,其特征在于:由上述TaqMan探针序列的衍生序列表不；所述衍生序列是指在SEQ ID NO:3的基础上，在序列的5’端和/或3’端再添加、减少一个或多个碱基得到的序列。
6.一种同时检测 B19病毒三种基因型的实时荧光定量PCR检测试剂盒，包含有权利要求I所述的通用型引物和权利要求2-5任一所述的TaqMan探针。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于:为将用于对人细小病毒B19(B19病毒)三种基因型进行实时荧光定量PCR检测的引物、TaqMan探针混合液120yL (含P (NSl-1) 48 μ L，P (NS1-2) 48 μ L, TaqManProbe (NSl) 24 μ L)、定量PCR 反应Mix 液(PlatinumQuantitative PCR SuperMix-UDG) 480 μ L、B19_pUC19 标准品(I X 104、I X 103、I X 102、IXlO1拷贝/ μ L4个梯度，每个梯度各30 μ L)、和阴性对照(Β19病毒核酸阴性的血浆)150 μ L共同包装，得到可同时对人细小病毒Β19 (Β19病毒)三种基因型进行定性、定量检测的实时荧光定量PCR检测试剂盒。
8.—种针对原料血浆和血液制品用权利要求6或7所述实时荧光定量PCR检测试剂盒同时对Β19病毒三种基因型进行检测的方法，包括以下步骤: 1)标准曲线的建立:用携带121bpB19病毒NSl基因保守区的质粒作为标准品，梯度稀释成 I X 1010、I X IO9、I X 108、I X 107、I X IO6、I X 105、I X IO4、I X 103、I X IO2 拷贝 / μ L，将质粒作为模板，在试剂盒中通用型引物和TaqMan探针的引导下进行Β19病毒NSl基因的实时荧光定量PCR检测，检测结束后，以标准品浓度为横坐标、以荧光信号强度为纵坐标绘制标准曲线； 2)以原料血浆或血液制品为检测样本，提取检测样本的DNA，以提取的DNA为模板，在试剂盒中通用型引物和TaqMan探针的引导下进行Β19病毒NSl基因的实时荧光定量PCR检测； 3)根据检测样本的荧光信号的变化及强度，对样本中的Β19病毒NSl基因进行定性、定量检测，出现突光扩增曲线表明样本中含有Β19病毒NS I基因,未出现突光扩增曲线表明样本中不含有含有Β19病毒NSl基因，再根据样本的荧光信号强度和步骤I)中的标准曲线，得到样本中Β19病毒NSl基因的含量。
9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于:所述步骤I)和步骤2)中的20μ L实时突光定量PCR反应体系可包括:1 XPlatinum Quantitative PCR SuperMix-UDGlO μ L,500nM P (NSl-1) I μ L, 500ηΜ P (NS1-2) I μ L, 250nMTaqManProbe (NSl) 0.5 μ L,模板 3 μ L，加ddH20 至 20μ L。
10.根据权利要求8或9所述的检测方法，其特征在于:所述步骤I)和步骤2)中的实时荧光定量PCR反应条件可为:先50°C 2min，95°C 2min ;然后95°C 9s,60°C 30s，共40个循环。在每个循环 的延伸结束时进行荧光信号检测。
【文档编号】C12Q1/68GK103451320SQ201310378628
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2013年8月27日 优先权日:2013年8月9日
【发明者】马玉媛, 章金刚, 贾俊婷, 赵雄, 郭逸, 吕茂民, 尹惠琼 申请人:中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所