双靶向固体脂质磁性纳米粒及其制备方法
【专利摘要】本发明提供一种具有双重靶向作用的固体脂质磁性纳米粒，该磁性纳米粒由F-68溶液、硬脂胺-半乳糖嫁接物、单甘脂、四氧化三铁及油酸乙醇组成。通过硬脂胺、乳糖酸和碳二亚胺溶于无水乙醇中，得硬脂胺-半乳糖嫁接物，以水性溶剂扩散法制备脂质磁性纳米粒。本发明提供的固体脂质磁性纳米粒，可制备成一种对肝脏具有主动和被动双重靶向功能的磁共振特异对比剂，可应用于生物医学领域。利用这种对比剂，有望实现安全、快速的肝靶向分子影像成像；提高我国磁共振对比剂研发的自主创新能力，为开拓我国磁共振新型对比剂的研发，提供理论与技术基础。
【专利说明】
双靶向固体脂质磁性纳米粒及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属化合物制备方法，涉及固体脂质磁性纳米粒的合成方法，以及作为纳米级肝组织双靶向磁共振对比剂在生物医学领域中的应用。
【背景技术】
[0002]磁共振成像(MRI)技术是目前对肝脏疾病，尤其是局灶性病变的诊断和鉴别诊断最有效的影像学检查手段之一，能够提供准确的解剖形态和功能信息，在分子成像中具有良好的应用前景。但是，MRI对分子探针探测的灵敏度低，要实现疾病的MR分子成像，必须要有足够浓度的对比剂与相关分子靶点结合，并产生可分辨的MR信号改变。因此，制备安全有效的靶点特异性对比剂是MRI分子成像的关键所在，不仅可以减少成像所需对比剂的剂量，降低对比剂所致的毒副作用，还可以提高疾病早期诊断的准确性。
[0003]固体脂质纳米粒(Solid lipid nanoparticles, SLN)是近年来正在发展的一种新型纳米粒给药系统，其为粒径在l(Tl 000 nm之间的固态胶体颗粒。这种新型给药载体使用无生物毒性的脂质作为基质，同时具备纳米粒的物理稳定性高、可控制药物释放以及良好的靶向性等优势，又兼具了脂质体、乳剂的毒性低、能大规模生产的优点，是一种极有发展前景的新型给药载体。SLN以固态的天然或合成的类脂如单硬脂酸甘油酯、卵磷脂、三酰甘油等为载体材料，大多数为内源性物质，将药物或造影剂包裹或内嵌于类脂核中制成酸态固体胶粒给药系统，具有毫微粒和脂质体的双重特点，起到避免药物泄漏及良好的靶向性等优点，因其表面具有强疏水性，能够提闻网状内皮系统的吞曬率，从而大大提闻了药物或造影剂在肝脏中的浓度，具有显著的被动肝靶向作用。SLN还具有下列特点:(1)毒性低，SLN对不同细胞毒性(半数细胞致死量)介于400-500 μδ/πι1之间；(2)SLN采用脂肪酸等类脂为主要材料，具有较低的代谢毒性；(3)与其它载体如右旋糖酐比较，SLN纳米粒表面为强疏水性，在体内易与调理蛋白结合，静脉注射进入机体后，很快被Kupffer细胞吞噬而被动进入肝脏，具有显著的被动肝靶向作用；(4) SLN具有细胞摄取及转运能力，为疾病确诊后的即时靶向治疗提供可能。
[0004]去唾液酸糖蛋白受体(Asialoglycoprotein receptor, ASGPR)又称肝凝集素受体或肝细胞半乳糖受体，是一种完全由哺乳动物肝窦状隙的肝实质细胞特异性表达的膜表面蛋白，能够特异性地识别带有半乳糖残基的糖蛋白，每个肝细胞表面有多达5 X 15个受体，而在肝炎、肝硬化、肝癌或等肝转移癌等肝脏疾病时，其数量和功能均有所下降。半乳糖(Gal)是ASGPR的特异性配体，是肝靶向基团，具有诱导和提高肝细胞在细胞外基质支架材料上的粘附性能，半乳糖受体介导的载体交联物已成为肝靶向研究的热点之一。
【发明内容】
[0005]本发明的第一个目的是提供具有双重靶向作用的固体脂质磁性纳米粒。该磁性纳米粒由F-68溶液(94%)、硬脂胺-半乳糖嫁接物(0.4%)、单甘脂(3.6%)、四氧化三铁纳米溶液(1%)及油酸乙醇(1%)等组成，其中的百分比为体积比。脂质材料为单甘脂。
[0006]拟将经Gal修饰后的SLN作为肝靶向特异对比剂载体，构建经USP1标记的肝双靶向特异对比剂，可能大大提高对比剂靶向性，而有望降低对比剂注射剂量，最终实现降低对比剂对全身毒副作用的目的。
[0007]本发明的第二个目的是提供固体脂质磁性纳米粒的制备方法，通过以下方案实现:
(I)硬脂胺-半乳糖嫁接物的合成
取市售硬脂胺、乳糖酸和碳二亚胺(EDC，18.4 mmol)溶于一定量的无水乙醇中，在室温下搅拌反应72 h后，加水沉淀产物，离心分离后所得沉淀经干燥后，得硬脂胺-半乳糖嫁接物，其结构通过红外光谱(FTIR)和氢谱核磁共振(1H NMR)进行确证。
[0008](2)肝双重靶向脂质磁性纳米粒的制备
以水性溶剂扩散法制备脂质磁性纳米粒。具体方法为:将一定量油溶性的Fe3O4 (粒径为5 nm，浓度为5 mg/ml)为核心的磁性纳米粒溶液超声分散于F-68溶液(Poloxamer 188，
0.1 %,w/v)中，探头持续超声30 min (600 w,工作2 s,间歇3 s)后,加入10 mg/ml的油酸乙醇溶液，探头超声5 min，以得到Fe3O4纳米粒分散液。分别取单甘脂和硬脂胺-半乳糖嫁接物，并溶于一定量的无水乙醇中，水浴70°C加热使其完全融解；在水浴70°C的超声条件下，将脂质的乙醇溶液快速注入到Fe3O4纳米粒分散液中，持续超声5 min后,最终得到肝双祀向脂质磁性纳米粒。
[0009]本发明的第三个目的是提供所述固体脂质磁性纳米粒在制备对肝脏具有双重靶功能的磁共振对比剂中的应用。
[0010]本发明在我们前期的研究工作基础上，采用乳糖酸(LA)和硬脂胺(ODA)之间的化学耦合反应制备半乳糖-硬脂胺嫁接物，在此基础上，以单甘脂为脂质材料，采用水性溶剂扩散法制备对肝脏具有双重靶向功能的脂质磁性纳米粒。该材料的出现、以及经过进一步的载体应用研究，将大大推动肝脏的靶向磁共振对比剂发展。
[0011]本发明所提供的固体脂质磁性纳米粒，可制备成一种对肝脏具有主动和被动双重靶向功能的新型磁共振特异对比剂，可应用于生物医学领域。利用这种对比剂，有望实现安全、快速的肝靶向分子影像成像；提高我国磁共振对比剂研发的自主创新能力；为开拓我国磁共振新型对比剂的研发，提供理论与技术基础。
【专利附图】
【附图说明】
[0012]图1为本发明肝组织双靶向脂质磁性纳米粒的制备路线图。
[0013]图2为嫁接物的红外光谱。
[0014]图3为嫁接物的1H核磁共振图谱。
[0015]图4为脂质磁性纳米粒的透射电子显微镜(TEM)观察。
[0016]图5为脂质磁性纳米粒与L02细胞系共孵育48 h后细胞的存活情况。
[0017]图6为脂质磁性纳米粒在L02细胞上不同时间点(I h、4 h和12 h)的摄取情况。
[0018]图7为不同铁浓度(Pg/ml)的脂质磁性纳米粒的T2*WI磁共振图像。
【具体实施方式】
[0019]本发明结合附图和实施例作进一步的说明。
[0020]实施例一:硬脂胺-半乳糖嫁接物的合成
取市售硬脂胺(ODA，Mw:269.5)、乳糖酸(LA，Mw:358.3)和碳二亚胺(EDC，18.4 mmol)溶于一定量的无水乙醇中，在室温下搅拌反应72 h后，加水沉淀产物，离心分离后所得沉淀经干燥后，得硬脂胺-半乳糖嫁接物。将冷冻干燥后的嫁接物样品经傅里叶红外光谱仪检测样品表面官能基团。将嫁接物溶于D2O中，浓度为20 mg/ml，用核磁共振仪进行检测并记录核磁共振氢谱，对其特征峰进行结构分析。
[0021]参见图2，结果显示，在LA、ODA和Gal-ODA的红外光谱中，LA在1730(^1及1070cm—1附近出现了 LA尖锐的羧基特征吸收峰和羟基的C-O伸缩振动峰，但在Gal-ODA的红外光谱图中LA的羧基特征吸收峰消失，但羟基的C-O伸缩振动峰却出现在了 Gal-ODA的红外光谱中。另外，ODA在3000CHT1附近的烷基(-CH2-)特征吸收峰在Gal-ODA中得以完整的保留下来。说明LA的羧基和ODA中的氨基已成功结合在了一起。
[0022]参见图3，结果显示，LA的核磁共振氢谱图上，在化学位移12.01-13.12 ppm处，出现了一个明显的单信号峰，该峰可归属于LA中的羧基峰，而在Gal-ODA的核磁共振氢谱图中可以看出，该处的单信号峰已经消失；在化学位移7.25-7.83 ppm处出现了一个不规整的宽峰信号，该峰归属于酰胺中的-NH-质子峰信号；在化学位移4.79 -5.46 ppm处，Gal-ODA的核磁共振氢谱图上出现了一个尖锐的质子峰信号，该峰与LA上的-O-CH-O-质子峰相对应。说明ODA已经成功嫁接到了 LA上。
[0023]实施例二:
1、脂质磁性纳米粒的制备及理化性质测定
以水性溶剂扩散法制备脂质磁性纳米粒。具体方法为:将一定量油溶性的Fe3O4 (粒径为5 nm，浓度为5 mg/ml)为核心的磁性纳米粒溶液超声分散于F-68溶液(Poloxamer 188，
0.1 %,w/v)中，探头持续超声30 min (600 w,工作2 s,间歇3 s)后,加入10 mg/ml的油酸乙醇溶液，探头超声5 min，以得到Fe3O4纳米粒分散液。分别取单甘脂和硬脂胺-半乳糖嫁接物，并溶于一定量的无水乙醇中，水浴70°C加热使其完全融解；在水浴70°C的超声条件下，将脂质的乙醇溶液快速注入到Fe3O4纳米粒分散液中，持续超声5 min后,最终得到肝双靶向脂质磁性纳米粒。参见图1。
[0024]取脂质磁性纳米粒溶液适量，用一定量的去离子水进行稀释，用3000 HS粒度及表面电位分析仪分别测定纳米粒的粒径、表面电位及多分散指数。
[0025]将一定浓度的脂质磁性纳米粒样品滴于覆盖有碳膜的铜网(300目)上，用滤纸吸去多余的液体后，用2 % (w/v)磷钨酸进行染色I min，干燥后透射电镜观察其形态及粒径大小。
[0026]经测定，脂质磁性纳米粒的粒径、多分散指数及表面电位见表I。
[0027]参见图4，结果显示，脂质磁性纳米粒具有较好的粒径分布，外观呈球形或椭圆形，大小近乎均匀一致，其内可见包裹的黑色Fe3O4纳米颗粒。
表1:脂质磁性纳米粒的粒径、多分散指數及表面电位_
[0028]样品__多分散指数(PI)粒径(nm) Zeta电位(mV)
脂质磁性纳米粒 I 0.24±0.0353.47士3.39 -30.68±?.Ι0
2、脂质磁性纳米粒细胞毒性研究本研究采用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT Assay)对制备的脂质磁性纳米粒的细胞毒性进行评价。取对数生长期的人正常肝细胞L02细胞，经胰酶消化后，用含10%胎牛血清的细胞培养液调整细胞密度为5 X 14个/ml，然后接种于96孔细胞培养板，每孔0.2ml, 37°C, 5% CO2细胞培养箱中孵育24 h，待细胞完全贴壁生长后，加入不同浓度的脂质磁性纳米粒溶液，以未处理的空白细胞为对照，每孔设3个平行组。继续培养48 h后，每孔加入20 μ?的MTT溶液(浓度为5.0 mg/ml),于细胞培养箱中继续孵育4 h，弃去上清液，每孔加入100 μ? 二甲基亚砜，恒温振荡20 min，用酶标仪测定570 nm处吸光度，计算细胞存活率。
[0029]参见图5，结果显示，在L02细胞培养液中各加入不同Fe3O4含量(最大浓度100 μδ/ml)的脂质磁性纳米粒并孵育48 h后，L02细胞的存活率都高于80%，结果表明本研究所制备的脂质磁性纳米粒具有低毒性，其应用将得益于对临床接受磁共振造影检查患者的安全性。
[0030]3、脂质磁性纳米粒细胞摄取
取适量的异硫氰基荧光素(FITC)溶解于10 ml的无水乙醇中，加入一定量的硬脂胺-半乳糖嫁接物，室温下避光搅拌反应24 h。然后加入100 ml的去离子水，析出物用布氏漏斗过滤，室温下自然干燥，以获得异硫氰基荧光素标记的嫁接物粉末，避光保存备用。
[0031]将一定量油溶性的Fe3O4 (粒径为5 nm，浓度为5 mg/ml)为核心的磁性纳米粒溶液超声分散于F-68溶液(Poloxamer 188,0.1 %，w/v)中,探头持续超声30 min (600 w, X作2 S，间歇3 s)后,加入10 mg/ml的油酸乙醇溶液,探头超声5 min,以得到Fe3O4纳米粒分散液。分别取单甘脂和异硫氰基荧光素标记的嫁接物，并溶于一定量的无水乙醇中，水浴70°C加热使其完全融解；在水浴70°C的超声条件下，将脂质的乙醇溶液快速注入到Fe3O4纳米粒分散液中，持续超声5 min后，最终得到硫氰基荧光素标记的脂质磁性纳米粒溶液。
[0032]以人正常肝细胞L02细胞为模型细胞，在37°C，5% CO2条件下培养细胞至呈对数生长期后，离心收集，按每孔I X 15个细胞的密度接种24孔培养板，孵箱内预培养24小时。在培养液中加入异硫氰基荧光素标记的脂质磁性纳米粒溶液孵育。培养一定时间后，用激光共聚焦显微镜观察。结果显示，脂质磁性纳米粒能快速被细胞所摄取。图6为脂质磁性纳米粒与L02细胞共孵育后的荧光显微镜照片。由图6可知，随着时间的延长，所观察到的绿色荧光强度逐渐增强，说明随着时间的延长，L02细胞对脂质磁性纳米粒的摄取逐渐增多，即脂质磁性纳米粒在L02细胞系上的摄取具有时间依赖性。
[0033]实施例三:脂质磁性纳米粒样品磁共振扫描
通过测定磁共振扫描的T2*弛豫时间的变化来衡量脂质磁性纳米粒的磁敏感性。将制备好的不同浓度(0、1、10、15、25、50、100 μδ/πι1)的脂质磁性纳米粒悬液分别装入2.0 ml的Eppendorf管内，放置在装满水的试管盒中，在GE 3.0T全身磁共振下用八通道头线圈进行扫描。
[0034]参见图7，结果显示，在ESWAN图像上随着脂质磁性纳米粒悬液中终铁浓度的增力口，T2*信号强度逐渐减低，说明本实验所制备的脂质磁性纳米粒具有负性强化效果，即在一定浓度范围之内，脂质磁性纳米粒浓度越高，其负性强化效果越明显。结果提示，本发明可作为磁共振对比剂具有应用于体内外成像的可行性。
[0035]无需进一步详细阐述，相信采用前面所公开的内容，本领域的技术人员可最大限度地应用本发明。因此，前面的实施方案应理解为仅是举例说明，而并非以任何方式限制本发明的应用范围。所以本发明的主要范围将由附属的权利要求及其等同体来确定。
【权利要求】
1.一种双重祀向固体脂质磁性纳米粒，其特征在于，该磁性纳米粒由94%F-68溶液、0.4%硬脂胺-半乳糖嫁接物、3.6%单甘脂、1%四氧化三铁及1%油酸乙醇组成。
2.权利要求1所述的一种双重靶向固体脂质磁性纳米粒的制备方法，其特征在于，通过以下步骤实现: (1)硬脂胺-半乳糖嫁接物的合成 取市售硬脂胺、乳糖酸和碳二亚胺，溶于无水乙醇中，在室温下搅拌反应72 h后，加水沉淀产物，离心分离后所得沉淀经干燥后，得硬脂胺-半乳糖嫁接物，其结构通过红外光谱和氢谱核磁共振进行确证； (2)肝双重靶向脂质磁性纳米粒的制备 将油溶性的粒径为5 nm，浓度为5 mg/ml的Fe3O4为核心的磁性纳米粒溶液超声分散于F-68溶液中，探头持续超声30 min,加入10 mg/ml的油酸乙醇溶液,探头超声5 min,以得到Fe3O4纳米粒分散液，分别取单甘脂和硬脂胺-半乳糖嫁接物，并溶于无水乙醇中，水浴70°C加热使其完全融解，在水浴70°C的超声条件下，将脂质的乙醇溶液快速注入到Fe3O4纳米粒分散液中，持续超声5 min后,最终得到肝双祀向脂质磁性纳米粒。
3.权利要求1所述的固体脂质磁性纳米粒在制备对肝脏具有双重靶向功能的磁共振对比剂中的应用。
【文档编号】A61K49/18GK104174038SQ201410353518
【公开日】2014年12月3日 申请日期:2014年7月24日 优先权日:2014年7月24日
【发明者】余日胜, 朱修良, 杜永忠, 揭丽勇, 陈英, 施丹, 王颖 申请人:浙江大学