专利名称：生产具有高脂质含量的藻生物质的方法
生产具有高脂质含量的藻生物质的方法本发明涉及一种生产具有高脂质含量的藻生物质的方法。更具体地说，本发明涉及一种基于培养系统如开放池与合适地结合有生物质加厚 系统的光反应器的组合，生产具有高脂质含量的藻生物质的方法。微藻目前培养用于生产高价值分子如多不饱和脂肪酸、维生素和胶凝剂，它们被 引入到营养、药物和美容市场。藻生物质的最佳产品使用各种类型的培养系统，其在很大程度上取决于藻菌株和 气候条件。在极其有利的温度和光条件下，如在以色列和加利福尼亚，例如，可以成功地使 用开放池。相反地，在德国，使用安装在温室的管式反应器。在葡萄牙，开放池与光反应器 都使用。当培养具有嗜极端生物特性的藻种类如Dulaniella salina时，其能够生长在盐 浓度为10-15%的环境中，并因此抵抗许多外界形式的污染，也优选使用开放系统如开放 池。这对于能生长于淡水中的种类(为了避免污染问题，其可以在密闭的系统如光反应器 中培养)是不会发生的。用于营养，药物和美容领域的藻的培养，特征在于相当有限的高价值产品生产能 力。为此，可以忍受相对昂贵的生产系统，如光反应器，但是用于生产在较低价值的商业领 域中使用的微藻的最广泛使用的方法，如水培生产，是基于经济的培养系统，如开放池。从其中微藻被传统使用的上述领域到环境/能源领域，需要开发这样的技术，以 便导致生产能力的巨大增加(以每年数百/数千吨到每年数百万吨的数量级)和生产成本 的巨大降低(从几百美元/公斤到几百美元/吨)。可以通过旨在优化对生物学活性的辐射的吸收的巨大改善和对光抑制现象 (photo-inhibition phenomena)的降低以强烈增加叶绿素光合作用过程的效率的方式，来 实现培养系统的生产率目标。许多研究活动正在进行中，其目的在于优化不同培养系统的生物质生产率和增加 它的脂质含量。微藻的生产目前处于试验阶段，其目标是再循环工业设备释放的CO2和生产生物 质，该生物质可以开发用于能源的目的，如例如，用于转变成生物柴油的植物油。开发光反应器的努力仿佛不是解决性的，因为对宣称的生产率增加存 在许多怀疑，另一方面，似乎不足以获得必要的成本降低。(Rif.专利申请WO 03/094598〃 Photobioreactor and Process for Biomass Production and Mitigation of Pollutants in Flue Gases. Company Green Fuel Technology“)。此外，在涉及由藻生物质生产油类和它们的酯交换的总过程的文献中没有证据， 除了描述于2006年11月12-17日的AICHE年会中的“微藻油提取和原位酯交换”(Justin Μ· Ferrentino 禾口 Ihab H. Farag. Chemical Engineering，University of New Hampshire， Kingsbury Hall，33 College Road， Durham， NH 03824，在 New Hampshire University 进 行)的那些，其试图避免借助于通常用于提取油类的有机溶剂，开发细胞壁破坏方法和随 后的离心或原位酯交换。
目前发现了一种基于培养系统如开放池与合适地结合生物质增稠系统的光反应 器的组合的微藻的培养系统，其能保证高生产率，提供具有高脂质含量的生物质，防止微生 物污染，保持随时间持续和稳定的生产。特别地，本发明的一个目标涉及一种生产具有高脂质含量的藻生物质的方法，其 包括，根据
图1中显示的方案(a)在光反应器中生产接种物以进行(b)阶段；(b)在用(a)阶段接种的开放池中大量培养藻生物质；(c)温和地进行藻生物质的增稠阶段；(d)脂质生产的诱导阶段，其中使用包括光反应器或开放池的组件；(e)具有高脂质含量的生物质的分离阶段。通过根据本发明的方法进行操作，以下是可能的i)培养具有高净化度的物种，适于控制可能的外界污染(排空培养池并再接种相 同物种)；ii)培养微藻，限制光反应器的利用以单独生产纯物种的接种物，其具有随之发生 的成本降低；iii)最小化达到通过诱导阶段(C)生产脂质的诱导条件所必需的处理体积；通过 联合使用光反应器与开放池的各种组件使该处理过程持续。iv)通过组合使用各种光反应器和开放池组件使该过程连续。用于生产接种物的(a)阶段可以在具有各种形式和尺寸的光反应器中进行具有 圆柱形或椭圆形的线性管式反应器，平行六面体或圆柱形平面反应器，如描述于"Tredici M. R. (2004)Mass production of microalgae :photobioreactors. In Richmond A(ed.) Handbook of Microalgal Culture. Blackwell Publishing, Oxford (UK)，178-214 页"中 的那些。后者是优选的，因为它们是通过塑料膜制成的并由简单的外部金属结构支撑的，因 此它们是便宜的。它们一般以约为1-2天的蓄水时间(hydraulic retention time)运行， 并导致大约2g干物质/升的生物质浓度。(a)阶段的培养系统与(b)阶段的培养系统的处 理体积之间的比例取决于当地的气候条件和培养的藻菌株。该比例通常在0. 05-0. 15的范 围内，优选等于0.1。获得的培养物液体用于接种在不连续基础上的培养系统(每天或每天多次)。可替代地，其可以在连续基础上使用以增加(b)阶段的开放池中藻生物质的浓 度，并因此防止发生外界污染现象。用必要的养份(必须的氮和磷盐)重建的来自(C)阶 段的水性再循环物料，用作为生长剂。水性补充液流可由待进行三级处理的工业废水。在 这种情况下，藻培养代谢包含含于其中的氮和磷的物质，从而有助于它们的纯化。由于CO2 是藻生长所必需的，因此可以使用工业废气(热电、产氢设备，等等)中含有的C02。用于藻生长的(b)阶段可发生在开放池中，开放池可以是圆形的和纵向的。优选 具有纵向形式的典型管道池。并且在这种情况下，蓄水时间是1-2天。它们的运行可以是 半连续的，早上对培养物液体进行取样并进料生长剂(水和养份)，或以具有夜间中断的连 续方式。后面的选择，合适地与由藻生长指示计(光密度、叶绿素以及它们之间的可能比例 的测定)调控的培养系统的液位高度控制系统结合是优选的。在污染现象发生的情况中，可以定期净化用于进行(a)阶段和(b)阶段的系统(水洗涤或用消毒剂的水溶液进行洗涤)。增稠生物质的(C)阶段大大减少了处理体积(至少10倍)，使得光反应器的使用 有利或者急剧降低了池体积。通过在一般用于水处理厂的沉淀设备中的重力分离，来进行该阶段。已经发现利 用阳离子聚电解质(也即聚丙烯酰胺)，以2-5ppm的量(大约1. 5小时通过0. 4-0. 5g/升 到40-50g/升的藻浓度)，大大促进了淡水藻菌株如例如栅藻属种(Scenedesmus sp.)的沉淀。以获得导致生物质的脂质级分含量增加的培养条件的目标进行用于细胞成熟的 (d)阶段。在这方面，生长培养基将保持有限的氮，因此如果需要，来自(C)阶段的液流将主 要结合磷源和可能的微量元素养份。可用于该阶段的培养系统可包括开放池和光反应器。 来自(c)阶段的液流中生物质浓度的形成，取决于选择的熟化系统(以开放池为克/升，光 反应器为数十克/升的数量级)。利用那些与(C)阶段中采取的系统类似的系统，来进行(e)阶段。在被排放或者 再循环之前，净化之后，可以使分离的水相直接送至终处理，以避免在整个系统中代谢产物 的积累。当藻培养不仅仅用于生产生物质，而且用于废水净化(三级处理)时，采用第一个 选择。相反地，当废水不可利用，而且需要限制对水的需求时，使用第二个选择。净化流通 常为通过分离产生的总水流的1到20%，优选等于10%。实施例1“利用每天的稀释物进行半连续的培养”单藻物种异养小球藻(Chlorellasorokiniana)使用收集菌株异养小球藻，其一般生长在淡水中。如下制备待引入到以下描述的培养系统中的接种物-将之前于_85°C保藏在10%的甘油溶液中的单藻培养物样品置于室温下解冻， 然后离心以除去上清液。-将这样获得的细胞糊接种到3个含有50ml溶液的250ml烧瓶中，所述溶液含有养份。-使培养物生长于30°C恒温的在空气中存在0.5%的CO2的照明气候室中。-大约一周以后，烧瓶达到0.2g/升的浓度，并且将该培养物用作接种物用于3个 含有500ml溶液的1升烧瓶中，所述溶液中含有养份，并置于人工气候室中。-2天以后，培养物具有0. 4g/升的浓度，并形成用于实验室实验的5升Roux瓶的 接种物，用于制备随后的实验所必需的接种物。使用12个Roux瓶制备了总共60升的接种物(用于随后的试验，接种物相应地减 少到反应器的体积)，所述Roux瓶通过17，500Lux的钨丝灯照明。从圆柱体提供生长所必 需的CO2，并以每个Roux瓶25升/小时的平均流量进料。随时测定每个Roux瓶的pH，当 由于中和观察到士0. 2单位的变化时，人工修改CO2的流量。培养基使用以下牛长培养基对所有的培养系统(烧瓶，roux瓶，光反应器，开放 池)进行试验KNO31. 75g/ 升
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FeSO4 · 7H20MgSO4 · 7H20KH2PO4K2HPO4CaCl2
1. 25g/ 升 0. Ig/ 升 O.Olg/升 0.003g/ 升 1. 5g/ 升微量元素1ml/升的下列溶液每升H3BO3 2. 86g,MnCl2 ·4Η20 1. 8lg, CuSO4 ·5Η20 80mg, ZnSO4 7H20220mg, Na2MoO4 2IOmg，FeSO4 · 7H20 25g, EDTA 33. 5g 和 1 滴浓缩的 H2SO4。工作pH:7. 0。通过修改文献中描述的典型培养基M4N获得上述组成，用于微藻的培养。具体而 言，降低KNO3含量(从5. 0到1. 75g/升，在典型组成中，规定大幅过量的氮化化合物，从而 避免每天添加)，以0. Ig/升的量添加K2HPO4,并降低MgSO4 · 7H20的含量(从2. 5到1. 5g/ 升)。实验系统使用包括开放池和户外安装的光反应器的台架型系统对微藻异养小球藻进行试 验。该设备包括4个培养单元3个375升开放池，其具有2. 5m2的照明表面，和1个 39升的光反应器，其具有0. 98m2的照明表面。开放池，其遵循那些形成大规模系统的设计 (浆轮混合的管道池)，安装有1个浆轮以保持微藻培养物处于恒定的振荡下(30cm/s的速 率)，而且具有纵裂以便通过桨的运动产生连续和循环流动。光反应器由一组10个管组成，每个的直径为45mm和长度为2m。在这种情况下，通 过气体(CO2和空气，可相互替代地)来保证培养物的搅拌，气体被传送到管的内部，而且该 管安装有冷却系统以防止温度高于32°c。开放池没有安装温度控制系统。每个单元都安装 有用于监控温度、PH和溶氧浓度的传感器。碳源包括气态的CO2，其直接被传送到反应器的内部，并通过pH测定进行调节。图2显示了如上所述的台架设备的图解，在该图解中，表明使用的CO2的来源包括 来自锅炉的耗尽的气体，所述锅炉由甲烷供给系统进料。下面说明了用如上所述的实验构造进行的实验。用如前面叙述的在实验室roux瓶中进行的微藻培养物以光反应器和开放池的体 积的5%的量接种光反应器F-I和3个开放池？-1、？-2、？-3。在开放池后3天接种光反应器。 培养大约一周以后，达到平台期状况，池中的生物质浓度为0. 3-0. 5g/升，光反应器中的生 物质浓度为l_2g/升。然后这些系统以下列稀释度不连续地运行池P-130%，池P-245%， 池P-360%，和光反应器F-130%。一早(从7到8)对培养物液体进行取样，并以实现要求 的稀释度所需的量的补料生长培养基。试验期间，每天监控培养物有的干重，以及太阳辐射、温度、溶氧浓度和pH。图3显示了开放池和光反应器中藻生物质的浓度趋势。可以观察到，如文献中公 知的，密闭系统(光反应器)中培养物的浓度值高于开放系统的培养物的浓度值。图4显示了通过下面的关系式计算的不同生长系统的各自面积生产率值(CxV) /S/T
其中C=生物质浓度g/升V =每天采集的培养物体积(升)S =培养系统的表面积(底部印迹，m2)T=时间(1 天)在半连续培养中，在实验的第1、3和6天，分析从开放池和光反应器采集的藻生物 质的样品，以确定脂质、蛋白质、碳水化合物、类胡萝卜素和叶绿素的含量。表1中显示了使 用的方法和获得的结果。可以观察到分析的所述物质的含量证明是相对稳定的，尤其是就涉及的脂质含量而言。如在前面的附图中可以注意到的，在一段时间期间内，这种实验构造的开放池证 实具有较差的稳定性。实验的大约10天以后，事实上，藻细胞遭受细菌和原生动物为代表 的突然污染，而且在大约2天以后，结果藻增殖几乎完全消失。相反地，光反应器显示随时 间恒定的生产率。图5和6显示了污染前后，培养物的显微镜图片。图6中，可以观察到几种原生动 物的存在，其在培养基中增殖。这可能主要归因于培养系统的类型，由于广泛暴露于外界环 境，该培养系统使藻细胞很容易暴露于以其他的活物种为代表的集群，该其他的活集群与 正被培养的藻细胞竞争生长。应当注意到，通过相对较低的藻浓度，这些现象可以是有利 的，其中藻易于随时间生产。实施例2“具有夜间中断的连续培养”为了试图解决在前述试验中观察到的池污染问题，采用了一种培养方法，其基于 用来自光反应器的单培养物中的生物质和池本身的恒定稀释度对池进行连续接种。这将有 利于藻生物质的增殖并减少污染物种。图7中显示了该方法的图解。基于前面的试验，使用等于30%的稀释度，其提供了生物质的最高浓度，而且生产 率保持与用最高稀释度观察到的生产率基本上类似。试验了单独的光反应器F-I和与池P-I的串联。产生用于这两个生长单元的接种物的方法为实施例1中描述的方法。光反应器用培养基，以1. 0升/小时的流速，1天连续进料12小时。离开光反应器 的液流被送到池P-1。池P-I也以8.4升/小时的流速进料培养基。从而证实该系统出口 处的流速等于9. 4升/小时。这样，稀释率保持与试验1中使用的稀释率相等，大约30%的 稀释度(9. 4升/小时*12小时/天375升=0. 30)。类似地，证实光反应器的稀释率等于30% (1.0升/小时*12小时/天40升= 0. 30)。记住池每天进料12小时，总的蓄水时间证实等于3. 3天(375升112. 8升/天= 3. 3天)，与光反应器类似(40升12升/天=3. 3天)。证实系统在这些条件下是稳定的，而且没有观察到在前面的试验期间发现的污染 现象。在大约30天以后考虑终止该实验。
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图8和9显示了所述两种培养系统中发现的生物质浓度和面积生产率趋势。对图3与图8进行比较显示，光反应器中的生物质浓度证实与实施例1中观察到 的生物质浓度一致(大约2克/升)，但是证实池的生物质浓度更高(大约0. 7到0. 5克/ 升)。池中浓度的增加可能是由于连续进料到光反应器的藻生物质的影响(大约2克/小 时)。在规定情况下，因此离开开放池的生物质流速等于大约6. 6克生物质/小时。而且在这种情况下，实验期间，连续每3天从开放池和光反应器对藻生物质取样。 表2中指出了脂质、蛋白质、碳水化合物、类胡萝卜素和叶绿素的分析值。可以观察到细胞组成与实施例1的试验中描述的非常类似。实施例3“利用最终的熟化开放池进行连续培养”为了增加脂质含量，使生物质进行缺氮胁迫。为了该目的，通过在前面的试验中 描述的系统下游，增加一个另外的池(P-IM)，其称为熟化池，产生一种新的实验构造。它具 有112. 8升的有效容积(尺寸0. 75平方米，15. Ocm培养物高度)，也是连续排列的。进入 和离开熟化池的液流等于9. 4升/小时。选择它的有效容积以便获得等于1天的蓄水时间 (相对于其他两个反应器的3. 3天)。通过除去进料培养基和CO2的影响氮限制的胁迫状况。图10中显示了用于该试验的设备图解。为了防止熟化池进料来自过量KNO3的氮，该过量KNO3被进料到池P_1 (传统生长 系统中一般采用的条件)，尽管没有施用培养基，但是降低进入上述池的培养基中的KNO3浓 度(1. 75克/升到0. 45克/升)以提供对于微藻生长严格所需的量。离开该池的液流中的氮浓度，该液流被进料到熟化池，因此是极其低的，其值为
0. 006克/升左右。应当注意，要达到该结果，没有必要改变待进料到光反应器F-I的培养基中KNO3 的浓度(又是1. 75克/升)，从而保留它的生长条件不变。在这些实验条件下，熟化池的生产率几乎为零，但是干重值保持与池P-I的干重 值非常类似，图11显示了池P-I与P-IM的干重值，而图12表明了由光反应器、生长池P-I 和熟化池P-IM组成的整个系统的藻生物质的日面积生产率。对细胞组成的值进行观察，很明显在成熟期期间，细胞通过产生更多的脂质对胁 迫状态作出反应以应对主要是蛋白质的损失(表3)。为了每表面积单位脂质生产率的目的，如下面的计算中所示的，细胞中脂质百分 数的增加大大补偿了整个系统的生物质的较低面积生产率，其证实了采用的解决方案的效 力。实施例2 (产生的脂质)22.56g生物质/m2/天(总的面积生产率)x 0. 16 (生物质中的脂质％ ) = 3. 6g 脂质/m2/天(脂质的日面积生产率)。实施例3 (产生的脂质)17g生物质/m2/天(总的面积生产率)x 0.37(生物质中的脂质％ ) = 6. 29g脂 质/m2/天(脂质的日面积生产率)。可以观察到，记录到脂质产量的增加大于40%。
表 1实施例1的试验期间产生的藻生物质的分析。 表2实施例2的试验期间产生的藻生物质的分析。 表3实施例3的试验期间产生的藻生物质的分析。
权利要求
一种生产具有高脂质含量的藻生物质的方法，其包括(a)在光反应器中生产接种物以进行(b)阶段；(b)在用(a)阶段接种的开放池中大量培养藻生物质；(c)温和地进行藻生物质的增稠阶段；(d)脂质生产的诱导阶段，其中使用包括光反应器或开放池的组件；(e)具有高脂质含量的生物质的分离阶段。
2.权利要求1的方法，其中在平面光反应器中进行用于制备接种物的(a)阶段，该光反 应器由简单的外部金属结构支撑，并具有通过塑料膜方式制成的圆柱状形状。
3.权利要求1的方法，其中(a)阶段期间制备的接种物用于在不连续基础上或连续的 基础上接种开放池。
4.权利要求1的方法，其中来自(c)阶段的再循环的水性培养基用必要的养份进行重 建，并用作(a)阶段和(b)阶段的生长剂。
5.权利要求4的方法，其中来自(c)阶段的再循环水性培养基用由待进行三级处理的 工业废水构成的水流重建。
6.权利要求1的方法，其中所述藻培养所必需的CO2由工业废气提供。
7.权利要求1的方法，其中用于培养藻生物质的(b)阶段发生在开放池中，该开放池 具有“浆轮_混合的水道池”型的纵向形状，其装有浆轮以保持微藻培养物处于恒定的振荡 下。
8.权利要求1的方法，其中所述开放池以早上对培养物液体进行取样并进料生长剂的 半连续形式运行，或者以具有夜间中断的连续形式运行。
9.权利要求1的方法，其中藻生物质的增稠阶段(c)通过通常在水处理厂使用的沉淀 池中的重力分离方法进行。
10.权利要求9的方法，其中使用阳离子聚电解质获得生物质的增稠。
11.权利要求1的方法，其中脂质产量的诱导阶段发生在保持氮限制的生长培养基中。
全文摘要
本发明涉及一种用于生产具有高脂质含量的藻生物质的方法，包括(a)在光反应器中生产接种物以进行(b)阶段；(b)在用(a)阶段接种的开放池中大量培养藻生物质；(c)温和地进行藻生物质的增稠阶段；(d)脂质生产的诱导阶段，其中使用包括光反应器或开放池的组件；(e)具有高脂质含量的生物质的分离阶段。
文档编号C12N1/12GK101918534SQ200880124455
公开日2010年12月15日 申请日期2008年12月3日 优先权日2007年12月14日
发明者E·N·达达里奥, E·费奥拉万迪, F·卡普阿诺, F·德菲拉, G·里斯波利, R·比尼亚齐 申请人:艾尼股份公司