专利名称：一种用于靶向药物载体的核酸适体的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种用于靶向药物载体的核酸适体。
背景技术：
癌症是一类引起人类死亡的主要疾病，每年全球因癌症死亡人数大约为700万。随着细胞生物学的发展以及对癌症发病机制的了解，癌症的化学药物治疗得到了很好的发展。目前大约有90多种化学药物发展用于杀死肿瘤细胞和癌症治疗。但是这些药物缺乏靶向特异性，在临床上通常给患者带来致命的副作用。同时，小分子核酸药物在体外抗肿瘤实验中都取得了比较好的结果，但是一旦应用于体内，就会被人体内的酶所分解；而体外对小分子核酸药物进行修饰后，虽然可以抵御酶的切割，但是又改变了作用机理。因此需要发展既能靶向携带药物攻击肿瘤细胞，又能抵御核酸酶降解的靶向载体。
核酸适体是通过指数富集的配体系统进化法从DNA/RNA文库中筛选出来的单链寡核酸分子(ssDNA或ssRNA)。它通过分子内碱基堆积、疏水、氢键和静电等作用力折叠成独特的空间结构，从而高特异性和高亲和力识别其靶标分子。核酸适体与靶标分子结合的特异性和亲和力与抗体相似，甚至更强。核酸适体具有较低的分子量、无免疫原性、快速的组织通透性和良好的代谢动力学。核酸适体一旦证实，就可以通过自动化的固相合成的方法制备，从而保证了不同批次之间产品不会存在差异。核酸适体化学性质稳定和容易通过化学修饰赋予其其它功能。更重要的是，与抗体相比，核酸适体的靶标范围更广。一些与疾病紧密相关的生长因子、酶、受体以及肿瘤标志物等物质都能成为核酸适体的靶标。目前针对血管表皮生长因子受体的核酸适体作为治疗老年湿性黄斑疾病药物已经被FDA批准上市；同时还有八种核酸适体药物处于不同临床考察阶段。因此针对与疾病相关分子的核酸适体作为一种潜在的靶向载体携带药物吸引着研究者的注意。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种核酸适体。本发明提供的核酸适体，其为序列表中序列I所示的单链DNA分子。上述的核酸适体作为药物载体的应用也是本发明保护的范围。本发明的另一个目的是提供一种药物载体。本发明提供的药物载体，其活性成分为上述的核酸适体。上述应用或药物载体中，所述药物为如下I)或2):I)预防和/或治疗肿瘤的药物；所述肿瘤具体为肺腺癌；2)杀伤和/或抑制肿瘤细胞的药物；所述肿瘤细胞具体为肺腺癌细胞；所述肺腺癌细胞进一步具体为A549细胞系。本发明的第三个目的是提供一种产品。本发明提供的产品，为由上述的核酸适体和靶药物连接得到的产物；所述产品为如下I)或2):I)预防和/或治疗肿瘤的产品；2)杀伤和/或抑制肿瘤细胞的产品。上述产品中，所述靶药物为C70三加成丙二酸二乙酸(TF70);该化合物通过如下方法合成I)向IOmg C70中加入25ml甲苯溶液,搅拌分散均勻,得到C7tl甲苯溶液；向恒压漏斗中加入21ml甲苯溶液；2)向C7tl甲苯溶液中通入氮气十分钟，再向C7tl甲苯溶液中加入8. 1μ I溴代丙二酸二乙酯；向恒压漏斗中的甲苯溶液中加入7. 1μ I DBU溶液，轻摇漏斗，使分散均匀，得到含DBU的甲苯溶液(溴代丙二酸二乙酯DBU=1:1，DBU :C7(I=6:1，物质的摩尔比)；
3)继续通入氮气十分钟，打开恒压漏斗，开始滴加含DBU的甲苯溶液，控制溶液一小时内加完，继续反应两小时，停止反应，以一次性滤器过滤，收集清液于50ml单口瓶中，放置过夜后过高效液相色谱柱，流动相为甲苯，流速为6ml/min。先进样2ml，观察保留时间为40分钟的峰形，确定需要收取的的样品组分以及每次的进样间隔；4)收集纯化后的C7tl衍生物，取样进行质谱检测。其余部分旋转蒸发去除样品中的甲苯，加入40ml乙醇。超声分散贴在瓶壁的C7tl衍生物，搅拌使C7tl衍生物尽量分散在乙醇溶液中。以氢氧化钠的乙醇溶液(20mg NaOH, Iml H20,9ml乙醇)水解C7tl衍生物得到相应的富勒酸衍生物，以O. 2μπι滤器过滤，将溶液收集于无菌容器中封口备用，4°C保存备用，得到TF70。上述产品中，上述的核酸适体和上述C70三加成丙二酸二乙酸通过酰胺键连接。上述产品为药物，其中，所述肿瘤为肺腺癌；所述肿瘤细胞为肺腺癌细胞；所述肺腺癌细胞具体为A549细胞系。上述的核酸适体在制备预防和/或治疗肿瘤的产品中的应用也是本发明保护的范围。上述的核酸适体在制备杀伤和/或抑制肿瘤细胞的产品中的应用也是本发明保护的范围。上述应用中，所述肿瘤为肺腺癌；所述肿瘤细胞为肺腺癌细胞；所述肺腺癌细胞具体为A549细胞系，上述产品为药物。本发明的实验证明，本发明提供了一条核酸适体R13，它是从人肺癌细胞A549细胞中利用细胞筛选法得到的一段单链DNA分子。它对A549细胞具有很高的亲和力，而且，还可以进入A549细胞。在体外实验中，R13作为药物载体携带光治疗剂TF70，大大提高TF70对A549的杀伤作用，靶向性强。
图I为共聚焦检测核酸适体R13特异性表征图2为流式细胞术法对R13与A549细胞的结合特异性表征图3为TF70-R13 (酰胺键连接产物)连接示意4为药物杀伤细胞的细胞存活率结果
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中部分实验材料和试剂如下肺腺癌A549细胞系购自ATCC，编号为CCL-185 ；肺腺癌A549细胞稳定转染EGFR-GFP (来自重组质粒pEGFP_EGFR，由中科院广州生物医药与健康研究院提供。质粒PEGFP购自英骏公司Invitrogen)，命名为EGFR-A549细胞；用于培养肺腺癌A549的细胞培养液为DMEM+10%胎牛血清。
PBS缓冲液pH为7. 4，由水和溶质组成；溶质及其浓度为39mM NaH2PO4,
6ImMNa2HPO4,150mM NaCl ；结合缓冲液pH为7. 4，由PBS缓冲液和溶质组成；溶质及其浓度为lmM MgCl2,O. 05%BSA，0. 2mg/ml 酵母转移 RNA (Invitrogen 公司及产品目录号 15401-011)；洗涤缓冲液pH为7. 4，由PBS和溶质组成；溶质及其浓度为ImM MgCl2 ；FBS :胎牛血清，购自GIBCO (美国)；实施例I、核酸适体R13的获得一、核酸适体R13的获得I、核酸适体R13的筛选I), DNA文库的预处理5nmol DNA 文库(5，-ACG CTC GGA TGC CAC TAC AG(40N) CTC ATG GAC GTG CTGGTG AC-3’ )溶解后，经94°C加热和冰上冷却处理，置于37°C待用。2)、反向筛选取3 X IO5个A549细胞，加入已预处理的DNA文库，加入FBS,于37°C摇床中(转速IOOrpm)孵育I小时，吸取上清。3)、正向筛选取3X 105EGFR-A549细胞珠，加入反筛后的溶液，于37°C摇床中(转速IOOrpm)孵育I小时。吸弃上清液；用PBS洗涤细胞2次，再用细胞刮把细胞刮下来，离心洗涤3次(转速lOOOrpm)，每次5分钟。将EGFR-A549细胞中加入500ulPBS，95°C加热洗脱DNA后，告诉离心(12000rpm)收集上清液用于PCR扩增的模板。2、筛选优化为了获得高亲和性和特异性的核酸适体，在筛选的过程中逐步改变筛选时间、正筛洗涤次数增加筛选压力；同时用共聚焦荧光显微镜对每轮的筛选结果进行了初步考察。3、PCR 及 ssDNA 分离PCR 反应体系组成10 μ L 10XPCR 缓冲溶液(IOOmM Tri s_HCl，pH 8. 3 ；15mMMgC12)、3μ L ImM dNTPs, 3 μ L25 μ M FITC标记的上游引物(5’_ACG CTC GGA TGC CACTAC AG-3’)和生物素标记的下游引物(5，-GTC ACCAGC ACG TCC ATG AG_3，)、0. 25 μ LTaq热启动聚合酶，5-15 μ L筛选产物、和69-79 μ L灭菌蒸馏水。热循环条件94°C变性30s，60°C退火30s，72°C延伸30s。在扩增之前用琼脂凝胶电泳考察不同循环扩增产物，选取适当的循环次数。
4、ssDNA 分离利用亲和素包被的葡聚糖微珠亲和吸附，O. 2M的氢氧化钠分离双链，使FITC标记的ssDNA与生物素标记的ssDNA分离。再将FITC标记的ssDNA过NAP-5柱子进行脱盐，并收集O. 5-1. 5mL之间的滤液。用UV-vis光谱测定收集溶液中的DNA浓度。DNA经冻存低温干燥后于_20°C保存或用于下轮筛选。5、克隆测序经过23轮筛选后，观察随实验的即时表征，当荧光强度不再增强时，取最后一次筛选产物为模板和无标记的上下游引物按照上述PCR反应条件和步骤进行PCR扩增，将获得的无标记DNA双链产物按照pMDlS-T Vector试剂盒手册操作，然后随机测序。6、序列分析通过分析ssDNA的一级结构，然后根据随机序列中是否存在共同保守序列将所得 序列进行分类。结果通过克隆，选取160个样本进行测序，并按照DNA —级结构进行分类，得到高度富集的适体序列，其中一条序列对A549细胞具有高度的特异性并且能进入A549细胞。经过序列优化，最终的序列裁减为5 ‘-TTTATGGGTGGGTGGGGGGTTTTT-3’(序列I);序列保护时，与其相似度为75%-90%的序列都为类似序列，该序列所示单链DAN分子即为核酸适体R13。上述核酸适体R13可以人工合成序列I。上述核酸适体R13可分别用Cy3和Cy5标记(Cy3和Cy5均标记核酸适体R13的5’端)，得到Cy3标记核酸适体R13和Cy5标记核酸适体R13。二、核酸适体R13特异性表征I、共聚焦检测R13特异性将Cy3标记核酸适体R13加入肺腺癌A549细胞培养液(将A549细胞在DMEM+10%胎牛血清中培养得到)，使Cy3标记核酸适体R13在总体系中的终浓度为2uM ;共同孵育18小时(37度，5% 二氧化碳)。共孵育后做共聚焦检测(559nm激发)，激光器型号FV1000-IX81, Olympus, Japan)，收集显微镜型号NA O. 40，UPLASPO, Olympus，结果如图 I所示，可以看出，发现核酸适体R13可以进入A549细胞，甚至可以进入细胞核内。2、流式细胞术法检测R13与A549细胞的结合特异性取肺腺癌A549细胞10万左右，用O. 02%EDTA消化，PBS洗涤二次；收集细胞，分别加入200nM的Cy5标记核酸适体Rl3和200nM Cy5标记的对照DNA序列(5，-AATTTTTTAATTATTTATATTA-3’，Cy5 标记在对照 DNA 序列的 5’ 端)，37 度孵育 40 分钟；PBS洗涤一次，用流式细胞仪检测核酸适体R13与A549细胞的结合情况。以A549细胞不加入任何DNA片段为对照(A549细胞)。结果如图2所示，I为A549细胞，2为A549细胞与Cy5标记的对照序列的结合，3为A549细胞与Cy5标记的R13的结合，可以看出，与对照序列相比，R13与A549细胞具有很高的亲合力。从上述实验可以看出，核酸适体R13可进入A549细胞且与其特异结合。实施例2、核酸适体R13作为靶向药物载体的应用一、TF70-R13 (酰胺键连接产物)的制备
1、TF70 的制备TF70为一种光治疗剂，为C7tl三加成丙二酸二乙酸，其合成步骤如下I)向IOmg C70中加入25ml甲苯溶液,搅拌分散均勻,得到C7tl甲苯溶液；向恒压漏斗中加入21ml甲苯溶液；2)向C7tl甲苯溶液中通入氮气十分钟,再向C7tl甲苯溶液中加入8. I μ I溴代丙二酸二乙酯；向恒压漏斗中的甲苯溶液中加入7. 1μ I DBU (1,8-二氮杂二环[5. 4. O]十一碳-7-烯)溶液，轻摇漏斗，使分散均匀，得到含DBU的甲苯溶液(溴代丙二酸二乙酯DBU=I: I, DBU :C7Q=6:1，物质的摩尔比)；3)继续通入氮气十分钟，打开恒压漏斗，开始滴加含DBU的甲苯溶液，控制溶液一小时内加完，继续反应两小时，停止反应，以一次性滤器过滤，收集清液于50ml单口瓶中，放置过夜后过高效液相色谱柱，流动相为甲苯，流速为6ml/min。先进样2ml，观察保留时间 为40分钟的峰形，确定需要收取的的样品组分以及每次的进样间隔；4)收集纯化后的C7tl衍生物，取样进行质谱检测。其余部分旋转蒸发去除样品中的甲苯，加入40ml乙醇。超声分散贴在瓶壁的C7tl衍生物，搅拌使C7tl衍生物尽量分散在乙醇溶液中。以氢氧化钠的乙醇溶液(20mg NaOH, Iml H20,9ml乙醇)水解C7tl衍生物得到相应的富勒酸衍生物，以O. 2μπι滤器过滤，将溶液收集于无菌容器中封口备用，4°C保存备用，得到TF70。2、TF70_R13 (酰胺键连接产物)的制备将上述I得到的TF70与由实施例I得到的核酸适体Rl3酰胺键连接得到TF70-R13 ;连接示意图如图3所示,具体过程如下所示将O. Iml上述I得到的TF70 (O. 5mg/ml)与2. Oml纯水混合，超声分散十分钟，加入O. 5ml MES缓冲液(pH 5. 8，O. 5M)，备用，得到TF70溶液；再将新鲜制备的EDC水溶液(7mg/ml)和Sulfo-NHS水溶液(13mg/ml)加入TF70溶液中，室温(25°C )下搅拌活化30分钟后加入50D由实施例I得到的核酸适体R13，继续反应3. O小时后对产物进行超滤和透析(超滤管分子量10KD，透析袋MW cut off 3500)以除去多余的反应物，得到TF70-R13。二、R13作为靶向药物载体的靶向性功能验证将A549细胞分为如下三组处理对照组(control):将IO6的A549细胞在细胞培养液中培养(37度，5% 二氧化碳)3小时；TF70组将IO6的A549细胞在含有IOuM TF70的细胞培养液中培养(37度，5% 二氧化碳)3小时；TF70-R13组将IO6的A549细胞在含有IOuM TF70-R13的细胞培养液中培养(37度，5% 二氧化碳)3小时；然后将上述3组细胞均用强度为20mW/cm2的光照，照射时间为5分钟、15分钟、30分钟；照射30分钟后用细胞计数板进行计数各组细胞数量，利用CCK-8方法通过450nm波长下的吸收值来反应细胞存活率，实验重复三次，结果取平均值。结果如图4所示，可以看出对照组(control)的细胞存活率为100% ；
TF70组的细胞存活率为85% ；TF70-R13组的细胞存活率为8% ；从上述结果可以看出，与单独加入TF70相比，加入TF70-R13后光照培养，A549细胞大量死亡；说明核酸适体R13作为靶向性药物载体，大大提高了 TF70 对A549细胞的杀伤作用。
权利要求
1.一种核酸适体，其为序列表中序列I所示的单链DNA分子。
2.权利要求I所述的核酸适体作为药物载体的应用。
3.—种药物载体，其活性成分为权利要求I所述的核酸适体。
4.根据权利要求2所述的应用或权利要求3所述的药物载体，其特征在于 所述药物为如下I)或2): O预防和/或治疗肿瘤的药物；所述肿瘤具体为肺腺癌； 2)杀伤和/或抑制肿瘤细胞的药物；所述肿瘤细胞具体为肺腺癌细胞；所述肺腺癌细胞进一步具体为A549细胞系。
5.一种产品，为将权利要求I所述的核酸适体和靶药物连接得到的产物；所述产品为如下I)或2): 1)预防和/或治疗肿瘤的产品； 2)杀伤和/或抑制肿瘤细胞的产品。
6.根据权利要求5所述的产品，其特征在于所述靶药物为C70三加成丙二酸二乙酸； 权利要求I所述的核酸适体和所述C70三加成丙二酸二乙酸通过酰胺键连接。
7.根据权利要求5或6所述的产品，其特征在于所述产品为药物；所述肿瘤为肺腺癌；所述肿瘤细胞为肺腺癌细胞；所述肺腺癌细胞具体为A549细胞系。
8.权利要求I所述的核酸适体在制备预防和/或治疗肿瘤的产品中的应用。
9.权利要求I所述的核酸适体在制备杀伤和/或抑制肿瘤细胞的产品中的应用。
10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于所述肿瘤为肺腺癌；所述肿瘤细胞为肺腺癌细胞；所述肺腺癌细胞具体为A549细胞系。
全文摘要
本发明公开了一种用于靶向药物载体的核酸适体。本发明提供的核酸适体，其为序列表中序列1所示的单链DNA分子。本发明的实验证明，本发明提供了一条核酸适体R13，它是从人肺癌细胞A549细胞中利用细胞筛选法得到的一段DNA序列。它对A549细胞具有很高的亲和力，而且，还可以进入A549细胞。在体外实验中，R13作为药物载体携带光治疗剂TF70，大大提高TF70对A549的杀伤作用，靶向性强。
文档编号A61K47/48GK102876681SQ20121034810
公开日2013年1月16日 申请日期2012年9月18日 优先权日2012年9月18日
发明者方晓红, 徐丽, 刘巧玲, 张振, 郑俊鹏, 王春儒 申请人:中国科学院化学研究所