一种携带Notch-1 shRNA的靶向磁性荧光纳米载体及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种集核磁共振成像、荧光成像、靶向基因治疗于一体的Fe3O4SiO2(FITC)纳米载体的制备及生物医学应用。本发明采用低毒、生物相容性良好的硅烷为原料，通过改良法首先合成掺杂有荧光染料的Fe3O4SiO2纳米粒子，并将具有提高转染效率的聚乙烯亚胺(PEI)以及能够靶向叶酸受体的叶酸(FA)通过酰胺反应联接在一起形成PEI-FA聚合物。通过PEI-FA进一步修饰Fe3O4SiO2(FITC)纳米粒子，吸附Notch-1的shRNA形成复合纳米载体。该纳米载体不仅具有核磁共振成像、荧光成像的功能，还能将基因靶向输送到肿瘤部位，沉默目标基因的表达、抑制肿瘤的生长。
【专利说明】-种携带Notch-1 shRNA的靶向磁性荧光纳米载体及其制 备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物材料领域、合成一种核磁共振造影剂，具体涉及一种携带Notch-I shRNA的靶向磁性荧光纳米载体的制备方法，及其在核磁共振成像、荧光成像及靶向基因治 疗等生物医学中的应用。
【背景技术】
[0002] 核磁共振成像是目前生物医学上应用广泛的成像工具，具有空间分辨率高，生物 体侵袭性低，不产生电离辐射等优点。核磁共振造影剂的使用可显著提高成像的特异性和 敏感度，从而提高MRI的成像效果，目前广泛应用的是以四氧化三铁为主的一类T 2加权成 像的造影剂。四氧化三铁纳米粒子是磁性纳米粒子的一种，具有药物运输、细胞分离、以及 作为核磁共振造影剂等多种用途。但在生物医学的应用中，四氧化三铁纳米粒子又存在许 多无法避免的缺点，例如在粒子进入体液和细胞之后，容易在细胞内发生聚集而形成较大 的粒子簇，同时四氧化三铁纳米粒子相较于其他粒子而言，胶体稳定性低，在细胞内环境 中，容易发生氧化作用而导致其失去原本的磁性。基于以上原因，四氧化三铁纳米粒子必须 经过表面改性之后才能被应用到生物医学领域中，改性之后的四氧化三铁纳米粒子具备抗 氧化、不易发生聚集、同时具有较好的胶体稳定性等特性。
[0003] 娃纳米粒子具有很多优点。首先娃纳米粒子具有较高的亲水性，相对容易地溶解 在溶液中；其次硅纳米粒子具有一定的稳定性，可以稳定地存在于体液或细胞中，不会发生 降解或其他反应；同时硅纳米粒子对生物体几乎没有毒副作用，具有较好的生物相容性； 硅纳米粒子制备方法简单易行，价格便宜。不仅如此，硅纳米粒子容易与其他分子相连，在 使用二氧化硅对磁性四氧化三铁纳米粒子进行表面修饰之后，更容易对其进行其他功能化 的修饰，更增加了磁性纳米粒子的应用范围。
[0004] Notch信号通路是一条保守的信号通路，广泛存在于无脊椎动物和脊椎动物中，对 细胞的分化、发育、增殖和凋亡有重要的调控作用。Notch信号通路与癌症的发生有关首先 在人类急性T淋巴细胞白血病中被证实，其原因是染色体易位导致9号染色体上的Notch-I 基因断裂，使其胞外段丢失，从而释放胞内区NICD激活Notch信号通路产生致癌作用，研究 发现50%以上的人类急性淋巴细胞白血病都有变异的Notch-I基因被活化，随后的研究表 明Notch-I基因在乳腺癌，前列腺癌，子宫颈癌等多种癌细胞中，均有异常过量表达。最新 的研究也发现下调Notch-I基因的表达可以通过抑制Akt，mT0R，和NF-κ B信号通路来抑 制前列腺癌细胞的生长、迁移和浸润，并诱导细胞的凋亡。因此沉默Notch-I基因可以达到 广泛的抗肿瘤的治疗效果。
[0005] shRNA (short hairpin RNA)短发卡RNA，包括两个反向重复序列，中间由一莖环 序列分隔形成的发卡结构。当shRNA表达载体进入动物细胞内，先在核内表达成shRNA， 在细胞质中shRNA被Dicer酶剪切成siRNA，随后siRNA与体内一些酶结合形成RNA诱导 的沉默复合物RISC，该复合物能与目的基因 mRNAs同源区特异性结合并将其降解。利用 Notch-IshRNA能够特异性地抑制Notch-I基因的过度表达，使Notch-I基因保持在沉默状 态，从而达到抗肿瘤的作用。
[0006] 本发明通过改良StSber法首先合成掺杂有荧光染料的Fe3O4OSiO 2纳米粒子，并将 具有提高转染效率的PEI以及能够靶向叶酸受体的叶酸（FA)，通过酰胺反应联接在一起形 成PEI-FA聚合物。通过PEI-FA进一步修饰Fe 3O4OSiO2 (FITC)纳米粒子，吸附Notch-I的 shRNA形成复合纳米载体。该纳米载体不仅具有核磁共振成像、突光示踪成像的功能，还能 将基因靶向输送到肿瘤部位，沉默目标基因的表达、抑制肿瘤的生长，使其成为诊疗一体化 的多功能纳米平台，为肿瘤的诊断和治疗提供有力的保证。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于：开发一种集核磁共振成像、荧光成像、靶向基因治疗于一体的 诊疗一体化的多功能纳米载体，应用于肿瘤的早期诊断和治疗。
[0008] 本发明以粒径为10-15nm的Fe3O4为内核，采用改良Stdber法合成核壳结构的 Fe3O4OSiO2的纳米载体，并且掺杂荧光燃料FITC，使其具有荧光示踪的功能，纳米载体表面 修饰具有靶向功能及高转染效率的高分子聚合物PEI-FA，进而通过静电吸附的方式吸附上 Notch-I的shRNA基因。该纳米载体不仅能用于核磁共振成像、荧光成像，还能将基因靶向 高效地输送到肿瘤部位，从而抑制肿瘤细胞的增殖、促进肿瘤细胞的凋亡，为肿瘤的治疗提 供一种新的治疗模式。
[0009] 本发明还提供上述携带Notch-1 shRNA的祀向磁性突光纳米粒载体的制备方法。 其制备方法包括以下步骤：
[0010] (1)将异硫氰酸荧光素（FITC)、氨丙基三甲氧基硅烷（APTMS)溶于无水乙醇中，避 光置于摇床中进行震荡。
[0011] (2)磁流体与氨水分散在无水乙醇中。置于摇床震荡，并向其中迅速加入TE0S，避 光，置于摇床中震荡。震荡后向其中加入占总体积10%-50%的APTMS-FITC继续震荡。并 将反应产物反复用双蒸水洗涤，4°C保存。
[0012] (3) DCC和NHS的体积比为0. 1-1:1，加入叶酸的量占总体积的20% -60%，摇床震 荡。
[0013] (4)向上述叶酸溶液中加入PEI溶液，使其终浓度为0. 5% -5%，置于摇床中震荡 反应，将反应物置于透析袋中透析。
[0014] (5)将上述透析袋中液体置于容器中冷冻干燥后，溶于双蒸水中，制得的PEI-FA 悬液备用。
[0015] (6)将上述PEI-FA与Fe3O4OSiO2按质量比为1:1-10混合，磁力搅拌。反应结束后 用水反复洗3遍，最后所得固体溶于双蒸水中。并且混合一定量的DNA，室温孵育得到吸附 基因的靶向磁性荧光纳米载体。
[0016] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0017] (1)本发明制备方法具有反应条件温和、操作简单、成本低、无毒无污染等优点。
[0018] (2)合成的Fe3O4OSiO2 (FITC)纳米载体具有很好的稳定性和分散性，纳米载体具 有超顺磁性,无顽磁剩磁现象产生,可用于核磁共振成像。
[0019] (3)纳米载体壳层中掺杂有荧光染料，该纳米载体可用于荧光示踪和成像。
[0020] (4)联接至纳米载体表面的叶酸（FA)分子，对叶酸受体高表达的肿瘤细胞具有靶 向识别和高结合的能力，PEI分子能增强该纳米载体进入细胞的能力，从而本发明合成的纳 米载体具有很强的肿瘤细胞的靶向性特征。
[0021] (5)纳米载体表现为低毒性，纳米载体对所载基因有保护作用，进入肿瘤细胞后能 有效转录、沉默目的基因 Notch-I的表达，抑制肿瘤细胞生长。
[0022] (6)此种纳米载体稳定、保存时间长，便于在生物医学领域应用。
【专利附图】
【附图说明】
[0023] 图1复合纳米载体的合成示意图
[0024] 图 2Fe304@Si02 (FITC)纳米粒子的透射电镜图⑷ Fe3O4OSiO2 (FITC) /PEI-FA/ Notch-1 shRNA的扫描电镜图（B)
[0025] 图3纳米载体的磁滞回线
[0026] 图4核磁共振氢普（1HNMR)测试PEI-FA谱图
[0027] 图5多种纳米载体作用人类乳腺癌细胞株（MDA-MB-231)不同时间后细胞增殖情 况对比图
[0028] 图6多种纳米载体作用人类乳腺癌细胞株（MDA-MB-231)后Notch-I蛋白的表达 图谱
[0029] 图7不同浓度的纳米粒子作用于人类乳腺癌细胞株（MDA-MB-231)的T2核磁共振 成像效果图（A)及定量分析磁响应时间的R 2值（B) 具体实施例
【具体实施方式】 [0030] 是对本发明做进一步说明，并不用来限制本发明的保护范围。
[0031] 实施例1 :靶向磁性荧光纳米载体的合成
[0032] ①本纳米粒子以Fe3O4为内核，以SiO2为外壳，并掺杂荧光染料FITC，载体表面修 饰有PEI-FA来吸附Notch-I的shRNA基因。其合成示意图如图1所示。
[0033] ②纳米粒子粒径均一，形态规则，成均匀的球型，粒径约60_70nm左右，在水溶液 状态下分散良好。
[0034] ③此种纳米粒子不仅具有核磁共振成像、荧光成像的功能。通过表面修饰的 具有靶向功能的高分子聚合物PEI-FA，使其能靶向叶酸受体高表达的人类乳腺癌细胞 (MDA-MB-231)，释放出所携带的基因，沉默相应蛋白的表达。
[0035] 实施例2 =Fe3O4OSiO2(FITC)纳米粒子的制备
[0036] ①将Iml双蒸水、l_5ml磁流体、5-10ml无水乙醇和200 μ 1氨水，置于摇床中 300rpm 震荡 10_30min。
[0037] ②向上述反应体系中迅速加入5-10 μ 1正硅酸乙酯（TEOS)，避光，置于摇床中， 300rpm 震荡 24h。
[0038] ③再向上述反应体系中加入l-5ml FITC-APTMS溶液，置于摇床中，300rpm继续震 汤 48h。
[0039] ④将上述溶液均匀分装在EP管中，12000rpm离心5min，弃上清，分别加入Iml双 蒸水，超声使其重悬，如此用双蒸水反复清洗5次。最后所得Fe 3O4OSiO2 (FITC)固体溶于双 蒸水中，4 C保存，待用。
[0040] 本实例所得纳米粒子大小均一，并呈均匀的球型，分散性良好，粒径在65nm左右。
[0041] 实施例 3 :Fe304@Si02 (FITC) /PEI-FA/Notch-1 shRNA 的制备
[0042] ①称取叶酸粉末20mg，加入5ml DMS0,使叶酸完全溶解，浓度为4mg/ml。取5-10ml 叶酸溶液，分别加入4-10ml DCC和4-10ml NHS，置于摇床中300rpm，震荡IOmin.
[0043] ②加入适量的PEI (20mg/ml)继续震荡12h,反应完成后,将反应物置于透析袋中， 透析48h。并将透析袋中的液体置于玻璃瓶中，冷冻干燥。
[0044] ③取干燥后的固体2g，溶于双蒸水中，制得20mg/ml的PEI-FA悬液
[0045] ④按实施例2方法先制备得到Fe3O4OSiO2 (FITC)。
[0046] ⑤将上述PEI-FA与Fe3O4OSiO2 (FITC)按质量比为1:5-10混合，磁力搅拌2h转速 为300rpm。反应结束后用水反复洗3遍，最后所得固体溶于双蒸水中。
[0047] ⑥实验前按10:1质量比把合成好的Fe3O4OSiO 2 (FITC)/PEI-FA与质粒DNA混合， 室温静止30min以上即可使用。
[0048] 本实例所得的纳米粒子电镜图如图2所示，纳米粒子呈现明显的核壳结构，粒径 均一，分散性良好。
[0049] 实施例4 :量子干涉仪对纳米粒子超顺磁性的分析
[0050] Fe3O4纳米粒子具有超顺磁性，在外加磁场的作用下粒子能够在向磁场方向聚集， 具有磁靶向性。因此我们使用量子干涉仪对Fe 3O4IgSiO2(FITC)、Fe3O4OSiO 2 (FITC)/PEI-FA、 Fe3O4OSiO2 (FITC)/PEI-FA/shRNA三种纳米载体进行磁性分析，结果如图3所示，三种纳米 粒子都具有超顺磁性，无顽磁剩磁现象产生，证明合成的纳米载体都具有超顺磁性，可以用 于后期的核磁共振成像。
[0051] 实施例5 :叶酸与PEI连接确认
[0052] 用DCC和NHS活化叶酸上的羧基，然后与PEI上的氨基发生酰胺反应，形成PEI-FA 复合物。PEI-FA的核磁共振氢谱图如图4所示，化学位移2. 0-3. O代表PEI亚甲基氢的信 号，在化学位移6. 5-9. O处表示叶酸苯环上特征性氢的信号。由此可说明PEI和FA成功的 偶联在一起。叶酸分子对叶酸受体高表达的肿瘤细胞具有靶向识别和高结合的能力，PEI分 子能增强该纳米载体进入细胞的能力。PEI-FA对纳米载体的修饰，不仅提供了基因转运的 功能，还同时具备了细胞靶向性和提高细胞转染效率的双重优势。
[0053] 实施例6 :携带基因的靶向磁性荧光纳米粒子Fe3O4IgSiO2(FITC)/PEI-FA/Notch shRNA对肿瘤细胞增殖的影响
[0054] ①将人类乳腺癌细胞MDA-MB-231培养、消化后，按每孔8X IO3个细胞的密度接种 到96孔板中，继续培养24h。
[0055] ②弃去旧的培养基，更换为无血清培养基，按照以下分组向每孔加入不同的粒子 各10 μ g (每组重复3个复孔），充分混匀，继续孵育6h。
[0056]第一组：Fe304@Si02 ;
[0057] 第二组：Fe304@Si02/PEI/SC shRNA ;
[0058] 第三组：Fe304@Si02/PEI/Notch-l shRNA ;
[0059] 第四组：Fe304@Si02/PEI-FA/SC shRNA
[0060] 第五组：Fe304@Si02/PEI-FA/Notch-l shRNA
[0061] ③培养6h后，吸出培养基，用PBS冲洗3遍，更换新鲜的完全培养基继续培养24h、 48h、72h。
[0062] ④向每孔中加入含20 μ I CCK-8溶液的培养基孵育lh，用酶标仪检测在450nm处 的OD值。按以下公式计算细胞存活率，细胞存活率=(A实验组-As自组）AAms-A s自组），每 组实验重复三次。
[0063] 图5表示的是各种纳米复合物携带基因后对肿瘤的治疗能力，可以看到具有靶 向能力的载体携带No t ch-1 shRNA后能够明显抑制肿瘤细胞的增殖，随着时间的增加抑 制效果更为明显。该实验说明了 Fe304@Si02/PEI-FA/N〇t Ch-lShRNA被人类乳腺癌细胞 MDA-MB-231高效内吞后，能够沉默相应的基因表达，抑制肿瘤细胞的增殖，达到治疗肿瘤的 作用。
[0064] 实施例7 :携带基因的靶向磁性荧光纳米载体（Fe304@Si02/PEI-FA/Notch-lshRNA) 对Notch-I蛋白表达的影响。
[0065] 为了评价Fe304@Si02/PEI-FA作为Notch-IshRNA基因载体的有效性，我们采用 Western Blot检测了 Notch-I蛋白表达水平。具体步骤如下：
[0066] ①将MDA-MB-231细胞消化后，按每孔5 X IO5个细胞的密度，接种在6孔板中，继 续培养24h。
[0067] ②取出培养好的MDA-MB-231细胞，按照以下分组向每孔中加入不同粒子各 10 μ g，充分混匀，继续孵育6h。
[0068]第一组：Fe304@Si02 ;
[0069] 第二组：Fe304@Si02/PEI/SC shRNA ;
[0070] 第三组：Fe304@Si02/PEI/Notch-lshRNA ;
[0071] 第四组：Fe304@Si02/PEI-FA/SC shRNA
[0072] 第五组：Fe304@Si02/PEI-FA/Notch-lshRNA
[0073] ③培养6h后，吸出培养基，用PBS冲洗3遍，更换新鲜的完全培养基继续培养72h， 提取总蛋白，通过Western Blot检测Notch-I蛋白的表达水平。
[0074] 结果如图6所示，当向细胞内用Fe304@Si0 2/PEI来转染Scramble shRNA时蛋白的 表达量与对照组的相同，而用Fe304@Si02/PEI来转染Notch-IshRNA时，蛋白表达量稍有下 调，但当用Fe 304@Si02/PEI-FA来转染Notch-IshRNA时，蛋白表达量明显下调。这就说明 Fe304@Si02/PEI_FA纳米载体确实能够将Notch-IshRNA靶向输送到肿瘤部位，使其mRNA降 解，抑制其蛋白的表达。
[0075] 实施例8 :核磁共振造影剂成像效果研究
[0076] 由于Fe3O4OSiO2 (FITC)/PEI-FA纳米粒子具有很好的超顺磁性，是理想的核磁共 振造影剂，因此我们使用3T核磁共振成像系统对Fe 3O4OSiO2(FITC)/PEI-FA纳米载体作 为造影剂的体外成像效果进行检测。图7 (A)是Fe3O4OSiO2 (FITC) /PEI-FA纳米载体作 用于MDA-MB-231细胞时T2核磁共振成像的效果图。随着MDA-MB-231细胞内吞Fe 3O4O SiO2 (FITC) /PEI-FA纳米载体的量逐渐增加，作为核磁共振成像造影剂成像效果越来越好， 当Fe元素的浓度达到25. 6 μ g/ml时，造影效果最为明显，证明Fe3O4OSiO2 (FITC)/PEI-FA纳 米粒子的确是比较理想的核磁共振T2造影剂。图7 (B)是定量分析磁响应时间的R2值，随 着Fe元素浓度增加，R2的值越来越大，符合核磁共振造影剂的要求。
[0077] 以上所述为本发明的较佳实施例，但本发明不应该局限于该实施例所公开内容。 所以凡是不脱离本发明所公开的原理下完成的等效或修改，都落入本发明的保护范围。
【权利要求】
1. 一种核壳结构的磁性突光纳米载体，磁性内核为Fe304外壳为Si02,其特征在于：所 述纳米载体的二氧化硅壳层内部掺杂荧光染料，纳米载体表面修饰有叶酸作为靶向分子， 携带Notch-lshRNA质粒作为靶向基因。
2. -种如权利要求1所述的靶向磁性荧光纳米载体的制备方法，其特征在于，包括如 下步骤： A. 将异硫氰酸荧光素（FITC)、氨丙基三甲氧基硅烷（APTMS)溶于无水乙醇中，避光，摇 床震荡，形成APTMS-FITC; B. 将磁流体和氨水溶于稀释的无水乙醇中，置于摇床震荡，再将正硅酸乙酯（TE0S)加 入其中，置于摇床震荡形成Fe30 4@Si02纳米粒子； C. 将APTMS-FITC与Fe304@Si02纳米粒子混合，置于摇床震荡，形成Fe 304@Si02 (FITC); D. 向N-羟基琥珀酰亚胺（NHS)和N，N' -二环己基碳二亚胺（DCC)的混合溶液中加 入叶酸，置于摇床中震荡，进行叶酸活化，向其中加入PEI，收集沉淀物，溶于双蒸水中，制得 PEI-FA 悬液； E. 将 Fe304@Si02 (FITC)和 PEI-FA 悬液混合，磁力搅拌，得到 Fe304@Si02 (FITC) /PEI-FA 纳米载体； F. 将上述Fe304@Si02 (FITC) /PEI-FA溶液混合质粒DNA，室温反应得到携带基因的靶向 磁性荧光纳米载体。
3. 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤A中所述的FITC的浓度为 0· 1-lmg/ml，FITC 与 APTMS 的体积比为 10-50:1。
4. 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤B中所述磁流体与氨水的体积比 为1-10:1，所加入的TE0S的量占总体积的1% -10%。
5. 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤C所述的APTMS-FITC的加入量占 总体积的10% -50%。
6. 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤D中加入DCC和NHS的体积比为 0. 1-1:1 ;加入叶酸的量占总体积的10% -60% ;加入PEI的终浓度为0. 5% -5%。
7. 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤E中所述的Fe304@Si02 (FITC)和 PEI-FA的质量比为1-10:1。
8. -种如权利要求1或2所述的靶向磁性荧光纳米载体，在生物医学领域中的应用。
【文档编号】A61K48/00GK104288791SQ201410549427
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年10月16日 优先权日:2014年10月16日
【发明者】刘贻尧, 李亭亭, 李颖, 杨红 申请人:电子科技大学