一种靶向eps8与egfr结合的短肽及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种靶向EPS8与EGFR结合的短肽及其应用，所述短肽的序列为：N’-Arg-Lys-Lys-Asn-Lys-Pro-Pro-Pro-Pro-Lys-Lys-C’。所述短肽能够有效抑制EPS8阳性肿瘤的增殖，能够用于制备治疗EPS8阳性肿瘤的药物，具有开发为抗肿瘤肽类药物的巨大潜力。
【专利说明】—种靶向EPS8与EGFR结合的短肽及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于药物化学、多肽生物【技术领域】，具体涉及一种靶向EPS8与EGFR结合的短肽及其应用。
【背景技术】
[0002]表皮生长因子受体通路底物8 (Epidermal Growth Factor Receptor pathwaysubstrate N0.8, EPS8)是多种受体型和非受体型酪氨酸激酶的磷酸化底物，由Fazioli等在对小鼠纤维母细胞NIH3T3表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor,EGFR)通路的研究中首次发现。近年研究显示，EPS8在多种实体瘤(如宫颈癌、结直肠癌、垂体瘤、口腔鳞癌、胰腺导管癌、乳腺癌、甲状腺癌、食管癌及恶性胶质瘤等)及血液系统肿瘤(如多发性骨髓瘤、急性髓系白血病、混合系白血病等)的组织及细胞中表达异常升高，而在正常组织表达很低或无表达。进一步的研究显示，EPS8通过调控细胞周期促进肿瘤细胞的增殖，通过参与细胞伪足的形成及与肌动蛋白的相互作用促进肿瘤细胞的转移，通过影响肿瘤细胞对化疗药物的耐受性与患者的预后相关(Li Y*, Xue T, He Y, Du J.Noveloncoprotein EPS8: a new target for anticancer therapy [J].Future Oncology, 20130ct ；9(10): 1587-94.)。因此,EPS8已成为为肿瘤监测与治疗的新祀点，为肿瘤祀向治疗开辟新的道路。 [0003]作用于EGFR不同结构域的抑制剂，如作用于胞外区的Herceptin(赫赛汀，曲妥珠单抗)和作用于激酶区的GefitiniM易瑞沙，吉非替尼)，其临床应用虽然取得了令人鼓舞的疗效，但普遍存在特异性差、易耐药、副作用差等缺点，研发更为安全有效、特异性强的抗肿瘤药物是临床上的迫切需求。然而，有别于其他生长因子受体，EGFR的近膜区扮演着“激活”而非“自我抑制”激酶区的作用(Jura N et al.Mechanism foractivation of the EGF receptor catalytic domain by thejuxtamembrane segment[J].Cell, 2009，137 (7): 1293-1307.)，作用于近膜区的抑制剂特异性强、选择性好，这为研制恶性肿瘤疾病提供新的药物治疗靶向。肽类抑制剂相对上述小分子抑制剂来讲，具有活性高、用药剂量小、毒副作用低、代谢终产物为氨基酸等多种优点，成为近年来肿瘤靶向治疗研究执占。
【发明内容】
[0004]为了解决上述问题，本发明提供一种靶向EPS8与EGFR结合的短肽及其应用。
[0005]为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案:
[0006]一种祀向 EPS8 与 EGFR 结合的短妝，其序列为:N’ -Arg-Lys-Lys-Asn-Lys-Pro-Pro-Pro-Pro-Lys-LyS-Cj。
[0007]优选地，所述短肽的C’末端赖氨酸的羧基被酰胺化，即其序列为N’ -Arg-Lys-Lys-Asn-Lys-Pro-Pro-Pro-Pro-Lys-LyS-NH2-C?。
[0008]优选地，所述短肽阻断体内EPS8与其受体的相互作用。[0009]一种用于治疗EPS8阳性肿瘤的药物，所述药物的活性成分为上述的短肽。
[0010]优选地，所述药物还包含药用辅料。
[0011]优选地，所述药物的制剂形式为注射剂、片剂、胶囊剂、气雾剂、栓剂、膜剂、控释或缓释剂或纳米制剂。
[0012]上述的短肽在制备治疗EPS8阳性肿瘤的药物中的应用。
[0013]所述EPS8阳性肿瘤为宫颈癌、结直肠癌、垂体瘤、口腔鳞癌、胰腺导管癌、乳腺癌、甲状腺癌、食管癌、恶性胶质瘤、多发性骨髓瘤、淋巴瘤、急性髓系白血病、混合系白血病或急性淋巴细胞白血病。
[0014]发明人通过计算机辅助药物设计(Computer Aided Drug Design, CADD)技术,设计出一种靶向EPS8与EGFR结合的短肽，命名为P01，发现其完全对接于EGFR近膜区(图1，L664-1682)。因此，发明人合成了短肽P01，通过MTS法检测短肽POl对EPS8高表达人急性髓系白血病细胞株KGl α和人乳腺癌细胞株MCF-7的增殖抑制活性，并初步获得了 KGl α细胞和MCF-7细胞的抑制活性曲线(图5、6)。然后，通过对短肽POl进行FITC标记，利用荧光倒置显微镜和激光共聚焦显微镜观察短肽POl穿膜效果，确认其成功跨膜进入靶细胞(图 7、8)。
[0015]相比于现有技术，本发明具有如下有益效果:
[0016](I)短肽POl能够有效抑制EPS8阳性肿瘤的增殖，具有开发为抗肿瘤肽类药物的巨大潜力；
[0017](2)短肽POl靶向EPS8，作用于EGFR的近膜区，特异性强、选择性好；
[0018](3)短肽POl作为肽类抑制剂，相对于小分子抑制剂来讲，具有活性高、用药剂量小、毒副作用低、代谢终产物为氨基酸等多种优点。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1为本发明短肽POl与EGFR的分子对接的构象示意图。其中，箭头A指示部分为EGFR构象，箭头B指示部分为本发明短肽POl构象。
[0020]图2为本发明短肽POl与EGFR的分子对接的三维结构示意图。其中，箭头A指示部分为EGFR，箭头B指示部分为短肽POl。
[0021 ] 图3为本发明短肽PO I的HPLC谱图。
[0022]图4为本发明短肽PO I的MS谱图。
[0023]图5为本发明实施例2中短肽POl对EPS8高表达的人急性髓系白血病细胞株KGla细胞增殖抑制活性曲线。
[0024]图6为本发明实施例3中短肽POl对EPS8高表达的人乳腺癌细胞株MCF-7细胞增殖抑制活性曲线。
[0025]图7为本发明实施例5中FITC标记的短肽POl在荧光倒置显微镜下观察穿膜效果图。其中，(A)488nm波长处；(B)488nm波长处和白光处叠加图像；(C)白光处。
[0026]图8为本发明实施例6中FITC标记的短肽POl在激光共聚焦显微镜下于340nm、515nm、488nm波长处观察穿膜效果图及叠加图像。其中，A、B和C三组图分别是不同视野下的图像。【具体实施方式】
[0027]以下结合附图和实施例对本发明作进一步的详细描述。这些实施例只是为了说明目的，而不是用来限制本发明的范围。本发明中使用实验方法、试剂等为现有技术，在此不
再一一赘述。
[0028]实施例1肽的合成
[0029]通过计算机辅助药物设计(Computer Aided Drug Design, CADD)技术,设计出一种靶向EPS8且与EGFR结合的短肽，命名为POl。所述POl的序列如SEQ ID NO:1所示，即其序列为 N’-Arg-Lys-Lys-Asn-Lys-Pro-Pro-Pro-Pro-Lys-Lys-C’。通过构象分析发现，POl完全对接于EGFR近膜区(图1和图2，L664-1682)，符合文献报道EPS8与EGFR相互作用主要由受体近膜区的6个酸性Glu和配体首尾碱性Arg、Lys、His间的静电作用介导(FazioliFet al.Eps8，a substrate for the epidermal growth factor receptor kinase, enhancesEGF-dependent mitogenic signals [J].EMBO J，1993，12 (10): 3799-3808.)。
[0030]短肽POl委托中肽生化有限公司采用标准Fmoc方案进行合成，并酰胺化羧基端以保护 Lys,酸胺化后的序列为 N’-Arg-Lys-Lys-Asn-Lys-Pro-Pro-Pro-Pro-Lys-Lys-NH2-C’。采用反相高效液相色谱(HPLC)法对短肽POl进行纯化和纯度分析，质谱(MS)法对短肽POl进行鉴定和分子量测定。由图3中的HPLC谱图可知，短肽POl纯度为98.9% ;由图4中的MS谱图可知，短肽POl分子量为2858.5，与理论值相符。
[0031]所得短肽POl用二甲基亚砜(DMSO)溶解制成储备液，置温度_70°C保存，使用前用磷酸盐缓冲液(PBS) 稀释。
[0032]实施例2短肽POl对EPS8高表达的人急性髓系白血病细胞株KGl α细胞增殖抑制活性
[0033]选择EPS8高表达的人急性髓系白血病细胞株KGl α (人急性髓系白血病细胞株KGl α购自美国菌种保藏中心ATCC)，将细胞以10000个/孔接种在96孔培养板内，每孔100 μ L，培养基用含10%胎牛血清的RPM1-1640完全培养基；8h后，加入终浓度分别为O、100、300、500μ g/ml的短肽P01。设定KGl α细胞与短肽POl共孵育时间分别为24h、48h、72h，MTS法测定490nm波长处OD值，计算抑制率。
[0034]抑制率计算公式:KG1 α细胞存活率=[(0D实验组_0D空白组)]/[ (0D阴性组_0D空白组)]X100%。对KGla细胞增殖的抑制活性数据见图5:24h时，IC5tl为888.5 μ g/mL(95%Cl:810.4μ g/mL ~974.1 μ g/mL) ；48h 时，IC50 为 413.9 μ g/mL (95 % Cl:389.3μ g/mL ~444.0 μ g/mL) ;72h 时，IC50 为 335.6 μ g/mL (95% Cl:316.1 μ g/mL ~356.2 μ g/mL)。
[0035]由上述结果可知，短肽POl在335.6 μ g/mL作用72h时对KGl α细胞就有较好的抑制细胞增殖活性，具有较好的研发为治疗EPS8阳性肿瘤的药物的前景。
[0036]实施例3短肽POl对EPS8高表达的人乳腺癌细胞株MCF-7细胞增殖抑制活性
[0037]选择EPS8高表达的人乳腺癌细胞株MCF_7(人乳腺癌细胞株MCF-7购自美国菌种保藏中心ATCC)，将细胞以10000个/孔接种在96孔培养板内，每孔100 μ L，培养基用含10%胎牛血清的DMEM完全培养基；8h后，加入终浓度分别为O、100、300、500 μ g/ml的短肽POl。设定MCF-7细胞与短肽POl共孵育时间分别为24h、48h、72h，MTS法测定490nm波长处OD值，计算抑制率。
[0038]抑制率计算公式:MCF_7细胞存活率=[(0D实验组_0D空白组)]/ [ (0D阴性组_0D空白组)]X 100%。对MCF-7细胞增殖的抑制活性数据见图6:24h时，IC50为594.2 μ g/mL(95%Cl:572.5 μ g/mL ~616.8 μ g/mL) ；48h 时，IC50 为 374.9 μ g/mL (95 % Cl:352.9 μ g/mL ~398.3 μ g/mL) ；72h 时，IC50 为 304.7 μ g/mL (95% Cl:294.7 μ g/mL ~315.1 μ g/mL)。
[0039]由上述结果可知，短肽POl在304.7 μ g/mL作用72h时对MCF-7细胞就有较好的抑制细胞增殖活性，具有较好的研发为治疗EPS8阳性肿瘤的药物的前景。
[0040]实施例4短肽POl的用途及用于治疗EPS8阳性肿瘤的药物
[0041]本发明还提供了短肽在制备治疗EPS8阳性肿瘤的药物中的应用及用于治疗EPS8阳性肿瘤的药物。所述治疗EPS8阳性肿瘤的药物以短肽POl为活性成分。本发明中所述药物还包括药用辅料。所述药用辅料指药学领域常规的药物载体，例如:缓释剂、赋形剂如水等，填充剂如淀粉、蔗糖等；粘合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂如甘油；崩解剂如琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂如季铵化合物；表面活性剂如十六烷醇；吸附载体如高岭土和皂粘土 ；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙/镁、聚乙二醇等。另外，所述药物中还可以加入其它辅剂，如香味剂、甜味剂等。所述药物可以的剂型包括但不限于注射剂片剂、胶囊剂、气雾剂、栓剂、膜剂、控释或缓释剂或纳米制剂。
[0042]本发明中所述的“EPS8阳性肿瘤”包括但不限于宫颈癌、结直肠癌、垂体瘤、口腔鳞癌、胰腺导管癌、乳腺癌、甲状腺癌、食管癌、恶性胶质瘤、多发性骨髓瘤、淋巴瘤、急性髓系白血病、混合系白血病或急性淋巴细胞白血病。
[0043]实施例5荧光倒置显微镜下观察FITC标记短肽POl的穿膜效果
[0044]将KGla靶细胞以2 X IO5个/孔接种在6孔培养板内，每孔lmL，培养基用含10%胎牛血清的RPM1-1640完全 培养基；8h后，加入终浓度为20001^/1111^仲11'(:标记短肽？01。24h后，在荧光倒置显微镜下观察FITC标记短肽POl的穿膜效果，确认其成功跨膜进入细胞(图7)。对比荧光倒置显微镜下488nm波长处、白光处及488nm波长处和白光处叠加图像，发现视野下绝大多数靶细胞均有绿色荧光表达，证明该FITC标记短肽POl成功穿膜进入细胞，靶向抑制KGl α细胞的增殖活性，具有较好的研发为治疗EPS8阳性肿瘤的药物的前景。
[0045]实施例6激光共聚焦显微镜下观察FITC标记短肽POl的穿膜效果
[0046]将KGl α靶细胞以2 X IO5个/孔接种在6孔培养板内，每孔lmL，培养基用含10%胎牛血清的RPM1-1640完全培养基；8h后，加入终浓度为2000 μ g/mL的FITC标记的短肽POl。分别采用DAPI (与细胞核DNA结合、340nm波长处产生蓝色荧光)和罗丹明标记鬼笔环肽(Phalloidin)(与细胞骨架微丝蛋白结合、515nm波长处产生红色荧光)对靶细胞进行染色，FITC标记短肽POl (488nm波长处产生绿色荧光)，24h后置于激光共聚焦显微镜下观察(图8)。结果显示，340nm波长处可见细胞核内较强片状蓝色荧光，清晰地显示出细胞核轮廓；515nm波长处可见细胞质内密集细长的红色荧光沿细胞突起交叉分布，为细胞骨架被罗丹明标记鬼笔环肽染色所产生的荧光；488nm波长处可见细胞质区密集分布的点状绿色荧光；叠加(Overlay)荧光显示,细胞核基质中可见较细胞质中少而弱的绿色点状荧光，且核内绿色荧光分布不均。上述结果表明，FITC标记短肽POl既具有穿透细胞膜的能力，也具有一定穿透细胞核膜的能力。
[0047]基于上述实验结果，可得出以下结论:本申请设计并合成靶向EPS8与EGFR结合短肽POl，通过MTS法检测短肽POl对EPS8高表达人急性髓系白血病细胞株KGl α和人乳腺癌细胞株MCF-7的增殖抑制活性，IC50分别为335.6 μ g/mL(72h)和304.7 μ g/mL(72h)，具有较好的研发为治疗EPS8阳性肿瘤疾病肽类抑制剂的前景。然后，对短肽POl进行FITC标记，利用荧光倒置显微镜和激光共聚焦显微镜观察短肽穿膜效果。由于EPS8广泛表达于不同时期不同类型的肿瘤组织中，且在正常组织细胞中低表达或无表达，因此，本申请靶向EPS8与EGFR结合短肽可以作为活性成分，和药学上可接受的载体组成组合物，通过阻断体内EPS8与其受体相互作用，在治疗与体内EPS8阳性肿瘤疾病方面的应用前景鼓舞人心，具有开发为抗肿瘤肽类药物的巨大潜力。
[0048] 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
【权利要求】
1.一种祀向EPS8与EGFR结合的短肽,其特征在于,其序列为:N’-Arg-Lys-Lys-Asn-Lys-Pro-Pro-Pro-Pro-Lys-LyS-Cj。
2.根据权利要求1所述的短肽，其特征在于，所述短肽的C’末端赖氨酸的羧基被酰胺化，即其序列为 N’ -Arg-Lys-Lys-Asn-Lys-Pro-Pro-Pro-Pro-Lys-LyS-NH2-C?。
3.根据权利要求1或2所述的短肽，其特征在于，所述短肽阻断体内EPS8与其受体的相互作用。
4.一种用于治疗EPS8阳性肿瘤的药物，其特征在于，所述药物的活性成分为权利要求1或2所述的短肽。
5.根据权利要求4所述的药物，其特征在于，所述药物还包含药用辅料。
6.根据权利要求4所述的药物，其特征在于，所述药物的制剂形式为注射剂、片剂、胶囊剂、气雾剂、栓剂、膜剂、控释或缓释剂或纳米制剂。
7.权利要求1或2所述的短肽在制备治疗EPS8阳性肿瘤的药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述EPS8阳性肿瘤为宫颈癌、结直肠癌、垂体瘤、口腔 鳞癌、胰腺导管癌、乳腺癌、甲状腺癌、食管癌、恶性胶质瘤、多发性骨髓瘤、淋巴瘤、急性髓系白血病、混合系白血病或急性淋巴细胞白血病。
【文档编号】A61K38/08GK103992382SQ201410203873
【公开日】2014年8月20日 申请日期:2014年5月14日 优先权日:2014年5月14日
【发明者】李玉华, 薛同圆 申请人:南方医科大学