检测花生fad2基因snp等位变异的引物、探针及方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种检测花生FAD2基因SNP等位变异的引物、探针及方法，属于分子 生物学技术领域。
【背景技术】
[0002] 花生是重要的油料作物，其籽粒脂肪酸的组成是衡量花生品质的重要指标。从油 脂稳定性角度看，高油酸/亚油酸比值（0/L比）的花生及其制品不易氧化和腐败，货架 期较长。有研究表明烘焙后的高油酸花生较普通油酸含量花生贮存期延长8倍（Mozingo etal.，2004);而高油酸花生压榨的花生油较普通油酸含量品种贮藏期延长高达14倍 (O'Keefeetal.，1993)。从对人体健康角度考虑，油酸有益于维持有益胆固醇高密度脂 蛋白（HDL)水平，增强胰岛素敏感性，还可以改善一些炎症（MesaGarciaetal.，2006; Vassiliouetal.，2009)。为了提高油脂的稳定性，工业上常通过加氢提高油脂的饱和度， 这往往在碳链中引入反式双键生成反式脂肪酸，长期食用会大大增加罹患心脑血管病的几 率。因此，提高花生籽粒的油酸含量和0/L比值是花生油脂遗传改良的主要目标。
[0003]FAD2是控制植物籽粒油酸、亚油酸含量的关键酶，它催化油酸在碳12位去饱和产 生亚油酸。花生是异源四倍体（2n= 4X= 40)，AhFAD2A和AhFAD2B是位于不同基因组上的 非等位基因，这两个基因对油酸、亚油酸含量均有贡献，只有这两个基因转录受到抑制或酶 活降低，籽粒才表现出高油酸性状。美国上世纪80年代通过化学诱变和自然突变筛选获得 的一些高油酸突变体（如F435,8-2122,M2-225,MF)(Nordenetal.，1987 ;Ashri, 1988)， 一直作为亲本沿用至今。这些品种或品系籽粒油酸含量都在80%左右。分析F435及其衍 生系高油酸性状的遗传基础发现，AhFAD2A基因编码区448nt处核苷酸序列由G-A的碱基 替代，编码的氨基酸由天冬氨酸D变为天冬酰胺N，AhFAD2A酶活性大幅降低；同时AhFAD2B 基因编码区442nt处1个A碱基插入，导致编码蛋白提前终止。针对上述突变体及衍生系 AhFAD2A和AhFAD2B基因的SNP差异，近年来开发了多种用于检测的标记和检测方法，如 酶切扩增多态性序列法（CAPS,cleavedamplifiedpolymorphicsequence)、等位基因特 异PCR(AS-PCR，Allele-SpecificPCR)、测序法和荧光定量PCR法，从而实现对高油酸花 生育种进行辅助选择（Jungetal.，2000a;Chuetal.，2007;Chuetal.，2009;Chenet al.，2010)。我国目前也培育出了几个高油酸花生品种，如山东花生研究所的培育的花育 32 (2009年山东省审定）、花育51和花育52,河南省开封市农林科学研究院开农H03-3、开 农61、开农176、开17-15,河北省冀花11号、13号等。这些品种与突变体F435AhFAD2A基 因在448nt处以及AhFAD2B基因在442nt处的突变位点相同。可以使用相同的标记和检测 方法检测。
[0004]CAPS技术又称为PCR-RFLP，基本原理是利用己知的DNA序列资源设计出一套特 异性的PCR引物（19-27bp)，然后扩增特异的目的DNA片段，接着用一种专一性的限制性内 切酶切割所得扩增产物，凝胶电泳分离酶切片段，染色并进行RFLP分析。CAPS标记揭示 的是特异PCR片段的限制性长度变异的信息。AhFAD2A未突变基因中存在的1个Hpy991 酶切位点（5'CQACG3')，由于448ntG-A的突变该酶切位点消失；而AhFAD2B基因 的442ntA碱基的插入突变则在突变基因中导致多出了一个Hpyl88I酶切位点识别位 点（5'TCAGA3')，进行酶切检测时突变和未突变AhFAD2A和AhFAD2B基因酶切图谱具 有明显不同。该方法因为需要经过片段扩增、限制性内切酶酶切、凝胶电泳检测等步骤， 过程繁琐、成本较高，并且对扩增产物特异性要求高。AS-PCR方法的基本原理是根据基因 上的等位变异位点，设计目的片段特异扩增引物，并进行PCR扩增和产物的凝胶电泳检测 分析。差异往往通过扩增产物的大小差异、有或无来判断。为了检测AhFAD2A和AhFAD2B 基因的等位差异，Chen等（2010)设计了 5条引物，1条正向引物F435-F和4条反向引物 F435IC-R、F435WT-R、F435SUB-R、F435INS-R，分别用于PCR扩增的质量控制和扩增非突变 基因、AhFAD2A基因448nt碱基替换及AhFAD2B基因A碱基插入。该方法由于检测的多为 SNP差异，要求提取DNA质量较好，且需控制较为严格的扩增条件；但检测结果常常出现偏 差，需多次重复。针对这两个基因人们还直接采用测序的方法进行检测，这一方法不仅成本 高，而且由于AhFAD2A和AhFAD2B基因ORF区序列相似度极高，因此很难设计引物进行特异 扩增，严格区分两基因。特别是AhFAD2A448位的G/A，在AhFAD2B基因为保守的G，难以区 分AhFAD2A为纯合的AA还是杂合的G/A状态。
[0005] 随着分子生物学检测技术的发展，荧光实时定量PCR检测技术不断应用于SNP标 记的检测。荧光实时定量PCR检测可分为2类：一类为荧光染料SYBRGreen检测法；另一 类为TaqMan探针法。Barkley等（2010)设计了针对AhFAD2B基因的442ntA碱基的插入 或缺失的TaqMan-MGB探针以区分该位点插入、缺失或呈杂合。该研究设计的扩增引物在 AhFAD2A和AhFAD2B基因中没有序列差异，仅靠探针5 '端存在的1个A/C碱基差异区分 AhFAD2A和AhFAD2B基因；并且对于AhFAD2A的等位差异还需其他方法进行检测。
【发明内容】
[0006] 本发明针对现有技术的不足，提供一种检测花生FAD2基因SNP等位变异的引物、 探针及方法。本发明分别设计了AhFAD2A和AhFAD2B基因的特异性扩增引物及针对这两个 基因野生型和突变型的TaqMan探针，并建立了相应的检测方法。
[0007] 本发明是通过如下技术方案实现的：
[0008] -种用于检测AhFAD2A基因448位G/A差异的引物，该引物为一对，核苷酸序列如 SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示。
[0009] 序列表中SEQIDNo.1由20个碱基组成，该序列为AhFAD2A基因0RF区自Y端 413-432位碱基序列；SEQIDNo.2由20个碱基组成，该序列为AhFAD2A基因0RF区自5' 端528-547位碱基的反向互补序列；扩增长度为135bp。
[0010] 一种用于检测AhFAD2A基因448位A碱基的TaqMan探针1，该TaqMan探针1由一 段22个碱基组成的核苷酸序列和位于核苷酸序列5'端的TAMRA发光基团及位于核苷酸序 列3'端的BHQ2荧光淬灭基团组成，核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示。
[0011] 序列表中SEQ ID No. 3由22个碱基组成，该序列为AhFAD2A基因0RF区自5'端 436-457位碱基序列。
[0012] 一种用于检测AhFAD2A基因448位G碱基的TaqMan探针2,该TaqMan探针2由一 段23个碱基组成的核苷酸序列和位于核苷酸序列5'端的CY5发光基团及位于核苷酸序列 3'端的BHQ2荧光淬灭基团组成，核苷酸序列如SEQIDNo. 4序列。
[0013] 序列表中SEQIDNo. 4由23个碱基组成，该序列为AhFAD2A基因0RF区自5'端 435-457位碱基序列。
[0014] -种用于检测AhFAD2B基因442位A碱基插入或缺失的引物，该引物为一对，核苷 酸序列如SEQIDNo. 5和SEQIDNo.