专利名称：检测系统的制作方法
技术领域：
本发明提供了例如，通过定量监测扩增反应来检测样品中靶多核苷酸的方法，还提供了用于这些方法中的探针和试剂盒。本发明尤其适于检测多态性或等位基因变异，因此可用于诊断方法。
公知的荧光聚合酶链式反应(PCR)监测技术包括链特异的和普通DNA嵌入剂技术，这些技术可以在一些二代PCR热循环装置上使用。这些反应以关闭的管形式在热循环仪上均一地进行。使用荧光计监测反应。测定的确切形式不同但是通常依赖于系统中两个荧光部分之间的荧光能量转移或FET以便产生信号，该信号指示扩增产物的存在。
WO 99/28500描述了用于检测样品中靶核酸序列存在的一种非常成功的测定法。在该方法中，向样品中加入一种DNA双链体结合剂和对所述靶序列特异的探针。该探针含有反应性分子，该分子能够从所述DNA双链体结合剂吸收荧光或者将荧光能量送给所述DNA双链体结合剂。然后将该混合物实施扩增反应，其中靶核酸被扩增，并且在扩增过程期间或之后诱导探针与靶序列杂交的条件。监测来自所述样品的荧光。
由于探针与靶序列杂交，DNA双链体结合剂如嵌入染料被捕获在链之间。通常，这将增加与染料有关的波长处的荧光。然而，当反应性分子能够从染料吸收荧光(即，它是受体分子)时，其通过FET，特别FRET从染料接受发射能量，因此其发射具有其特征波长的荧光。来自受体分子的荧光(其和染料的荧光具有不同波长)的增加将表明探针以双链体形式结合。
类似地，当反应性分子能够向染料供出荧光(即，它是供体分子)时，来自供体分子的发射作为FRET的结果而减小，并且可以检测该减小。在这些情况下染料的荧光的增加比所预期的更大。
来自探针上反应性分子的信号是链特异信号，其指示样品内靶标的存在。从而，优选监测来自反应性分子的荧光信号的改变，该改变表明与探针有关的双链体的形成或去稳定。
可以用于该方法的DNA双链体结合剂是自身与双链体形式的DNA粘附或结合并且能够作为能量供体或受体的任何实体。具体的实例是本领域中熟知的嵌入染料。
使用DNA双链体结合剂如嵌入染料和单标记的探针是有利的，因为这些组分比需要双标记的其他测定更经济。通过使用仅一种探针，形成探针基础必需的公知序列的长度可以相对较短并因此该方法甚至可用于困难的诊断情形中。
用于测定中的DNA双链体结合剂通常为嵌入染料，例如SYBRGreen，如SYBRGreen I、SYBRGold、溴化乙锭和YOPRO-1，它们自身是发荧光的。
为了在反应性分子和染料之间发生FET，如FRET，供体(其可以是嵌入染料或者探针上的反应性分子)的荧光发射必须比受体(即另一种染料或反应性分子)具有更短波长。用作供体和/或受体的分子产生的荧光信号可以可见光谱内的峰表示。
通常，发射波长内至少有一些重叠。即使信号是尖峰，也有来自荧光分子信号的一定“泄漏”，从而通常需要分辨探针产生的链特异峰和DNA双链体结合剂信号。这可以例如，通过由经验确定供体和受体光谱之间的关系并使用该关系使来自供体和受体的信号正常化来解决。
申请人已经发现了操作这种类型的测定的改良方法。
本发明提供了检测样品中靶核酸序列存在的方法，所述方法包括a)向被怀疑含有所述靶核酸序列的样品加入对所述靶序列特异的荧光标记的探针，和DNA双链体结合剂，该结合剂可以吸收来自探针上荧光标记的荧光能量但是不发射可见光，b)将所形成的混合物进行扩增反应，在扩增反应中靶核酸被扩增，c)将所述样品置于所述探针与靶序列杂交的条件下，和d)监测来自所述样品的荧光。
此处所用的表达“可见光”指光谱的可见区内，即390nm到750nm范围内波长的发射。
通过使用不发射可见光谱范围内的光的DNA双链体结合剂，使用该结合剂提供的信号可能与探针的信号重叠的问题就被避免了。从而，不用分辨来自探针的信号和来自DNA双链体结合剂的信号，并且可以测量更宽带宽上的有意义信号。这意味着可以简化装置，或者至少置于该装置上的计算需求。
因此可以在更宽范围的仪器上实施测定。
备选地，通过掺入额外的探针可以利用可见光谱内的自由带宽的任何区域，这些额外探针包括在不同波长发出荧光的不同标记，从而可以同时监测一种以上的靶标。这对于多重PCR反应尤其有用。
如果DNA双链体结合剂不发出光谱的可见部分内的发射，那么可以使用的DNA双链体结合剂可以是结合DNA双链体的任一种化合物。因此它可以是嵌入剂、小沟结合剂、结合DNA大沟的化合物，或者结合或堆叠到探针的末尾碱基的化合物，以及它们的组合。在特定实施方案中，DNA双链体结合剂将包括嵌入剂或小沟结合剂。它可以发出波长在可见光谱范围之外，例如红外范围内的辐射。然而，在本发明方法的背景中将检测不到这些发射，因此DNA双链体结合剂仅有效作为一种“暗淬灭剂”。
这些化合物通常比荧光嵌入染料更经济，使得本发明的方法更划算。
可以用于该方法中的适宜的DNA结合剂包括具有共轭芳香环系统的DNA结合剂。环可以是芳基环，如苯基、萘基或蒽基，或者芳香杂环，例如，含有高达20个原子，其中高达5个是杂原子，如氧、硫和氮。这些系统的实例包括蒽环(anthracyclin)或蒽醌。它们可被取代以提供适宜的DNA结合性质。
具体地，化合物含有结构(I)的任选取代的蒽醌 其中R1、R2、R3和R4独立地选自氢、官能团，或任选被例如官能团取代的烃基，或者R1和R2或R3和R4任选连接在一起形成环，该环任选含有杂原子，和/或任选被官能团或烃基取代。
如此处所用的，术语“官能团”指反应性基团，其适宜地含有杂原子。官能团的实例包括卤素、氰基、硝基、氧代、-OC(O)Ra、-ORa、-C(O)ORa、S(O)tRa、NRbRc、OC(O)NRbRc、C(O)NRbRc、OC(O)NRbRc、-NR7C(O)n’R6、-NRaCONRbRc、-C＝NORa、-N＝CRbRc、S(O)tNRbRc、C(S)nRa、C(S)ORa、C(S)NRbRc或-NRbS(O)tRa，其中Ra、Rb和Rc独立地选自氢或任选被烃基取代，或者Rb和Rc一起形成任选取代的环，该环任选含有其他杂原子如S(O)s、氧和氮，n’是整数1或2，s为0、1、或2，t为0或1-3的整数。
烃基Ra、Rb和Rc的适宜的任选取代基也可以是官能团。
如此处所用的术语“烃基”指含有碳和氢原子的有机基团，如烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基或芳烷基。术语“烷基”指直链或支链烷基，其适宜地含有高达20，更适宜地高达10个和优选高达6个碳原子。术语“烯基”或“炔基”指具有2到10个碳原子的不饱和直链或支链。术语“环烷基”指具有至少3个碳原子并且结构为环状的烷基基团。术语“芳基”指芳香环，如苯基和萘基。术语“芳烷基”指被芳基取代的烷基，如苯甲基。
R1、R2、R3和R4的取代基的特定实例为羟基以致产生酮基-烯醇互变异构。
优选地，该化合物含有一个或多个杂原子以产生电荷，该电荷有助于结合DNA。取代基侧链中可以含有杂原子，如氧、氮或硫。在特定实施方案中，式(I)的化合物包括取代基R1、R2、R3和R4内的至少一个氮原子。
作为DNA结合官能度的结果，这些化合物的实例可以在药学领域，尤其抗癌和抗生素应用中发现。例如，具有使得它们适宜作为本发明的测定法中的DNA结合剂的性质的化合物包括美国专利号4197249、美国专利号3183157、美国专利号4012284、和美国专利号3997662中描述的化合物。
其他特定化合物是式(IA)的化合物并且在美国专利号513327中描述。这些化合物具有上面描述的式(I)，但是在那一情况中，R1、R2、R3和R4独立地选自氢、X、NH-ANHR和NH-A-N(O)R’R”，其中X为羟基、卤素、氨基、C1-4烷氧基或C2-8烷酰氧基，A为C2-4亚烷基，NH与NHR或N(O)R’R”之间的链长为至少2个碳原子并且R、R’和R”每一个独立地选自C1-4烷基和C2-4羟基烷基和C2-4二羟基烷基，条件是与氮原子连接的碳原子不携带羟基，以及没有碳原子被两个羟基取代；或者R，和R”一起为C2-6亚烷基，该亚烷基与R’和R”所连接的氮原子一起形成具有3到7个原子的杂环，条件是R1、R2、R3和R4中的至少一个是基团NH-A-N(O)R’R”。具体实例在美国专利号5132,327中描述，该专利的内容被并入作为参考。
使用常规方法，可以试验适于用作本发明的DNA双链体结合剂的化合物以观察它们是否吸收例如，来自特定标记或者一系列标记的荧光能量。具体地，它们可以被包括在使用荧光剂的PCR反应中，该荧光剂可以是标记探针或甚至荧光嵌入剂，如Sybr Green或Sybr Gold，以便试验淬灭性质，并且还确保它们不阻碍扩增反应自身的进行。实施该试验的适宜方案在下文的实施例3中给出。
具体实例为米托蒽醌(1，4-二-羟基5，8-二[2-[(2-羟乙基)氨基]乙基]氨基]-9，10-蒽二酮)或者其盐，如盐酸盐或二盐酸盐，或诺加霉素(2R-(2α，3β，4α，5β，6α，11β，13α，14α)]-11-[6-脱氧-3-C-甲基-2，3，4-三-O-甲基-α-L-吡喃甘露糖基)氧基]-4-(二甲基氨基)-3，4，5，6，9，11，12，13，14，16-十氢-3，5，8，10，13-五羟基-6，13-二甲基-9，16-二氧代-2，6-环氧-2H-四并苯并[1，2-b]oxocin-14-甲酸甲酯)，或柔红霉素(8S，-顺式)-8-乙酰基-10[3-氨基-2，3，6-三脱氧-α-L-来苏-吡喃己糖基)氧]-7，8，9，10-四氢-6，8，11-三羟基-1-甲氧基-5，12-四并苯二酮)。
其他特定实例包括美国专利号5132327(相当于EP-A-0450021)中描述的化合物，具体地，可以从Biostatus以商标名“Draq5”得到的细胞渗透的DNA化合物，以及以商标名“Apoptrak”得到的该化合物的N-氧化物衍生物。
用于本发明的一组特定DNA双链体结合剂是米托蒽醌、柔红霉素、Draq5TM和ApoptrakTM。
在特定实施方案中，DNA双链体结合剂是米托蒽醌。
备选地或者附加地，淬灭部分如4-(4-二甲基氨基苯基偶氮)苯甲酸(DABCYL)可以附着并优选共价结合到公知的DNA结合剂、嵌入剂或小沟或大沟结合剂。在该情况中，如果荧光被淬灭部分完全淬灭，那么该DNA结合剂可以有一定程度的荧光。这些化合物具有稳定双链体的作用。这在两方面是有利的。首先其提高了探针与靶标的结合，减少了扩增期间改变温度所需的时间，并允许反应更快地进行。其次其允许为引物和探针使用更短的核酸序列。当例如实施解链点分析时，这通常是有用的，因为探针越短，错配导致的解链温度之间的差异将越显著。其尤其可用于例如富含AT的靶标，其中由于探针和引物退火所需的低温，长引物和探针可以降低反应的特异性。
单链形式时，探针在一定程度上可以感知DNA双链体结合剂的淬灭效果。然而，对于双链体DNA，淬灭效果可以更显著和清晰。通常，系统中存在的任何游离标记将不会受到DNA双链体结合剂的淬灭，因为它们之间不会形成结合。
加入反应混合物中的DNA双链体结合剂的量适宜地足够导致可以测量的来自荧光标记的信号的淬灭，但是不足以抑制扩增。实现该目的的浓度范围根据所用的具体DNA双链体结合剂而变，并且可以通过下文中阐明的常规方法确定。对于DNA双链体结合剂如米托蒽醌或柔红霉素，将使用1μM到100μM，适宜地约10μM-25μM的浓度。对于Draq5，约1μM到100μM，优选约50μM的浓度可有效淬灭单标记的荧光素探针。可能需要更高浓度，例如，1mM ApoptrakTM以令人满意地淬灭荧光素标记的探针。
本发明的方法在其应用中非常灵活。该方法可用于产生关于样品中靶核酸序列的定量和定性数据，如下文中更详细讨论的。具体地，本发明不仅提供了用于定量扩增，而且还可以用于额外或备选地得到特征性数据，如双链体去稳定温度或解链温度。
在本发明方法中，在扩增反应之前、期间或之后，样品可以被置于探针与样品能够杂交的条件下。因此该方法允许以同质的方式实现检测，因为可以在最初加入所有试剂的单个容器中实施扩增和监测。不需要随后的试剂加入步骤。也不需要在固体支持体(尽管这是一种选择)存在下实现该方法。
探针可含有核酸分子，如DNA或RNA，当靶核酸序列是单链形式时，探针将与靶核酸序列杂交。在该情况中，步骤(c)将包括使用使得靶核酸单链化的条件。
探针可以是在溶液中游离的或者被固定到固体支持体上，例如，固定到用于分离产物的珠子，如磁珠的表面，或者检测装置，如表面胞质团共振检测器表面的导波管的表面。该选择将取决于所考虑的具体测定的性质和所用的具体检测方法。
具体地，所用的扩增反应将包括将样品置于一定条件下，在该条件下，样品中存在的任何靶核酸序列都变成单链。这些扩增反应包括聚合酶链式反应(PCR)或连接酶链式反应(LCR)，但是优选PCR反应。
在扩增反应期间如果遇到适宜的杂交条件，探针可能杂交。
在优选实施方案中，可以设计探针使得在扩增反应的每一循环期间这些条件都被满足。从而，在扩增反应的每个循环期间的某一点，探针将与靶序列杂交，并且由于探针与被捕获在探针和靶序列之间的DNA双链体结合剂的紧密接近，荧光信号将被淬灭。随着扩增的进行，探针将与靶序列分开或者熔解，因此探针产生的信号将被恢复。因此，在扩增的每个循环中，探针退火时产生来自荧光标记的荧光峰。该峰的强度将随着扩增的进行而减弱，因为更多的靶序列可以被用来结合该探针。
通过监测每个循环期间样品中荧光标记的荧光，可以以各种方法监测扩增反应的进展。例如，通过例如，计算熔解峰下面的面积可以分析熔解峰提供的数据并将该数据对循环数作图。
使用公知的荧光计适宜地监测荧光。由此而来的荧光信号(例如，以光电倍增管电流形式)被送到数据处理板并被转化成与每个样品管相关的波谱。可以同时评估多个管，例如，96个管。在反应期间可以以该方法经常地，例如每10ms一次收集数据。
该数据提供了定量样品中存在的靶核酸的量的机会。
此外，探针杂交的动力学将允许绝对地确定靶序列浓度。来自样品的荧光的变化可以允许计算探针与样品的杂交速率。杂交速率的增加将与样品中存在的靶序列的量有关。
由于随着扩增反应的进行靶序列浓度增加，探针的杂交将发生地更快。从而，该参数也可用作定量的基础。这种数据处理模式是有用的，因为其不依赖于信号强度来提供该信息。
适宜的荧光标记是罗丹明染料或者其他染料，如Cy5、Cy3、Cy5.5、荧光素或其衍生物。具体衍生物是商标名为FAM的羧基荧光素化合物，如5-羧基荧光素、6-羧基荧光素，或它们的琥珀酰亚胺酯。
荧光标记的选择将通常与吸收剂的选择有关。显然，标记的荧光应该在可以被嵌入剂吸收的范围内。
米托蒽醌、柔红霉素、Draq5和Apoptrak是荧光素和其衍生物，尤其FAM化合物的尤其好的淬灭剂。
可以以常规方式将标记附着到探针。荧光素标记在探针中的位置是不重要的，尽管通常它们将位于探针的末端区域。
优选地，它们位于探针的3’末端，因为它们将作为空间或化学封闭剂，用以防止扩增期间探针被聚合酶延伸。这可避免采取其他措施，如磷酸化，以便在扩增反应期间封闭探针的3’末端。
可能设计探针和测定条件使得探针被用于扩增反应的DNA聚合酶水解，从而释放荧光素标记。
在该情况中，将设计探针以在PCR反应的退火和延伸相期间结合，并且用于测定法中的聚合酶将具有5’-3’外切核酸酶活性。所释放的荧光素标记产生增加的信号，因为该信号不再被DNA双链体结合剂淬灭。因此，在该情况中，通过观察游离荧光素标记的不断增加的信号可以监测反应。必须在高于探针与靶标或产物相互作用温度的温度下监测信号。
然而，在该测定中探针不必以这种方式被消耗，因为实现信号产生可以不用解离探针。
为了实现完全可逆信号，该信号与反应的每个阶段存在的扩增产物的量直接相关，和/或反应速度最重要时，例如，在快速PCR中，优选设计探针使得其从靶序列完整释放。该释放可以例如，在扩增反应的延伸相期间。然而，因为该信号不依赖于探针水解，可以设计探针在扩增循环的任一阶段杂交和熔解。例如，在不同于循环的延伸相的一个阶段杂交最强烈的探针将确保对扩增反应的干扰最小。
当使用在延伸温度或低于延伸温度时强烈结合的探针时，使用缺少5’-3外切核酸酶的酶，如Taq或Pwo的Stoffle片段作为扩增反应的聚合酶可以实现探针从靶序列的完整释放。
然后探针可以再次参与反应，并因此代表探针的经济应用。
可以以各种方法解释用可逆地杂交靶标并不被水解的探针产生的数据。在最简单的形式中，扩增反应期间或结束时探针退火温度时荧光标记的荧光的减少表明所存在的靶序列量增加了，表明扩增反应已经进行了并且因此样品中实际上存在靶序列。
然而，如上面所概述的，通过监测整个扩增反应也可能定量。
最后，可能得到特征数据，尤其解链温度分析(作为终点测量或全部过程的测量)，以便得到关于序列的信息，下面将进一步讨论。
从而，本发明的优选实施方案包括检测核酸扩增的方法，该方法包括在(a)核酸聚合酶(b)能够杂交靶多核苷酸的至少一种引物，(c)能够结合所述靶多核苷酸序列并且含有荧光标记的寡核苷酸探针和(d)能够从所述荧光标记吸收荧光能量，并且不发射可见光谱范围内的光的DNA双链体结合剂存在下对靶多核苷酸实施核酸扩增，并监测扩增反应期间荧光的变化。
适宜地使用一对引物实施扩增，这些引物被设计使得仅DNA链内的靶核苷酸序列被扩增，这是本领域中熟知的。核酸聚合酶适宜地为热稳定的聚合物，如Taq聚合酶。
可以实施扩增反应的适宜条件是本领域中熟知的。在每种情况下最佳条件是可变的，其取决于有关的具体扩增子、所用的引物的性质和所用的酶。技术人员在每种情况中可以确定最优条件。典型的变性温度为95℃，典型的退火温度为55℃，延伸温度为72℃。
适宜地，在整个扩增过程，并优选在每个扩增循环期间的至少相同点监测荧光。具体地，需要在探针与靶标退火时的温度时监测荧光。例如，可以是在约60℃温度时。
随着更多靶标形成，更多探针与靶标退火，并且由于探针与DNA双链体结合剂的紧密接近而被淬灭。荧光的减小表明扩增的进行。
聚合酶，诸如样品中存在的TAQTM聚合酶将具有从靶标除去探针的效果。在聚合酶的亚最佳温度，如探针退火温度时低水平发生该效果。因此在该温度，这两种反应(探针在其退火温度的结合和聚合酶从靶标除去探针的效果)将竞争。通常，前一反应将对于许多反应循环占优势，从而使得可以监测扩增反应。然而，最后，可以观察到荧光的升高，此时平衡偏移并且聚合酶的效果占优势。因此，这些结果可以揭示一种“钩子”效应，该效应由扩增反应结束时荧光的上升导致。
可以对用本发明方法得到的数据进行处理以监测扩增反应的进行，并可以因此用于定量样品中存在的靶标的量。
为了解释所得数据，有必要做出一些调节。例如，在常规PCR监测反应(如WO 99/28500中描述的)中，PCR反应将导致荧光的指数上升，因此需要从所得最低值得到背景荧光的基线调节。
相反，在本申请的方法中，PCR反应的进行将导致荧光的指数下降，因为越来越多标记的探针被DNA双链体结合剂淬灭。因此，需要基于所达到的荧光的最高水平调节基线。
这可适宜地通过从样品反应采集数据并将下面的方程式应用于每个数据点来进行y＝1/xz＝y-MIN其中x是来自PCR仪器，如LightCyler的数据点，Z为基线调节的数据点，MIN为整个数据集中y的最小值。Z对循环数的作图将允许对适宜的基线调节进行计算。
该方法可用于杂交测定法中以确定特定序列的特征。
从而在另一方面，本发明提供了确定序列的特征的方法，所述方法包括a)向怀疑含有所述序列的样品加入对所述靶序列特异的荧光标记的探针和DNA双链体结合剂，该DNA双链体结合剂能够吸收来自探针上荧光标记的荧光但是不发射可见光谱范围内的辐射，b)将所述样品置于所述探针与靶序列杂交的条件下，c)监测所述样品的荧光并确定所述序列的特征性反应条件，在该条件下荧光的变化是探针与样品的杂交或者探针和靶核酸序列之间形成的双链体去稳定化。
适宜的反应条件包括温度、电化学或对特定酶或化学品存在的反应。通过监测这些性质的改变导致荧光的变化，可以确定序列的精确性质的特征性信息。例如，对于温度，可以确定探针分离或者从靶序列“熔解”的温度。这可非常适用于例如，检测和如果希望，定量序列中的多态性，包括基因诊断中等位基因变异。“多态性”包括在序列中，尤其自然情况下可以发生的转换、颠换、插入、缺失或倒位。
如果靶序列仅一个碱基对不同，那么探针熔解的滞后现象将不同。从而，当样品仅含有一种等位基因变体时，探针的熔解温度将是一个具体值，其将与仅含有另一等位基因变体的样品中发现的值不同。含有两种等位基因变体的样品呈现相应于每种等位基因变体的两个熔解温度。
类似的考虑应用于电化学性质，或者某些酶或化学品的存在。探针可以固定在固体表面，在该固体表面可以应用电化学电位。在特定电位值靶序列将结合探针或者被探针排斥，这取决于该序列的精确性质。
该实施方案可以与扩增反应，如上面提到的PCR反应联合实现，或者其可以单独使用。
本发明的其他方面包括用于本发明方法中的试剂盒。这些试剂盒将含有DNA双链体结合剂，其能够吸收在探针上发现的荧光标记的荧光能量，但是不能发射可见光谱范围内的光。试剂盒的其他可能的组分包括用于扩增反应的试剂，如DNA聚合酶(包括用于“热启动”反应的化学修饰的TAQ)、引物、缓冲液和公知改善PCR过程的辅助剂，如“热启动”试剂，如抗Taq抗体，或者焦磷酸盐和焦磷酸酶，如待决国际专利申请PCT/GB02/01861中描述的。试剂盒可额外或备选地包括靶序列的被荧光标记的探针。
试剂盒可以包括所有试剂在单个容器中，或者一些试剂可以在分离的容器中，它们在现场混合。
另一方面，本发明提供了可以吸收荧光能量但是不发射可见光的DNA双链体结合剂在检测样品中靶核酸序列的存在的方法中的用途。
适宜的方法如上面定义。DNA双链体结合剂的具体实例也如上面描述。
本发明现在将通过实施例参考附图具体描述本发明，这些附图中
图1用图解法显示了使用本发明方法发生的相互作用；图2阐明了按照本发明的扩增反应期间的阶段；图3显示了按照本发明的扩增反应的结果，用退火步骤末产生的荧光的倒数对循环数作图，并阐明了1∶100的0.0193M米托蒽醌对人胎盘DNA的3次10倍稀释液的影响；图4显示了纯(neat)(0.0193M)米托蒽醌的10倍稀释系列对CTW19探针的淬灭效果；图5显示了纯(5nM)柔红霉素的10倍稀释系列对CTW19探针的淬灭效果；图6阐明了在FAM标记的探针存在下实施PCR反应时各种浓度的暗淬灭剂对荧光的影响。
本发明方法的一个要素是探针(1)，它优选在3’末端携带荧光标记(2)。该探针可以特异结合靶序列，将该探针与DNA双链体结合剂(3)一起加到被怀疑含有靶序列的样品。
当探针(1)在溶液中是游离的时候，荧光标记(2)将发荧光。一些DNA双链体结合剂可以与探针结合，这可以轻微淬灭信号，但是淬灭的水平是低的(图1A)。然而，当探针(1)与单链靶序列(4)杂交而形成如图1B中所示双链体时，DNA双链体结合剂(3)与双链体结合并因此与荧光标记紧密接近。来自标记的荧光能量传递给DNA双链体结合剂(3)，并因此来自样品的荧光被减小或淬灭。从而标记的荧光的减小表明探针与靶序列的杂交。
从而通过测量标记的荧光的减小(例如，随着温度降低)，可以检测发生杂交的点。类似地，随着温度增加，在探针(1)从靶序列(4)熔解时，将发生标记荧光增加，因为该标记不再受DNA双链体结合剂的影响。
熔解温度将根据探针和靶序列的杂交特征而变。例如，与靶序列完全互补的探针将在与靶序列杂交但是含有一个或多个错配的探针不同的温度下熔解。
图2阐明了本发明的方法怎样可用于扩增反应如PCR反应中。探针(1)将联合DNA双链体结合剂(3)与单链DNA杂交并从而标记信号将被淬灭(图2A)。在所阐明的实施方案中，这在循环的退火相期间发生，在该期间引物(5)退火。随着扩增导致的靶序列的量增加，更多双链体形成，这些双链体掺入探针以及DNA双链体结合剂，导致退火相期间标记产生的信号减小。
延伸相期间，因为DNA聚合酶代替探针，探针被从靶序列除去。在该点，因为探针离开DNA双链体结合剂，标记信号增强(图2B)。
通过监测来自标记的荧光，可以跟踪扩增反应的进行并确定原始样品中存在的靶序列的量。
实施例1 PCR扩增反应使用人β珠蛋白基因的Carl Wittwer测定法检验本发明的方法。在每种情况中，下面的实验方案如下
首先，制备含有下面组分的2×Master混合制剂2×Master混合制剂2000μl 500mM Tris pH8.8，2000μl 2mM dUTP核苷酸250μl 20mg/ml B.S.A1600μl甘油200μl 1单位/μl尿嘧啶-N-糖基化醇160μl 5单位/μl Taq聚合酶3190μl HPLC级水600μl 0.1M氯化镁溶液然后制备适于实施Carl Wittwer测定法的PCR混合制剂，其含有下面的组分PCR混合制剂50μl 3mM Mg2+的2×Master混合液10μl 10μM正向引物(PCO3)10μl 10μM反向引物(PCO4)10μl 2μM探针(CTW19)5μl HPLC级水5μl 10μM米托蒽醌引物序列(PCO3)ACA CAA CTG TGT TCA CTA GC引物序列(PCO4)CAA CTT CAT CCA CGT TCA CCCTW19CAA ACA GAC ACC ATG GTG CAC CTG ACT CCT GAG GAT(3’荧光素)该PCR混合制剂共90μl。然后将混合物充分涡旋并分成2×45μl。向其中之一加入5μl HPLC水作为无模板对照(NTC’s)，向另一份加入5μl人胎盘DNA(各种浓度)作为阳性反应物。然后将这些2×50μl进一步分成4×20μl并移液到Lightcycler毛细管中以产生双份NTC’s和双份+’s。
应该为每个实验中试验的变量的每个值制备上面的混合物。
然后将毛细管旋下(spin down)并以下面的循环程序在RocheLightcycler上运行遗留防止(carry over prevention)×150℃60秒95℃15秒循环×5095℃5秒60℃5秒。在该步骤收集F1通道(530nm)的荧光74℃5秒熔解分析×150℃15秒以0.1℃/秒缓慢升高到95℃。在该步骤中收集F1通道(530nm)的荧光典型结果在图3中显示。
图3图解了对于10倍稀释系列，高于背景信号的可区别信号。最适PCR(其中将发生指数扩增)中靶模板的10倍稀释将导致每个循环扩增子的数目增加2。用于检测扩增子浓度(并推论出靶标的最初量)的探针系统将产生信号，这些信号将高于任意循环值处的背景，这些循环值对于PCR功能范围内的每个10倍稀释相隔～3.31个循环。这在图3有明确显示。
实施例2 确定DNA双链体结合剂的最佳浓度用各种浓度的DNA双链体结合剂米托蒽醌和柔红霉素重复实施例1中描述的PCR反应。结果分别在图4和5中显示。从这些图可清楚地看出出现代表扩增反应的清晰信号，其中起始米托蒽醌物质(0.0193M)被以1∶100有效稀释后加入反应混合物而被1∶20稀释，导致终浓度为约10μM。
类似地，将5mM柔红霉素起始物以1∶10稀释后进一步稀释(1∶20)到PCR反应混合物中。该情况下终浓度为25μM。
实施例3 其他淬灭性DNA结合剂的鉴定步骤1 吸收剂的鉴定使用下面的方法鉴定了可用于吸收荧光能量的许多其他DNA双链结合剂。
制备潜在淬灭剂的10倍稀释系列并将5μl每种稀释液加到下面的PCR反应混合物中。
PCR混合制剂50μl 3mM Mg2+的如实施例1中定义的2×Master
混合液10μl 10μM正向引物(PCO3)10μl 10μM反向引物(PCO4)5μl Sybr Gold10μl HPLC级水5μl各种浓度的暗淬灭剂然后将它进行如实施例1中描述的扩增反应。该实验的目的是为两方面，首先确定混合物中包括潜在淬灭剂是否将抑制PCR并且如果抑制在怎样的浓度下抑制。其次，我们可以看到混合物中包括潜在淬灭剂是否减小(淬灭)了Sybr Gold的荧光(通过比较用不含有淬灭剂的对照运行得到的基线和最大荧光)。它们之间这两个结果使得可以确定潜在分子可尤其用作DNA双链体结合剂的浓度范围，这些DNA双链体结合剂可以作为暗淬灭剂。
然而，Sybr Gold信号的减弱可以是由于潜在淬灭剂与Sybr Gold竞争(out-competing)小沟中的结合位点。尽管难以说出这和淬灭(或者两者一起)之间的差异，但是其仍然是有益的观察，其将表示潜在淬灭剂实际上可以嵌入。
然后将以这种方法鉴定的潜在淬灭剂进行下面的实验以阐明这一问题。
步骤2 用FAM标记的探针试验完全暗淬灭剂形式的潜在分子使用实验1中建立的潜在淬灭剂的更窄的浓度范围，将所有选择的潜在淬灭剂加入下面的混合物PCR混合制剂50μl 3mM Mg2+的2×Master混合液10μl 10μM正向引物(PC03)10μl 10μM反向引物(PC04)10μl 2μM探针(CTW19)5μl HPLC级水5μl通过实验1缩小的各种浓度的暗淬灭剂然后将它进行如实施例1中描述的扩增，并监测荧光。产生图6中图解类型结果的那些淬灭剂，选择指数线性的有效部分用于进一步评估。
如果没有观察到效果，则保留潜在淬灭剂用于使用备选染料如Cys(其在565nm发荧光)和Cy5.5(其在694nm发荧光)的试验中。
PCR仪器的基线调节功能将使曲线偏移(如图6中)，因为这些仪器从反应的错误末端扣除。这可以通过输出原始数据并应用基线调节公式进行校正，该基线调节公式已经被调节用于处理如上面概述的荧光的减弱而不是增强。
步骤3 定量效果在试验2中成功的潜在淬灭剂被包括在一个试验中，该试验使用靶DNA的10倍稀释系列。随后稀释液之间CT值的3.3个循环的差异表明该效果直接与靶DNA的量有关并且因此也与PCR方法有关。
PCR混合制剂50μl 3mM Mg2+的2×Master混合液10μl 10μM正向引物(PCO3)10μl 10μM反向引物(PCO4)10μl 12μM探针(CTW19)5μl HPLC级水5μl通过实验1)和2)定义的浓度的暗淬灭剂然后如实施例1中描述的扩增该混合物，被改变的变量是靶DNA的浓度(我们的10-倍系列)。仅运行一组非靶标对照(NTCs)。
使用该方案，米托蒽醌、柔红霉素、Draq5TM和ApoptrakTM被鉴定为有用的暗淬灭剂。
权利要求
1.检测样品中靶核酸序列存在的方法，所述方法包括a)向被怀疑含有所述靶核酸序列的样品加入对所述靶序列特异的荧光标记的探针，和DNA双链体结合剂，该结合剂可以吸收来自探针上荧光标记的荧光能量但是不发射可见光，b)将所形成的混合物进行扩增反应，在扩增反应中靶核酸被扩增，c)将所述样品置于所述探针与靶序列杂交的条件下，和d)监测来自所述样品的荧光。
2.根据权利要求1的方法，其中DNA双链体结合剂具有稠合的共轭环系统。
3.根据权利要求1或2的方法，其中DNA双链体结合剂是米托蒽醌(1，4-二羟基5，8-二[[2-[(2-羟乙基)氨基]乙基]氨基]-9，10-蒽二酮)或者其盐，如盐酸盐或二盐酸盐，或诺加霉素(2R-(2α，3β，4α，5β，6α，11β，13α，14α)]-11-[6-脱氧-3-C-甲基-2，3，4-三-O-甲基-α-L-吡喃甘露糖基)氧基]-4-(二甲基氨基)-3，4，5，6，9，11，12，13，14，16-十氢-3，5，8，10，13-五羟基-6，13-二甲基-9，16-二氧代-2，6-环氧-2H-四并苯并[1，2-b]oxocin-14-甲酸甲酯)，或柔红霉素(8S，-顺式)-8-乙酰基-10[3-氨基-2，3，6-三脱氧-α-L-来苏-吡喃己糖基)氧]-7，8，9，10-四氢-6，8，11-三羟基-1-甲氧基-5，12-四并苯二酮)。
4.根据权利要求3的方法，其中DNA结合剂是米托蒽醌。
5.根据权利要求1或2的方法，其中DNA结合剂是式(I)化合物 其中R1、R2、R3和R4独立地选自氢、X、NH-ANHR和NH-A-N(O)R’R”，其中X为羟基、卤素、氨基、C1-4烷氧基或C2-8烷酰氧基，A为C2-4亚烷基，NH与NHR或N(O)R’R”之间的链长为至少2个碳原子并且R、R’和R”每一个独立地选自C1-4烷基和C2-4羟基烷基和C2-4二羟基烷基，条件是与氮原子连接的碳原子不携带羟基，以及没有碳原子被两个羟基取代；或者R’和R”一起为C2-6亚烷基，该亚烷基与R’和R”所连接的氮原子一起形成具有3到7个原子的杂环，条件是R1、R2、R3和R4中的至少一个是基团NH-A-N(O)R’R”。
6.根据前面权利要求任一项的方法，其中靶核酸在步骤(c)与探针杂交前被单链化。
7.根据前面权利要求任一项的方法，其中扩增反应是聚合酶链式反应(PCR)。
8.根据前面权利要求任一项的方法，其中在扩增反应的每个循环期间探针与靶核酸杂交。
9.根据权利要求8的方法，其中在扩增反应整个过程中监测来自样品的荧光。
10.根据权利要求9的方法，其中产生的荧光数据被用于确定探针杂交的速率。
11.根据权利要求8到10任一项的方法，其中荧光数据被用于测定样品中存在的靶核酸的量。
12.根据前面权利要求任一项的方法，其中荧光标记是罗丹明染料、Cy5、荧光素或荧光素衍生物。
13.根据前面权利要求任一项的方法，其中荧光标记附着到探针的末端区域。
14.根据权利要求13的方法，其中荧光标记被附着到探针的3’末端并防止聚合酶对探针的延伸。
15.根据前面权利要求任一项的方法，其中设计探针使得在非延伸相的扩增过程的相期间探针从靶序列完整释放。
16.根据前面权利要求1到14任一项的方法，其中在扩增过程的延伸相期间通过聚合酶的作用使探针从靶序列完整释放，并且使用缺少5’-3’外切核酸酶活性的聚合酶实现扩增反应。
17.根据权利要求1的方法，其包括在(a)核酸聚合酶(b)能够杂交所述靶多核苷酸的至少一种引物，(c)能够结合所述靶多核苷酸序列并且含有荧光标记的寡核苷酸探针和(d)能够从所述荧光标记吸收荧光能量并且不发射可见光谱范围内的光的DNA双链体结合剂的存在下对靶多核苷酸实施核酸扩增，并监测扩增反应期间荧光的变化。
18.根据权利要求17的方法，其中使用一对扩增引物适宜地实施扩增。
19.根据权利要求17或权利要求18的方法，其中核酸聚合酶是热稳定聚合酶。
20.根据前面权利要求任一项的方法，其中在另一步骤中，实施杂交分析并检测序列的特征性杂交条件。
21.根据权利要求20的方法，其中条件是温度、电化学电位，或者与酶或化学品的反应。
22.根据权利要求21的方法，其中条件是温度。
23.根据权利要求22的方法，该方法用于检测靶序列中等位基因变异或多态性。
24.确定序列特征的方法，所述方法包括a)向怀疑含有所述序列的样品加入对所述靶序列特异的荧光标记的探针和DNA双链体结合剂，该DNA双链体结合剂能够吸收来自探针上荧光标记的荧光但是不发射可见光谱范围内的辐射，b)将所述样品置于所述探针与靶序列杂交的条件下，c)监测所述样品的荧光并确定所述序列的特征性反应条件，在该条件下荧光变化是探针与样品杂交或者探针和靶核酸序列之间形成的双链体去稳定化的结果。
25.根据权利要求24的方法，其中所述序列的特征性反应条件是温度、电化学电位，或者与酶或化学品反应。
26.根据权利要求25的方法，其中条件是温度。
27.根据权利要求24到26任一项的方法，其中比较从两个序列得到的结果以确定它们之间多态性或变异的存在。
28.根据权利要求24到27任一项的方法，其中DNA双链体结合剂是米托蒽醌(1，4-二羟基5，8-二[[2-[(2-羟乙基)氨基]乙基]氨基]-9，10-蒽二酮)或者其盐，如盐酸盐或二盐酸盐，或诺加霉素(2R-(2α，3β，4α，5β，6α，11β，13α，14α)]-11-[6-脱氧-3-C-甲基-2，3，4-三-O-甲基-α-L-吡喃甘露糖基)氧基]-4-(二甲基氨基)-3，4，5，6，9，11，12，13，14，16-十氢-3，5，8，10，13-五羟基-6，13-二甲基-9，16-二氧代-2，6-环氧-2H-四并苯并[1，2-b]oxocin-14-甲酸甲酯)或柔红霉素(8S，-顺式)-8-乙酰基-10[3-氨基-2，3，6-三脱氧-α-L-来苏-吡喃己糖基)氧]-7，8，9，10-四氢-6，8，11-三羟基-1-甲氧基-5，12-四并苯二酮)。
29.根据权利要求24到27任一项的方法，其中DNA双链体结合剂是如权利要求5所限定的式(IA)的化合物。
30.用于根据前面权利要求任一项的方法中的试剂盒，该试剂盒含有(1)DNA双链体结合剂，其能够吸收荧光能量，但是不发射可见光谱范围内的辐射，和(ii)对靶核苷酸序列特异的荧光标记的探针，或(iii)实施扩增反应所需的一种或多种试剂。
31.根据权利要求30的试剂盒，其含有(iii)并且其中试剂选自引物、DNA聚合酶、缓冲液，或者公知改善PCR的辅助剂。
32.根据权利要求30或权利要求31的试剂盒，其中DNA双链体结合剂是米托蒽醌(1，4-二羟基5，8-二[[2-[(2-羟乙基)氨基]乙基]氨基]-9，10-蒽二酮)或者其盐，如盐酸盐或二盐酸盐，或诺加霉素(2R-(2α，3β，4α，5β，6α，11β，13α，14α)]-11-[6-脱氧-3-C-甲基-2，3，4-三-O-甲基-α-L-吡喃甘露糖基)氧基]-4-(二甲基氨基)-3，4，5，6，9，11，12，13，14，16-十氢-3，5，8，10，13-五羟基-6，13-二甲基-9，16-二氧代-2，6-环氧-2H-四并苯并[1，2-b]oxocin-14-甲酸甲酯)或柔红霉素(8S，-顺式)-8-乙酰基-10[3-氨基-2，3，6-三脱氧-α-L-来苏-吡喃己糖基)氧]-7，8，9，10-四氢-6，8，11-三羟基-1-甲氧基-5，12-四并苯二酮)。
33.根据权利要求30或权利要求31的试剂盒，其中DNA双链体结合剂是如权利要求5所限定的式(IA)的化合物。
34.根据权利要求28到33任一项的试剂盒，其含有(i)和(ii)。
35.可以吸收荧光能量但是不发射可见光的DNA双链体结合剂在检测样品中靶核酸序列的存在的方法中的用途。
36.根据权利要求35的用途，其中DNA双链体结合剂含有共轭芳香环系统。
37.根据权利要求36的用途，其中DNA双链体结合剂包括蒽环或蒽醌。
38.根据权利要求35到37任一项的用途，其中DNA双链体结合剂是结构(I)的任选取代的蒽醌 其中R1、R2、R3和R4独立地选自氢、官能团，或任选被例如官能团取代的烃基，或者R1和R2或R3和R4任选连接在一起形成环，该环任选含有杂原子，和/或任选被官能团或烃基取代。
39.根据权利要求35到38任一项的用途，其中DNA双链体结合剂是米托蒽醌(1，4-二羟基5，8-二[[2-[(2-羟乙基)氨基]乙基]氨基]-9，10-蒽二酮)或者其盐，如盐酸盐或二盐酸盐，或诺加霉素(2R-(2α，3β，4α，5β，6α，11β，13α，14α)]-11-[6-脱氧-3-C-甲基-2，3，4-三-O-甲基-α-L-吡喃甘露糖基)氧基]-4-(二甲基氨基)-3，4，5，6，9，11，12，13，14，16-十氢-3，5，8，10，13-五羟基-6，13-二甲基-9，16-二氧代-2，6-环氧-2H-四并苯并[1，2-b]oxocin-14-甲酸甲酯)或柔红霉素(8S，-顺式)-8-乙酰基-10[3-氨基-2，3，6-三脱氧-α-L-来苏-吡喃己糖基)氧]-7，8，9，10-四氢-6，8，11-三羟基-1-甲氧基-5，12-四并苯二酮)。
40.根据权利要求35到38任一项的用途，其中DNA双链体结合剂是如权利要求5所定义的式(IA)的化合物。
41.根据权利要求39的用途，其中DNA双链体结合剂是米托蒽醌。
全文摘要
检测样品中靶核酸序列存在的方法，所述方法包括(a)向被怀疑含有所述靶核酸序列的样品加入对所述靶序列特异的荧光标记的探针，和DNA双链体结合剂，该结合剂可以吸收来自探针上荧光标记的荧光能量但是不发射可见光，(b)将所形成的混合物进行扩增反应，在扩增反应中靶核酸被扩增，(c)将所述样品置于所述探针与靶序列杂交的条件下，和(d)监测来自所述样品的荧光。该方法可用于例如监测扩增反应，如PCR反应，从而可以确定样品中存在的靶序列的量。额外或备选地，该方法可用于产生双链体去稳定数据，如熔解滞后信息，它们用于扩增监测或检测和定量多态性或等位基因变异，并因此可用于基因诊断。
文档编号C12Q1/68GK1723288SQ200380105600
公开日2006年1月18日 申请日期2003年10月10日 优先权日2002年10月10日
发明者M·A·李, M·巴斯彻, T·布郎 申请人:英国国防部