专利名称：人源干细胞生物活性物质及其制备与应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及从健康人的脐带组织和脐带血中提取干细胞，经体外培养、扩增，然后利用此类干细胞制备生物活性物质并应用。
背景技术：
干细胞(Stem Cell)是一类具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能的细胞群体， 是形成人体各种组织、器官的“祖宗细胞”、“万能细胞”。根据其发育阶段可分为胚胎干细胞和成体干细胞，根据分化潜能大小又可以分为全能干细胞、多能干细胞和单能干细胞。间充质干细胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)是一类具有多向分化潜能的组织干细胞，可以从骨髓、外周血、脂肪及皮肤等多种组织中获得，作为一类多能干细胞，它可以向骨、软骨、肌肉、神经及胰岛样细胞等方向增殖分化。目前MSCs主要来源于成人骨髓， 但成人骨髓MSCs细胞数量及增殖分化潜能随供体年龄的增加而下降，病毒感染率较高，且采集具有创伤，使其来源受限。最近，已开发出从脐带提取MSCs，它也是一类具有多向分化潜能的干细胞，越来越多的研究表明其极具开发潜质，与骨髓MSCs相比具有明显的优势 (1)来源充足，取材方便，成本低廉；( 人脐带间充质干细胞含量丰富，较为原始，分化能力强，可在体外进行分离、培养，扩增迅速，且生物学性状稳定，多次传代扩增仍能保持旺盛功能，可以提供充足的细胞来源；C3)免疫原性极低，免疫排斥的概率极低，且脐带间充质干细胞还具有一定的免疫抑制功能；(4)脐带间充质干细胞可以支持造血和促进移植。作为造血微环境主要细胞成分-基质细胞系的干/祖细胞，间充质干细胞通过细胞对细胞的直接作用、分泌细胞外基质及多种细胞因子，实现对造血的精细调控，支持造血干细胞的生长。造血干细胞(Hematopoietic stem cells,HSCs)是一类存在于造血组织中的多能干细胞，可以定向分化、增殖为不同的血细胞系，并进一步生成血细胞。造血干细胞在治疗白血病、恶性肿瘤、重症非恶性血液系统疾病以及某些遗传性疾病中有广泛的应用。造血干细胞根据来源又可分为骨髓造血干细胞、外周血造血干细胞和脐带血造血干细胞。与骨髓和外周血造血干细胞相比，脐血造血干细胞更为原始，自我增殖能力最强，且脐带血具有采集方便、细胞免疫不成熟、移植过程中不需要严格配型等优点，因而脐带血造血干细胞具有极大的临床应用价值。间充质干细胞与造血干细胞共同移植可促进造血干细胞的植入，对于提高造血干细胞的移植成功率有重要意义。干细胞可以产生和分泌大量的生物活性因子，这些干细胞生物活性因子可有效调控机体细胞信号传导、活化人体干细胞，进而生理性修复或替代机体损伤、病变及衰老的细胞。例如干细胞可以产生干细胞生长因子(SCF)、神经生长因子(NGF)、基质细胞源性生长因子(SDF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、表皮生长因子(EGF)、白介素-6与自介素-7(IL-6与IL-7)、巨核细胞集落刺激因子(M-CSF)、肿瘤坏死因子(TNF)、干扰素(IFN)等因子，这些细胞因子具有促进细胞增殖、分化、抗凋亡等功能；干细胞还可以产生天然免疫蛋白，例如IgG、IgA、IgM、IgD、IgE等， 可以抵御或修复自身和外界因素对机体细胞造成的损伤。
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研究表明人体骨髓、血管、脂肪组织、骨骼肌、心脏和大脑，也包括在肺、肝、胰腺、 消化道、皮肤、视网膜、乳房、卵巢、前列腺和睾丸的上皮内均可分离到相应的干细胞。理论上，干细胞可以修复身体任何部位的组织缺损，可以利用干细胞去治疗遗传疾病、恶性疾病和退变性疾病等。2007年10月10日，国际干细胞权威杂志《Cell》系列刊物《Cell-Mem Cell))的研究论文揭示干细胞功能下降可导致人类衰老，并证明干细胞衰老过程是受到外在和内在因素共同调控的。鉴于上，我们研究开发从人脐带组织和脐带血中提取干细胞，经体外培养、扩增， 然后提取其生物活性物质，利用这两类干细胞活性物质组合物发挥综合效应，活化人体自身干细胞来生理性修复或替代机体损伤、病变和衰老的组织细胞。
发明内容
本发明的目的是1、提供一种可以活化机体干细胞的生物活性物质组合物；2、提供干细胞生物活性物质组合物的制备方法；3、提供干细胞生物活性物质组合物的用途。本发明的技术方案如下从健康人的脐带和脐带血中提取干细胞，使之在体外培养、扩增，并维持干细胞的高增殖能力和稳定性状。脐带干细胞体外最多传代至第5代，此时收集的干细胞不但产量高、活性强，而且生物学性状稳定；脐带血干细胞体外培养、扩增单次周期为10 11天，此时的收集则造血干细胞比例高，且分化程度低。将两种来源干细胞以一定比例组合，调整细胞至合适浓度密封于冻存管中，经超低温液氮反复冻融至细胞破碎，再通过低温分离、纯化等现代生物技术手段，即可获得高纯度的干细胞生物活性物质群组合物。整个过程要求无细菌、真菌、病毒和支原体等污染。本发明获得的干细胞主要为间充质干细胞和造血干细胞，制备的生物活性物质富含干细胞因子群、多肽、天然免疫蛋白和核酸等，该生物活性物质群可促进机体干细胞增殖、分化，活化机体干细胞，提高身体免疫力和抗衰老作用。该干细胞生物活性物质群组合物可制成针剂、涂剂、膏剂、霜剂或粉剂等，在医学、保健和美容领域有极佳的应用前景。本发明与现有产品或技术相比具有明显优势第一，克服了现有技术直接从脐带或胎盘等组织中提取的有效生物活性物质纯度、产量和活性不高的缺点，本发明从脐带和脐带血提取的干细胞进行培养、扩增，收集高产量、高纯度的干细胞，利用超低温等现代技术进行提取、分离、纯化，从而获得高纯度、高产量和高活性的干细胞生物活性物质；第二， 克服了现有研究提取干细胞分泌产物的不足，因为分泌物为细胞代谢的产物，易抑制细胞增殖和产生毒副作用，而大部分干细胞活性物质主要存在细胞内，并不分泌到细胞外，鉴于此，本发明提取细胞内生物活性物质；第三，本发明将间充质干细胞和造血干细胞的生物活性物质加以组合，使之发挥更大的综合效应。
具体实施例方式实施例1、脐带组织干细胞制备从健康人的脐带组织提取干细胞，脐带组织获得的干细胞包括但不限于间充质干细胞，获得的干细胞进行体外培养、扩增。原代细胞收集后按1 2比率进行传代培养，当细胞约80%汇合时，利用胰酶进行消化、收集，按相同的比率进行传代，最多传代培养至第5代，收集5代以内的细胞。此时收集的干细胞生物学性状稳定，增值能力强。具体过程如下①采集健康人的脐带；②去掉脐带内血管和外层薄膜；③将脐带组织剪切成1 2mm3大小的小块；④将剪切后小块种植于加有DMEM/F12培养液的培养皿(直径为100mm)中，置于 37°C、饱和湿度、5% CO2培养箱中培养；⑤每3 4天半量换液，培养14 16天细胞生长约80%汇合；⑥当细胞约80%汇合时，利用0. 25%胰酶对细胞进行消化，以1 3X IO5ceIls/ ml接种于培养皿中传代培养；⑦当细胞约80%汇合时，利用0. 25%胰酶对细胞进行消化，收集第1代细胞，按 1 2比率进行传代，置于37°C、饱和湿度、5% CO2培养箱中培养；⑧若需多次传代，重复步骤⑦即可；⑨分离、纯化获得高纯度间充质干细胞，利用FACS Cal ibur流式细胞仪分析其间充质干细胞纯度。实施例2、脐带血干细胞制备从健康人的脐带血提取有核细胞，此有核细胞包含但不限于造血干细胞和间充质干细胞，以此种细胞为起始细胞，接种于脐带间充质干细胞制作的滋养层上，并用特定培养基(此特定培养基DMEM/F12 RPMI1640按1 1混合，另含10% FBS和10%脐带血血浆， PH = 7. 0 7. 4)培养、扩增，最多培养至10 11天，收集细胞。此时收集的细胞中造血干细胞含量最为丰富。造血干细胞的单次培养、扩增周期为10 11天。具体过程如下①采集健康人的脐带血；②按5 1的体积比加入5%羟乙基淀粉(HES)(脐带血羟乙基淀粉为5:1)， 混合均勻；③于4°C冰箱静置4 5小时，沉降红细胞；④取上清，2000rpm离心lOmin，获得有核细胞，其中含约0. 83% CD34+细胞(CD34 为造血干细胞表面抗原)；⑤将有核细胞接种于脐带间充质干细胞制作的滋养层上；(脐带间充质干细胞滋养层的制作方法将脐带间充质干细胞接种于DMEM/F12培养液的培养皿中，调整细胞浓度为0. 4 0. 6X 105cellS/ml，置37°C、饱和湿度、5% C02培养箱中培养，至细胞完全贴壁时将DMEM/F12培养液全量换为特定培养基，此时即可接种脐带血有核细胞进行培养、扩增)。⑥每隔3 4天更换半量特定培养基，至第10 11天即可收集细胞；⑦多次重复此培养、扩增过程可获得大量造血干细胞；⑧采用MiniMACS免疫磁珠法对收集的细胞进行分离、纯化获得高纯度造血干细胞，利用FACSCalibur流式细胞仪分析其造血干细胞纯度。造血干细胞培养、扩增过程中所用的特定培养基为DMEM/F12 RPMI1640为1 1 混合，另含10% FBS和10%脐带血血浆，pH = 7. O 7. 4实施例3、脐带和脐带血干细胞生物活性物质组合物的制备
将体外培养获得的脐带血来源干细胞与脐带来源干细胞以1 5 1 10比例组合，调整细胞浓度为IX IO7 IX IO8个/毫升密封于冻存管中，经超低温液氮反复冻融 4 5次至细胞破碎，再通过低温分离、纯化等现代生物技术手段，即可获得高纯度的干细胞生物活性物质群组合物。该生物活性物质群主要来自间充质干细胞和造血干细胞，包含但不限于干细胞生长因子(SCF)、神经生长因子(NGF)、基质细胞源性生长因子(SDF)、血管内皮细胞生长因子 (VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、表皮生长因子(EGF)、 白介素-6与白介素-7(IL-6与IL-7)、巨核细胞集落刺激因子(M-CSF)、肿瘤坏死因子 (TNF)、干扰素(IFN)等因子、脱氧核糖核酸(DNA)及核糖核酸(RNA)、活性多肽、以及免疫蛋白IgG、IgA、IgM、IgD、IgE等等，这些物质可以促进机体干细胞(包括造血干细胞)生长、 增殖，起到活化干细胞作用，从根本上调节人体生理机能。实施例4、脐带和脐带血干细胞生物活性物质的活性验证将干细胞生物活性物质按15微克/毫升浓度加入到培养基中，并以此种浓度的培养基培养正常传代至第8代的脐带间充质干细胞(此代细胞的增殖能力减弱，活性降低)， 显微镜下观察细胞的生长状态，并于第3天收集细胞，与对照组相比，添加干细胞生物活性物质的组别，间充质干细胞增殖能力显著增强。实施例5、脐带和脐带血干细胞生物活性物质在医学中的应用将干细胞生物活性物质按10 50微克/毫升浓度加入到培养液中，因富含干细胞因子群，可以促进体外培养干细胞的增殖分化，起到活化干细胞功能的效果。实施例6、脐带和脐带血干细胞生物活性物质在保健和美容领域中的应用将干细胞生物活性物质按1 1000 1 10000比例加入特定食品中制成保健品，进入于机体后可活化机体干细胞，修复或替代受损与衰老的细胞，改善新陈代谢，提高机体抵抗力，延缓衰老。将干细胞生物活性物质以10 20微克/毫升加入到化妆品中，外用于皮肤，可活化皮肤干细胞，促进皮肤干细胞增殖、分化，修复或替代衰老的皮肤细胞，从根本上改变皮肤的生理机能。
权利要求
1.人源干细胞生物活性物质及其制备与应用，其特征是干细胞生物活性物质群组合物来源于脐带组织和脐带血的干细胞，其内富含干细胞因子群、活性多肽、免疫蛋白和核酸等物质，其制备方法为提取人源干细胞一体外培养、扩增一超低温液氮反复冻融至细胞破碎 —低温分离、纯化干细胞生物活性物质，其用途为医学、保健和美容领域的应用。
2.根据权利要求1所述的干细胞，其特征是来源于健康人的脐带和脐带血，经体外培养、扩增获得。
3.根据权利要求2所述的干细胞，其特征是包含但不限于间充质干细胞和造血干细胞。
4.根据权利要求2所述的干细胞，其特征是脐带来源干细胞按1 2比率进行传代，最多培养至第5代，即收集5代以内(包括第5代)的细胞，其细胞活性高且性状稳定。
5.根据权利要求2所述的干细胞，其特征是脐带血来源干细胞在特定培养基中单次培养、扩增周期为10 11天，即收集培养、扩增至10 11天以内的细胞，其细胞活性高且分化程度低。
6.根据权利要求5所述的干细胞，其特征是培养、扩增所用的特定培养基为DMEM/ F12 RPMI1640以1 1混合，另含10% FBS和10%脐带血血菜，pH = 7. 0 7. 4。
7.根据权利要求5所述的干细胞，其特征是脐带血来源干细胞培养、扩增以脐带间充质干细胞作为滋养层。
8.根据权利要求1所述的干细胞生物活性物质，其特征是脐带来源干细胞和脐带血来源干细胞的生物活性物质的组合物。
9.根据权利要求1所述的干细胞生物活性物质的制备方法，其特征是超低温液氮反复冻融4 5次至细胞破碎，应用现代低温生物技术制备干细胞生物活性物质。
10.根据权利要求1所述的干细胞生物活性物质的医学用途，其特征是干细胞生物活性物质可以促进干细胞增殖分化，通过活化机体干细胞，修复或替代受损、病变和衰老的细胞。
11.根据权利要求1所述的干细胞生物活性物质的保健领域的用途，其特征是干细胞生物活性物质以1 1000 1 10000比例制成保健品，进入人体后可以提高机体抵抗力，延缓衰老。
12.根据权利要求1所述的干细胞生物活性物质的美容领域的用途，其特征是干细胞生物活性物质以10 20微克/毫升浓度加入到化妆品中，活化皮肤干细胞，从根本上改变皮肤的生理机能。
全文摘要
本发明公开了一种人源干细胞生物活性物质及其制备与应用。首先提取健康人源干细胞，经体外培养，扩增，收集特定阶段干细胞，利用现代超低温等生物技术制备干细胞生物活性的物质群组合物。该活性物质群主要来源于间充质干细胞和造血干细胞，利用此干细胞物质群可开发成具有细胞生物学活性功能的产品，作用于人体后可活化机体干细胞，修复或替代受损、病变和衰老的细胞，调节机体细胞代谢功能，增强机体免疫力，延缓衰老等功效。该人源干细胞生物活性物质群组合物在医学、保健和美容领域极具应用前景。
文档编号C12P1/00GK102465148SQ201010532709
公开日2012年5月23日 申请日期2010年11月1日 优先权日2010年11月1日
发明者张正前 申请人:张正前