专利名称：成年人骨髓间充质干细胞体外扩增和定向诱导分化为心肌样细胞的方法
技术领域：
本发明涉及一种利用骨髓间充质干细胞的生物学特性，分离扩增成人骨髓间充质干细胞，加入一定浓度化学诱导剂，体外定向诱导分化为心肌样细胞的方法。
背景技术：
冠心病心肌梗死及心力衰竭是严重影响人民生活质量和寿命的主要疾病之一。研究资料显示，成熟的心肌细胞缺乏再生能力，心肌梗死(MI)发生后，梗死区心肌只能通过纤维组织增生，由无收缩功能的疤痕组织代替，导致心功能下降。临床上缺乏针对梗死心肌再生、重建的根本性治疗方法，而细胞替代治疗应运而生成为一个理想的治疗策略。骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)，是在骨髓中的一种类似成纤维细胞的一类细胞，具有多方向分化潜能，可以向骨组织、软骨组织、皮肤、造血干细胞支持介质、骨骼肌细胞及心肌细胞转化。自体骨髓间充质干细胞还具有取材方便、无免疫原性、具有多向分化潜能、合乎伦理学要求并且无致瘤性，具有其它干细胞不可比拟的优势，因此，探讨hMSCs体外大量扩增及向心肌细胞诱导分化条件将对损伤心肌的修复治疗具有深远意义。在研究MSCs向心肌细胞分化机制中，目前的诱导方法主要包括化学诱导和组织微环境诱导。其中化学诱导剂以5-氮胞苷(5-azacytidine，5-AZA)为最常用。5-AZA是胞苷的类似物，它可以与DNA共价结合形成复合物从而导致DNA甲基在细胞分裂周期中进行性丢失，发挥去甲基化作用，启动MyoD等某些相关等位基因的表达。国外有学者将成年小鼠骨髓基质细胞经5-氮胞苷诱导后，能产生自主收缩的肌管结构的细胞团，显微镜下结构类似胚胎心肌细胞。国内也有采用5氮胞苷诱导猪骨髓间质干细胞，细胞变成心肌细胞形态，表达心肌特异性收缩蛋白。但是目前对于人骨髓间充质干细胞(hMSCs)向心肌细胞诱导分化的体外研究尚未见报道，鉴于此，我们将hMSCs体外分离、扩增后，加入5氮胞苷化学诱导，探索骨髓间质干细胞在体外化学条件下转化为心肌细胞的过程及方法，为MSCs体外扩增后自体回输治疗心肌梗塞提供实验依据。
发明内容
本发明涉及一种利用骨髓间充质干细胞的生物学特性，分离扩增成人骨髓间充质干细胞，加入一定浓度化学诱导剂，体外定向诱导分化为心肌样细胞的方法。
本发明的目的是提供一种将成人骨髓间充质干细胞体外分离扩增、大量扩增后，定向诱导分化为具有心肌特异性收缩蛋白的心肌样细胞的方法。为实现上述目的，本发明采用以下技术方案1)采用密度梯度离心法分离培养人骨髓间充质干细胞，利用干细胞的自我更新和增殖特性对干细胞进行扩增，从而达到获得大量干细胞的目的。2)分离出的细胞在体外进行定向诱导分化的方案，其特征在于特定培养代数(第2-6，11细胞)进行诱导，以特定的化学诱导剂5-氮胞苷，特定浓度(5-10μM)进行定向诱导；3)分离出的细胞在体外进行定向诱导分化的方案，其特征还在于bFGF促细胞增殖及促进肌细胞表型表达功能与5-AZA的去甲基化作用结合，更有助于人MSCs向成心肌细胞定向分化。
本发明提供了心肌细胞损伤缺失后的补充来源，为干细胞移植替代临床治疗心肌梗死及晚期心功能不全等奠定了基础，并为心肌梗死及晚期心功能不全等心肌疾病的药物筛选提供了一个新的模型。
本发明的内容未公开发表，本领域的技术人员如不花费创造性劳动根本不能根据现有的技术推断得到本发明的分离诱导方法。
具体实施例方式
实施例1、骨髓间充质干细胞的分离、纯化及原代、传代培养无菌条件下抽取健康志愿者髂骨骨髓，加入DMEM-F12培养液中充分混合，离心弃上清及脂肪层，加入完全培养基充分混匀后，将骨髓液轻轻叠加到密度1.073g/ml的Percoll分离液上，900g离心30分钟(室温下)，取白细胞膜层以上的部分，加入含10％胎牛血清的DMEM-F12培养液(预先加入青-链霉素100u/μg.ml-1)中充分混匀，离心洗涤备用，将分离的细胞按2×105/cm2的浓度接种于50ml塑料培养瓶中，置于37℃，5％CO2和饱和湿度的孵箱中进行培养，48h后更换培养液，弃掉未贴壁细胞，以后每2～3天换液一次。细胞长到80％融合时用0.25％的胰蛋白酶消化传代，细巴斯德吸管吹打成单细胞悬液后以1×105/ml种植于新培养液中，每2～3天换液一次。
实施例2、成人骨髓间充质干细胞体外定向诱导分化取分离培养3代后人MSCs，用0.25％胰蛋白酶消化，PBS清洗后，以2×105/cm2的密度接种于24孔塑料培养板中，在完全培养基中加入3μmol/L、5μmol/L、10μmol/L的5氮胞苷，诱导分化24小时后，吸弃培养液，PBS清洗两次，继续用完全培养基培养，2～3天换液一次，细胞长到80％融合时用0.25％的胰蛋白酶消化传代。诱导后14、21天的细胞爬片，固定，免疫荧光染色观察desmin、心肌早期转录因子GATA4，心肌特异性cTnI及闰盘蛋白connexin43的表达。5.5×105个MSCs，经扩增12代后可获得(2.3±0.36)×109个细胞，扩增约(4.6±0.45)×104倍；5、10μmol/L的5氮胞苷进行化学诱导后细胞形态变长，体积增大，诱导后14天时20～30％细胞融合形成多核肌管样结构，3μmol/L组MSCs未出现肌管结构，诱导后21天5、10μmol/L组人MSCs中desmin及心肌早期转录因子GATA4表达强阳性、心肌特异性cTnI、及闰盘蛋白connexin43的表达弱阳性，cTnI阳性染色细胞率10μmol/L诱导组高于5μmol/L诱导组(P＜0.05)；3μmol/L诱导组及阴性对照组心肌特异性蛋白的表达阴性。
分别取原代培养72h细胞、体外扩增第2、6、11代MSCs，以8.0×103/cm3浓度接种于放置有消毒盖玻片的六孔板内，制备细胞爬片，每孔加2ml完全培养液(DMEM-F12+10％FBS)，达到60-70％融合时，bFGF(100ng/ml)预处理24h后，换5-AZA(终浓度为10μmoL/L)诱导24h，PBS洗涤，更换为含有bFGF(2ng/ml)的完全培养基，之后每三天更换培养液，并每天在显微镜下观察细胞形态变化。诱导后20天的细胞爬片，进行肌钙蛋白I(troponinI)和结蛋白(desmin)的免疫组化鉴定。第2、6、11代人MSCs经5-AZA与bFGF诱导可定向分化为心肌样细胞，表达troponinI和desmin；RT-PCR显示诱导后细胞心肌特异因子基因β-肌浆蛋白重链(β-MHC)为阳性表达，其中第6代MSCs的β-MHC的表达较第2、11代高。
权利要求
1.一种分离扩增培养成年人骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)的方法，其特征在于利用干细胞生理特性，采用DMEM-F12+10％胎牛血清作为基本培养基，通过及时、反复传代对人MSCs进行纯化和扩增培养，从而获得高纯度大量MSCs的目的。
2.按权利要求1分离扩增得到的细胞在体外进行定向诱导分化的方案，其特征在于以特定的药物，特定浓度及特定培养代数(第2-6代细胞及11代)在有血清条件下进行定向诱导。
3.按权利要求1分离方法分离出的细胞在体内进行定向诱导分化的方案，特征在于诱导时采用特定浓度、特定生长因子处理可以与5-氮胞苷(5-AZA)的去甲基化作用结合，有助于人MSCs向心肌细胞定向分化。
全文摘要
本发明的目的是提供一种将人骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)大量扩增后体外定向诱导分化为心肌样细胞的方法。为实现上述目的，本发明采用以下技术方案1)利用MSCs的生物学特性，采用密度梯度离心法分离富集人MSCs，利用干细胞的自我更新和增殖特性对干细胞进行扩增，从而达到获得大量干细胞的目的。2)分离出的细胞在体外进行定向诱导分化的方案，其特征在于特定培养代数(第2－6，11代细胞)进行诱导，以特定的化学诱导剂5－氮胞苷(5－AZA)，特定浓度(5－10μM)进行定向诱导；3)分离出的细胞在体外进行定向诱导分化的方案，其特征还在于bFGF促细胞增殖及促进肌细胞表型表达功能与5－AZA的去甲基化作用结合，更有助于人MSCs向成心肌细胞定向分化。本发明提供了心肌细胞损伤缺失后的补充来源，为干细胞移植替代临床治疗心肌梗死及晚期心功能不全等奠定了基础，并为心肌梗死及晚期心功能不全等心肌疾病的药物筛选提供了一个新的模型。
文档编号C12N5/08GK1536076SQ0310928
公开日2004年10月13日 申请日期2003年4月9日 优先权日2003年4月9日
发明者裴雪涛, 牛丽丽, 曹丰, 贾国良, 祝善俊 申请人:中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所, 中国人民解放军军事医学科学院野战输