专利名称：基因修饰诱导脑内移植间充质干细胞向神经元分化的方法
技术领域：
本发明涉及一种通过病毒基因载体体外转导神经营养因子基因，促使脑内移植的骨髓间充质干细胞向神经元分化，同时旁分泌神经营养因子营养、支持周围神经细胞的方法。
背景技术：
间充质干细胞(mesenehymal stem cells，MSCs)起源于中胚层，是成纤维细胞、内皮细胞、成骨细胞、脂肪细胞等多种基质细胞的前体细胞，具有较强的增殖能力和多分化潜能。MSCs可以通过贴壁培养达到较高的纯度。MSCs在体外可被诱导分化为表达NeuN的神经元和表达GFAP的神经胶质细胞。将MSCs移植到脑组织中，可长期存活，并向神经细胞分化。但实验表明植入脑的MSCs大部分分化为神经胶质细胞，分化为神经元样细胞的比例较小。过多的神经胶质细胞不但对神经功能改善无益，还可导致胶质疤痕形成等副作用。因此，如何提高脑内移植的MSCs向神经元分化，特别是能够建立正确突触联系的神经元，是干细胞移植治疗中枢神经系统疾病的关键所在。
脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)是神经营养因子(neurotrophin)家族成员之一。对神经细胞具有普遍的营养、支持作用，可促使神经干细胞增殖并向神经元分化。将BDNF和骨髓细胞(bone marrow BM)混合移植到大鼠大脑中动脉闭塞梗塞边缘区(ischemic boundary zone，IBZ)，BDNF可以促进脑内移植的MSCs增殖并向神经元分化。但是BDNF蛋白质在脑内的半衰期很短，所以将BDNF与MSCs混合移植，并不能让BDNF充分发挥其生物效应，因此必须寻找一种可以使BDNF对植入的MSCs长期作用的方法。
当代基因工程技术提供了各种载体，可将核酸片断导入细胞中表达。其中逆转录病毒基因载体是较为广泛应用的一种。该载体可将外源基因整合到靶细胞的基因组中，因此可使目的基因在靶细胞中长期、稳定表达。已有实验表明逆转录病毒可将外源基因导入MSCs，并稳定表达。
因此，利用逆转录病毒将BDNF基因导入MSCs，这种重组了BDNF基因的MSCs植入脑内后，由于BDNF的作用，较未经基因修饰的MSCs可提高脑内存活能力及向神经元分化的比例，同时大量旁分泌的BDNF，可以营养、支持周围的神经细胞，特别是一些病变组织及其周围细胞，如脑血管意外，帕金森氏病(Parkinson’s disease，PD)，阿尔茨海默氏病(Alzheimer’s disease，AD)等。因此本方法可为将来干细胞治疗脑血管疾病、神经系统变性疾病、老年痴呆、脑外伤后遗症等神经系统疾病提供来源充足、可取自自体的种子细胞，以及使种子细胞能更好地发挥补充受损神经元，维持、保护残存神经元作用的新方法。另外，转导某些缺陷基因或治疗基因，在体外对MSCs进行功能激活和调控，将其作为基因治疗的载体；利用MSCs在体内的靶向性，还可将载有目的基因的MSCs用于治疗遗传性神经病和神经系统其他疾病，同时为与之相关的药物开发和筛选提供了一种新的模型。
发明内容
本发明的目的是提供一种通过自制的重组人类BDNF基因的逆转录病毒，将BDNF基因导入MSCs，经筛选获得重组了BDNF基因的MSCs(BDNF-MSCs)，将BDNF-MSCs植入脑，在自分泌的BDNF诱导下定向分化为神经元的方法。采用以下技术方案从人骨髓中分离法分离出hMSCs，再利用反复贴壁培养纯化。从人的神经母细胞瘤细胞中克隆出人BDNF的cDNA片段，构建重组质粒pMSCV-hBDNF，建立逆转录病毒细胞株。制备病毒并纯化。以重组BDNF基因的逆转录病毒感染MSCs，通过耐药基因筛选，使BDNF在MSCs内稳定表达。本发明能够在通过高效转导使外源性基因在MSCs中稳定表达的同时，保持MSCs在体内、外的多分化潜能和其他干细胞的生物特性。
本发明的另一个主要内容是通过特定的细胞密度和注射方式使BDNF-MSCs在脑内分化为神经元细胞，同时通过旁分泌BDNF营养、支持周围神经细胞。通过DAPI核染色区别供体细胞和自体细胞，利用神经细胞特异表型蛋白可以证明BDNF-MSCs在脑内向神经元分化的比例为55％，而未经基因修饰的MSCs在脑内向神经元分化的比例为10％。
本发明的内容未公开发表，本领域的技术人员如不花费创造性劳动根本不能根据现有的技术推断得到本发明的基因转导及脑内移植的关键技术方法。
具体实施例方式
实施例1、重组hBDNF基因的逆转录病毒的制备离心收集2～3×106神经母细胞瘤(SK-N-SH)细胞，抽提总RNA，构建cDNA文库。以SK-N-SH cDNA为模板，PCR引物5′-ATGACCATCCTTTTCCTTAC-3′，5′-CTATCTICCCCTTTTAATGG-3′，克隆hBDNF的cDNA，并将其连接到T-载体上进行测序。得到的hBDNF的CDS核酸序列如下ATGACCATCCTTTTCCTTACTATGGTTATTTCATACTTTGGTTGCATGAAGGCTGCCCCCATGAAAGAAGCAAACATCCGAGGACAAGGTGGCTTGGCCTACCCAGGTGTGCGGACCCATGGGACTCTGGAGAGCGTGAATGGGCCCAAGGCAGGTICAAGAGGCTTGACATCATTGGCTGACACTTTCGAACACGTGATAGAAGAGCTGTTGGATGAGGACCAGAAAGTTCGGCCCAATGAAGAAAACAATAAGGACGCAGACTTGTACACGTCCAGGGTGATGCTCAGTAGTCAAGTGCCTITGGAGCCTCCTCTICTCTTTCTGCTGGAGGAATACAAAAATTACCTAGATGCTGCAAACATGTCCATGAGGGTCCGGCGCCACTCTGACCCTGCCCGCCGAGGGGAGCTGAGCGTGTGTGACAGTATTAGTGAGTGGGTAACGGCAGCAGACAAAAAGACTGCAGTGGACATGTCGGGCGGGACGGTCACAGTCCTTGAAAAGGTCCCTGTATCAAAAGGCCAACTGAAGCAATACTICTACGAGACCAAGTGCAATCCCATGGGTTACACAAAAGAAGGCTGCAGGGGCATAGACAAAAGGCATTGGAACTCCCAGTGCCGAACTACCCAGTCGTACGTGCGGGCCCTTACCATGGATAGCAAAAAGAGAATTGGCTGGCGATTCATAAGGATAGACACTTCTTGTGTATGTACATTGACCATTAAAAGGGGAAGATAG将hBDNF的CDS从pGEM-T载体中用限制性内切酶EcoRI和XhoI切下，再用T4连接酶连接到pMSCV-neo上，即构建成重组hBDNF基因的逆转录病毒质粒pMSCV-hBDNF。
对数期生长的PT67细胞，加入pMSCV-hBDNF质粒和脂质体(LipofectAMINE 2000)进行转染，然后用600μg/ml G418筛选耐药细胞。待抗性克隆形成后用不含G418的培养液培养3天，将培养瓶置于-20℃过夜，化冻后将培养液4℃500g×5min离心，吸取上清，即得到了重组hBDNF基因的逆转录病毒原液。测定病毒原液滴度后，病毒原液4℃50,000g×90min离心，弃上清，溶于1/50体积的TNE中即得病毒存储液，病毒存储液按一次用量分装，可在-70℃长期保存。
实施例2、通过逆转录病毒感染转导BDNF基因将P1代MSCs按1×104cells/cm2密度接种于培养皿中，然后按细胞与病毒颗粒的比例1∶10感染8小时后，用无病毒培养液培养24小时，再用300μg/mlG418选择培养。待抗性克隆形成后，换用不含G418的培养液。ELISA法测定结果显示BDNF-MSCs培养液中BDNF水平显著高于未经BDNF基因修饰的MSCs的培养液中的。
实施例3、大鼠脑内移植BDNF-MSCs定向诱导为神经元用2.4cGyγ射线照射Wistar大鼠，对其进行免疫消减。24小时后利用大鼠脑立体定向仪，按照《大鼠脑立体定向图谱》的指示，在大鼠纹状体前部注射经DAPI核染色的BDNF-MSCs。坐标为前囱前1.0mm，旁开2.5mm，硬膜下4.5mm。注入细胞混悬液量为20ml(含2×106BDNF-MSCs)，注射速度为1μl/min，留针10min，缓慢退针1mm/min。细胞移植后1天、3天、6天、15天、30天，剪心处死大鼠，4％多聚甲醛/0.1MPBS固定液主动脉灌注固定脑组织，冰冻切片。用NeuN、GFAP、Nestin免疫组化抗体结合，荧光二抗标记。结果BDNF-MSCs(DAPI阳性细胞)在正常大鼠及PD模型大鼠脑纹状体内长期存活，其中55％的BDNF-MSCs分化为神经元样细胞(NeuN阳性细胞)。
权利要求
1.一种诱导脑内移植的人骨髓间充质干细胞向神经元细胞分化的方法，其特征在于移植前在体外用神经营养因子基因对间充质干细胞进行基因修饰。
2.按照权利要求1对间充质干细胞进行诱导的方案，其特征在于导入的外源基因为人脑源性神经营养因子基因。
3.按照权利要求1对间充质干细胞进行诱导的方案，其特征在于通过逆转录病毒基因载体将人脑源性神经营养因子基因导入间充质干细胞。
4.按照权利要求1或2对间充质干细胞进行诱导的方案，其特征在于重组逆转录病毒以特定浓度、时间感染间充质干细胞，从而使外源基因在间充质干细胞内稳定表达。
5.按照权利要求1对间充质干细胞进行诱导，其特征在于重组人脑源性神经营养因子基因的间充质干细胞通过脑立体定向局部注射的方法移植入脑。
6.按照权利要求1或5对间充质干细胞进行诱导，其特征在于移植部位为尾状核头部。
7.按照权利要求1或5对间充质干细胞进行诱导，其特征在于以特定的细胞密度及注射体积进行移植。
全文摘要
目的是提供一种通过体外基因操作诱导脑内移植的间充质干细胞向神经元定向分化的方法。技术方案(1)利用自身生物学特性分离、扩增、纯化间充质干细胞。(2)从人神经母细胞瘤cDNA文库中克隆脑源性神经营养因子cDNA序列，构建重组人脑源性神经营养因子基因的逆转录病毒载体，将脑源性神经营养因子基因导入间充质干细胞。(3)通过脑立体定向方法将脑源性神经营养因子基因修饰的间充质干细胞植入脑内。在神经营养因子的诱导下，间充质干细胞分化为神经元的比例显著提高。本发明提供了一种可以显著提高脑内移植的干细胞向神经元分化比例的方法，大大提高了干细胞移植的实际利用价值，并为基因和/或干细胞治疗神经系统病损提供了一个新的技术平台。
文档编号C12N15/867GK1536074SQ0310926
公开日2004年10月13日 申请日期2003年4月9日 优先权日2003年4月9日
发明者裴雪涛, 徐小虎, 赵连旭, 张 杰, 王冬梅 申请人:中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所, 汕头大学医学院, 中国人民解放军军事医学科学院野战输