增强细胞粘连特性的方法和组合物的制作方法

专利名称：增强细胞粘连特性的方法和组合物的制作方法
优先权要求根据35 U.S.C§119(e)，本发明要求2004年4月29日提交的美国临时申请号No.60/566,613的权利，其全部内容引入本文作为参考。
政府支持的陈述涉及本发明的研究由(至少部分由)NIH/NHLBI授予的美国政府资助号No.HL51818支持。政府在本发明中享有某些权利。
背景技术：
发明领域本发明涉及在细胞培养环境中具有增强粘连特性的修饰细胞以及制造和使用这些细胞的方法。
背景技术：
人胚肾(HEK)239细胞是被广泛用于商业上和研究中的各种不同细胞的一个例子，主要由于它们易于生长和它们能够被外源DNA有效转染的能力。但是，293细胞和各种其它细胞衍生物的一个问题在于它们经常很难粘附到组织培养容器。这使这些细胞的操作困难。克服这个问题的一个方式是以玻连蛋白或聚赖氨酸涂覆细胞培养容器，其既影响成本又影响处理这样的细胞培养的简易性，使这种方法对于大规模细胞生产是不期望的。
通过提供方法和组合物，本发明克服了现有技术中之前的缺点，细胞借助它们可以被修饰以在细胞表面上表达整联蛋白以增强对细胞培养基质的粘连。
附图简要说明

图1A-F.B-241细胞中人整联蛋白cDNAs的细胞表面表达。以不同人整联蛋白cDNAs稳定转染的B-241细胞系从组织培养板受胰蛋白酶作用。完整的活细胞以小鼠单克隆抗体染色，所述抗体结合到用于检测α亚基的荧光素(FITC)或是用于检测β3亚基的藻红蛋白(PE)。所用抗体对人β3整联蛋白(BD Bioscences，目录号555754)、人αv整联蛋白(Chemicon International，Inc.，目录号CBL490F)和人血小板糖蛋白(GP)IIb，也称为整联蛋白αIIb整联蛋白亚基(ChemiconInternational，Inc.，目录号CBL589F)是特异性的。板块(panel)表示不同B-241细胞系衍生物的萤光分布。板块A未修饰的B-241细胞。板块B被修饰以表达人血小板GPIIIa，也称为β3整联蛋白亚基的细胞。板块C被修饰以表达人αIIb整联蛋白亚基的细胞。板块D被修饰以表达αIIbβ3整联蛋白受体的细胞，其用于几种细胞外基质分子，包括血纤蛋白原、von Willebrand因子、纤连蛋白和玻连蛋白。板块E被修饰以表达αv整联蛋白亚基的细胞。板块F被修饰以表达用于玻连蛋白的αvβ3受体的细胞。
图2.以人整联蛋白转染后BiG-45包装细胞增加的粘连。含有马传染性贫血症病毒(EIAV)-绿色荧光蛋白(GFP)载体的BiG-45EIAV包装细胞被以不同的人整联蛋白cDNAs转染。细胞被接种到常规组织培养板的孔中。接种后一个小时，在轻微洗涤之前和之后每个孔的GFP荧光被测定以确定粘连到板的细胞百分数。细胞荧光平板读数器(Cytofluor plate reader)被用于测量荧光。
图3.转瓶培养的带有和不带有人整联蛋白cDNAs修饰的EIAV载体产生细胞系。每个瓶用7.75×107个细胞接种。
图4.质粒pEV53B。
图5.质粒pESIN6.1CpuroW。
图6.质粒pCXIP和pCXIH。
图7.质粒pEV53。
图8.质粒pEV53A。
图9.质粒pEC-lacZ。
图10.质粒pEC-puro。
图11.质粒pCI-VSV-G。
发明概述在一个实施方式中，本发明提供一种修饰细胞，与未修饰细胞的粘连特性相比，其具有增加到至少三倍(increased at least three fold)的粘连特性，其包括重组核酸或由重组核酸组成或基本由重组核酸组成，所述核酸可以是a)编码整联蛋白β3亚基的核酸；b)编码整联蛋白αv亚基的核酸；c)编码整联蛋白αIIb亚基的核酸；和/或d)任何(a)、(b)和(c)的组合。
本文还提供的是一种293.01细胞，其包括、由和/或基本由重组核酸组成，所述重组核酸可以是a)编码整联蛋白β3亚基的核酸；b)编码整联蛋白αv亚基的核酸；c)编码整联蛋白αIIb亚基的核酸；和/或d)任何(a)、(b)和(c)的组合。
本发明另外提供一种将细胞粘连到培养容器表面的方法，其包括、由或基本由以下组成a)向所述细胞中引入核酸，该核酸可以是i)编码整联蛋白β3亚基的核酸；ii)编码整联蛋白αv亚基的核酸；iii)编码整联蛋白αIIb亚基的核酸；和/或iv)任何(i)、(ii)和(iii)的组合；以及b)在所述细胞可以借以粘连到所述培养容器的表面的条件下，将所述细胞与所述培养容器表面接触。
在另一个实施方式中，本发明提供一种产生修饰细胞的方法，与未修饰细胞的粘连特性相比，所述修饰细胞具有增加到至少三倍的粘连特性，其包括、由或基本由以下组成向所述细胞中引入重组核酸，所述重组核酸可以是a)编码整联蛋白β3亚基的核酸；b)编码整联蛋白αv亚基的核酸；c)编码整联蛋白αIIb亚基的核酸；和/或d)任何(a)、(b)和(c)的组合。
本文还提供的是一种在培养容器的细胞中产生病毒颗粒的方法，其包括、由或基本由以下组成a)向所述细胞中引入选自由以下组成的组的重组核酸i)编码整联蛋白β3亚基的核酸；ii)编码整联蛋白αv亚基的核酸；iii)编码整联蛋白αIIb亚基的核酸；及iv)任何(i)、(ii)和(iii)的组合；b)将a)的细胞置于培养所述培养容器中；以及c)在病毒借以被产生的条件下，将感染性病毒颗粒引入b)的培养容器中。
此外，提供在培养容器中的293.101细胞中产生重组慢病毒颗粒的方法，其包括、由或基本由以下组成a)将重组核酸引入293.101细胞中，所述核酸可以是i)编码整联蛋白β3亚基的核酸；ii)编码整联蛋白αv亚基的核酸；iii)编码整联蛋白αIIb亚基的核酸；和/或iv)任何(i)和(ii)和(iii)的组合；b)将(a)的细胞置于培养容器中，以及(c)在(b)的细胞中引入I)第一载体，其包括、由或基本由编码慢病毒gag和慢病毒pol的慢病毒核酸序列组成，其中所述载体(1)包括在编码慢病毒结构蛋白的至少一个基因的至少一个缺陷，和(2)包括缺陷包装信号；II)第二载体，其包括、由或基本由慢病毒核酸序列组成，该序列包括载体基因组反转录所需的的顺式作用序列元件，其中所述载体(1)包括活性包装信号，(2)包括异源基因；以及III)第三载体，其包括、由或基本由病毒的核酸序列组成，其中所述第三载体(1)表达病毒包膜蛋白，以及(2)包括缺陷包装信号，其在重组慢病毒颗粒借以被产生的条件下进行。
本文另外提供的是制造包装细胞的方法，其包括、由或基本由以载体转染本发明的修饰细胞组成，所述载体包括、由或基本由慢病毒核酸序列组成，其中所述载体包括缺陷包装信号。
在另外的实施方式中，本发明提供包括本发明修饰细胞的包装细胞，其中所述细胞包括编码至少一种慢病毒结构蛋白的慢病毒核酸序列，其中所述核酸序列是包装信号缺陷的，如此该细胞自身产生至少一种慢病毒结构蛋白，但是不产生能够复制的感染性病毒。
本发明的不同的其它目的和优点从以下的详细描述中将变得更加清晰。
发明详述如本文所使用的，“a”，“an”或“the”可以意味着一个或多于一个。例如，“a”细胞可以意味着单细胞或多细胞。
还如本文使用的，“和/或”涉及并包括一个或更多相关所列项目的任何以及所有可能的组合，以及当在可替换的情形(“或”)中说明时的缺少的组合。
本发明是基于意料不到的发现，所述发现为修饰细胞以表达整联蛋白，导致比未修饰细胞更加坚固的粘连到组织培养基的细胞。
因此，在一个实施方式中，本发明提供一种被修饰的细胞，其具有的粘连特性与未修饰细胞的粘连特性相比被增加了，其包括重组核酸，所述核酸可以是a)编码整联蛋白β3亚基的核酸；b)编码整联蛋白αv亚基的核酸；c)编码整联蛋白αIIb亚基的核酸；和/或d)任何(a)、(b)和(c)的组合。所述细胞在整联蛋白亚基编码序列借以在细胞中被表达和/或过表达的条件下保持。在一些实施方式中，整联蛋白亚基的编码序列根据现有技术中广泛熟知的方法在细胞中被瞬时表达以调节核酸的表达，如此本发明编码整联蛋白亚基的核酸表达的时序和/或数量可以被控制。
与未修饰细胞的粘连特性相比，粘连特性的增量可以是至少两倍、至少三倍、至少四倍、至少五倍、至少六倍、至少七倍、至少八倍、至少九倍、或至少十倍。通过使如本文所描述的被修饰的或未修饰细胞与组织培养基质[例如，塑料(例如，聚丙烯、聚乙稀、聚丙烯酸酯、聚山梨酯等)、玻璃、琼脂、胶原质、纤连蛋白、陶瓷、金属、生物降解或非生物可降解的聚酯支架(scafffold)、导管等]接触一段时间，该时间足以允许细胞粘连到基质(substrate)，并根据本文所描述的方法，以及用于量化细胞的任何已知技术的方法，测定被粘连到基质的细胞数量，从而测定粘连特性的增加。比未修饰细胞以更大数量粘连到组织培养基质的被修饰细胞是具有增加的粘连特性的细胞。粘连特性的增加与被粘连细胞的增加数量相关并可以表达为X倍增量(例如，两倍、三倍等)、表示为百分比(例如，粘连特性增加10％，其基于与未修饰细胞相比，被修饰细胞粘连到基质的数目多10％)、和/或根据任何其它已知技术的值，其识别相对于基线测量的增加。
本发明的细胞可以是任何类型的细胞，其可以在培养条件下生长和/或维持并可以摄取(take up)以及表达编码整联蛋白的重组核酸。例如，本发明的细胞可以是，但不限于，BiG-45细胞、293.101细胞、B-241细胞、293T细胞、HEK 293细胞、Dami细胞、中国仓鼠卵巢细胞、杂交瘤细胞、HUVEC和MS-5细胞。
本发明的细胞可以单独地或以细胞群存在，并且本发明的细胞可以被包含在组织培养容器中，其可以是，但不限于，烧瓶、瓶子、转瓶、管形瓶、试管、小室、烧瓶、皿、载玻片、板、组织培养孔、其可以呈现为单独的孔或多孔板，和/或它们的任何组合。
通过引入编码整联蛋白的重组核酸，本发明细胞被修饰，所述整联蛋白可以是人整联蛋白、并可以是但不限于整联蛋白β3亚基、整联蛋白αv亚基、整联蛋白αIIb亚基、和/或这些整联蛋白亚基以任何顺序的任何组合。本发明还提供连接到细胞外基质分子的任何整联蛋白的组合，所述分子可通过细胞被涂覆或分泌到基质上，细胞在所述基质上生长。一些例子包括，但不限于，胶原质受体α2-β1、层粘连蛋白受体α6-β4、几种体外结合素受体αV-β5、和β1，其可以与不同的α亚基组合用于诸如纤连蛋白等受体细胞外基质分子。本发明的整联蛋白可以是来自任何物种，如作为实例，诸如鸡、狗、大鼠、和小鼠。编码这些整联蛋白的核酸可以在一种或多于一种的核酸构建体上被引入细胞中，该核酸从该构建体被表达以在细胞内产生整联蛋白。
如本文所使用的“核酸”涉及单或双链分子，其可以是由核苷酸碱基A、T、C和G组成的DNA，或由碱基A、U(代替T)、C和G组成的RNA。本发明的核酸可以代表编码链或它的互补链。本发明的核酸可以包括核苷酸序列，其可以与天然产生的序列在序列上相同，或由于核酸密码的良好表征的简并性而可以包括可替换的编码相同氨基酸的密码子，该氨基酸与见于天然存在的序列中的氨基酸相同。此外，本发明的核酸可以包括核苷酸序列，其可以包括密码子，该密码子代表现有技术中被广泛熟知的保守的氨基酸替换，如此所得到的多肽的生物活性可以被保留。根据现有技术中广泛熟知的用于分离核酸的方法，本发明核酸可以从细胞中被分离。可替换的，根据在文献中广泛描述的用于合成核酸的标准实验设计，本发明的核酸可以被合成。对所述发明的核酸的修饰也可以被预期，前提是由所述核酸编码的多肽的必要的结构和/或功能(即，生物活性)被保留。
“重组”核酸是使用现有技术中广泛熟知的基因工程技术制造的一种核酸。
就术语核酸序列的“表达”(及其语法的等同物)来说，它意味着所述序列被转录，以及任选的被翻译。
本发明的编码整联蛋白的核酸还可以包括指导细胞内整联蛋白表达的启动子。因此，在某些实施方式中，启动子可被操作的连接到编码整联蛋白的重组核酸。所述启动子可以是组成型启动子，导致细胞中整联蛋白核酸的组成型表达，或所述启动子可以是诱导型启动子，导致细胞中整联蛋白核酸仅在激活启动子的诱导元素存在时表达，从而允许由重组核酸产生的整联蛋白被控制。
本发明启动子的例子包括，但不限于，CMV立即早期启动子、劳斯内瘤病毒启动子、延伸因子1α、β肌动蛋白、真核起始因子4A1、复合CMV增强子/β肌动蛋白启动子(CAG)、复合延伸因子1α启动子/HTLV 5′非翻译区域、复合SV40增强子/人铁蛋白重链-延伸因子1α启动子、复合CMV增强子/人铁蛋白轻链延伸因子1α启动子和复合CMV启动子/四环素操纵基因。本发明的启动子可以任何组合和/或顺序存在于本发明重组核酸上根据现有技术中广泛熟知的方法，本发明的核酸可以被引入细胞中，所述方法包括但不限于转导(例如，由病毒载体感染)、转染(电穿孔、脂质转染、磷酸钙沉淀、显微注射等)。
在某些实施方式中，本发明提供293.01细胞，其包括重组核酸，所述核酸可以是a)编码整联蛋白β3亚基的核酸；b)编码整联蛋白αv亚基的核酸；c)编码整联蛋白αIIb亚基的核酸；和/或d)任何(a)和(b)和(c)的组合。如本文注明的，编码整联蛋白的核酸可以以任何顺序和/或组合出现在相同或不同的构建体上，并可以同时的和/或次序的被引入细胞中。核酸可以被同时地和/或以任何顺序和/或组合而被表达。
在特别的实施方式中，本发明提供293.101细胞，其包括编码整联蛋白β3亚基的重组核酸和编码整联蛋白αv亚基的重组核酸。这些重组核酸可以出现在相同或不同的构建体上，并可以同时的和/或次序的以任何组合和/或顺序被引入细胞中，并可以同时地和/或以任何顺序被表达。
本文进一步提供的是用于生产本发明细胞的不同方法。因此，在一个实施方式中，本发明提供将细胞粘连到培养容器表面的方法，其包括a)将核酸引入细胞，所述核酸可以是i)编码整联蛋白β3亚基的核酸；ii)编码整联蛋白αv亚基的核酸；iii)编码整联蛋白αIIb亚基的核酸；和/或iv)任何(i)、(ii)和(iii)的组合；以及b)在细胞可以借以粘连到培养容器表面的条件下，使(a)的细胞与培养容器表面接触。
细胞可以借以粘连到培养器表面的条件在本文中被描述，并对于任何给定的细胞类型是现有技术中广泛熟知的，其根据被包括在培养容器中的培养基，以及培养容器被维持时所处的环境(例如，温度、湿度、二氧化碳含量等)。用于本发明细胞类型的培养基配方和培养条件在现有技术中已经被很好的建立。作为一个例子，HEK 293细胞在以下条件的培养中生长和维持在37℃并在5％CO2的保温箱中，HEK293细胞在含有10％的胎牛血清的Dulbecco’s Modified Eagle’s培养基(DMEM目录编号11995-065，Invitrogen Corp)中被培养。当细胞成为90％融合时，它们被传代以保持在1∶6的稀释度。
本文另外提供的是生产被修饰细胞的方法，所述细胞具有的粘连特性与未修饰细胞的粘连特性相比增加到至少两倍、至少三倍、和/或至少四倍，该方法包括将重组核酸引入细胞，所述核酸可以是a)编码整联蛋白β3亚基的核酸；b)编码整联蛋白αv亚基的核酸；c)编码整联蛋白αIIb亚基的核酸；和/或d)任何(a)、(b)和(c)的组合。
本发明的细胞在本文中显示可以更好的经受处理(诸如甘油休克或DMSO休克)，其通常用于瞬时转染实验设计以增加核酸摄取。因此，在另一实施方式中，本发明提供具有增强的摄取核酸能力的本发明的细胞，并且根据本文描述的实验设计而进一步提供制造这样的细胞的方法，以及使用这样的细胞用于产生病毒颗粒的方法，其具有如本文所描述的修改以提供对用于转染实验设计中的处理的增强的耐受能力。
本发明的细胞可以被用于各种商业的和研究的应用，包括细胞内不同材料的产生(例如，蛋白质、病毒等)，其产量可以被提高，因为由于提高了粘连特性，在培养容器中可用于生产的细胞的数量增加。因此，在某些实施方式中，本发明提供在培养容器中的细胞中制造病毒颗粒的方法，其包括a)将重组核酸引入细胞，所述核酸可以是i)编码整联蛋白β3亚基的核酸；ii)编码整联蛋白αv亚基的核酸；iii)编码整联蛋白αIIb亚基的核酸；和/或iv)任何(i)和(ii)和(iii)的组合；b)将(a)的细胞置于培养容器中，以及(c)在病毒颗粒借以产生的条件下，将感染性的病毒颗粒引入(b)的培养容器中。
本发明的病毒可以是可在细胞培养中产生的任何病毒，包括但不限于，慢病毒、逆转录病毒、副黏病毒、正黏病毒、黄病毒、腺病毒、腺病毒伴随病毒(AAV)、杆状病毒、微小核糖核酸病毒、α-病毒、冠状病毒、疱疹病毒、乳头状瘤多型空泡形病毒(papovavirus)、布尼亚病毒、环状病毒、痘病毒、沙粒病毒、疱疹病毒、肝脱氧核糖核酸病毒(hepadnavirus)和纤丝病毒，以及可在细胞中产生的现在已知或之后被鉴定的其它病毒。
在本发明的某些实施方式中，所述病毒可以是慢病毒，其可以是灵长类慢病毒(例如，HIV-1、HIV-2、SIV)、非灵长类慢病毒(例如，FIV、BLV、EIAV、CEV和绵羊脱髓鞘性脑白质炎病毒(visnavirus))，和/或现在已知或之后被鉴定的任何其它病毒。
此外，本发明还提供在培养容器中的细胞中产生重组慢病毒颗粒的方法，其包括a)将重组核酸引入细胞，所述核酸可以是i)编码整联蛋白β3亚基的核酸；ii)编码整联蛋白αv亚基的核酸；iii)编码整联蛋白αIIb亚基的核酸；和/或iv)(i)和(ii)和(iii)的任何组合；b)将(a)的细胞置于培养容器中，以及(c)在(b)的细胞中引入I)第一载体，其包括编码一个或更多慢病毒结构蛋白的慢病毒核酸序列，其中所述载体(1)包括在编码慢病毒结构蛋白的至少一个基因中的至少一个缺陷，和(2)包括缺陷包装信号；II)第二载体，其包括慢病毒核酸序列，该序列包括载体基因组反转录所需的的顺式作用序列元件，其中所述载体包括活性(competent)包装信号，以及III)第三载体，其包括病毒的核酸序列，其中所述第三载体(1)表达病毒包膜蛋白，以及(2)包括缺陷包装信号，其在重组慢病毒颗粒被产生的条件下进行。
在某些实施方式中，以上方法的第二载体对于表达至少一种慢病毒结构蛋白(例如，gag、pol或env)可能是有缺陷的。在其它实施方式中，第一载体可以是gag-pol表达载体，其不具有env基因或具有的env基因包括使它不能从第一载体被表达的缺陷。在env基因中的缺陷可以是缺失、替换和/或添加突变，它们使基因不能够从第一载体被表达。
在其它实施方式中，第一和第二载体可以都缺失env基因或都可以包括env基因，此基因包括可以是缺失、替换和/或添加突变的缺陷，其使所述基因不能从第一载体被表达。
以上所述方法的第三载体可以包括编码病毒包膜蛋白的核酸，该核酸可以是慢病毒env基因，和/或所述第三载体可包括编码病毒包膜蛋白的核酸，该包膜蛋白非慢病毒包膜蛋白。例如，由第三载体的核酸编码的包膜蛋白可以是疱疹性口炎病毒G(VSV-G)糖蛋白。
以上所述方法的第二载体可以包括多克隆位点，异源核酸序列可以被插入其中，和/或一种或更多异源核酸。本发明的异源核酸可以编码蛋白质或多肽，当在异源核酸被引入的细胞中产生时，其可以是抗原性的、免疫原性的和/或治疗性的。
词汇“异源核酸”是本领域广泛熟知的并将被本领域技术人员容易的理解为一种核酸，其在它已经被引入的细胞中通常是不存在的，和/或是在通常不出现在细胞内的调节元件的控制下被表达的核酸。本发明的异源核酸还可以是以一定数量出现或以一定数量表达的核酸，该数量通常不同于在此核酸已经被引入的细胞中存在的数量。“异源核酸”将通常是细胞中非天然产生的序列。可替换的，异源核苷酸序列可以指被置于非天然环境中的序列(例如，通过与启动子关联，其不是天然关联的)。
根据制造核酸序列的标准方法，本发明的第一载体、第二载体、和第三载体可以被制造以制造载体构建体，以及在某些实施方式中，本发明的第一、第二和/或第三载体可以来自慢病毒基因组的cDNA克隆。
作为一些例子，本发明的第一载体可以是质粒pEV53、质粒pEV53A和/或质粒pEV53B；本发明的第二载体可以是质粒pEC-lacZ、质粒pEC-puro、质粒pESIN6.1GpuroW、质粒pESIN6.1G3W、质粒pE11.1G3W和/或质粒pESIN11.1G3W；以及本发明的第三载体可以是质粒pCI-VSV-G。
pEV53B类似于pEV 53，除了直到主要剪接供体位点上游3nt的所有EIAV前导序列被移除。为了构建pEV53B，gag基因和部分pol从pEV53由PCR扩增，使用引物5’-TTTGGCGCGCCAGGTAAGATGGGAGACCCTTTGAC-3’(正向)(SEQ ID NO1)和5’-CTACTTGATCCTTCTCCTTGAC-3’(反向)(SEQ ID NO2)。AscI抑制位点(下划线)被包括在用于克隆目的的正向引物中。用于正向引物中的gag的ATG翻译起始位点被以粗体指示，以及EIAV序列被显示为斜体用于正义引物。所得到的1.4kb的PCR产物用AscI和BsrGI消化并克隆到AscI-BsrGI消化的pEV53A中。这样得到pEV53B。序列分析被用于证实由PCR扩增的gag-pol序列是正确的。
本发明第二载体的例子是质粒pESIN6.1CpuroW，一种6866bp的质粒，源自表达链霉菌Streptomyces alboniger嘌呤霉素报道基因的EIVA。所述质粒含有两个CMV立即早期增强子/启动子区域(位于bp1-734和1863-2384)；来自EIAV长末端重复(LTR)的R-U5序列区域(bp735-857)；引导序列，其含有EIAV RNA的包装信号(～bp870-1200)、变异的tat翻译起始位点(在bp909-911的CTG到TAG)、在bp996-997的剪接供体位点、变异的gag翻译起始位点(在bp1000-1003的ATG到TAG)、部分的EIAV gag序列(bp1004-1200)；“DNA瓣(flap)”序列，其含有EIVA中心聚嘌呤区(bp1314-1330)和中心终止信号序列(bp1422-1448)；嘌呤霉素编码序列(bp2480-3105)；旱獭肝炎病毒转录后调节元件(bp3110-3996)；删除EIAV增强子/启动子序列的EIAV自身灭活(SIN)LTR序列(bp4037-4138)；噬菌体f1区域(bp4280-4735)；氨苄青霉素抗性编码区域(bp5174-6034)；以及DAN复制的ColE1起始点(origin)(bp5554-6228)。
第二载体的另一个例子是pE6.1CpuroW，其类似于pESIN6.1CpuroW，除了SIN LTR被野生型EIAV LTR取代。其它的例子包括pESIN6.1CW和pE6.1CW，它们分别类似于pESIN6.1CpuroW和pESIN6.1CpuroW，除了嘌呤霉素抗性基因已经被扩展的多克隆位点取代，以便于感兴趣的其它基因或序列的插入。第二载体的进一步的改善是可能的例如，pESIN11.1CW和pE11.1CW是载体的例子，该载体的引导区域已经被重排列并被优化以提供更高的效价。
根据本发明方法产生的慢病毒颗粒能够感染细胞并在传递异源核酸到靶细胞的过程中进行一轮复制。这种技术的一方面是核酸传递系统，其排除病毒基因到靶细胞的传递。这通过将编码病毒结构蛋白的载体与编码异源核酸的载体物理分隔而实现。分开的载体被引入受纳细胞(“包装细胞”)。病毒结构蛋白对于病毒颗粒产生是必要的，但是编码这些蛋白的基因出现在包括缺陷包装信号或没有包装信号的载体上，如此以致结构蛋白基因没有被包装到在包装细胞中产生的病毒颗粒中。所得到的慢病毒颗粒是“复制缺陷的”，其中被包装的载体不含有编码颗粒组装所需的所有病毒结构蛋白的核酸。
因此，在另一些实施方式中，本发明提供制造包装细胞的方法，其包括以包括慢病毒核酸序列的载体转染本发明的修饰细胞，其中所述载体包括缺陷包装信号。所述载体可以是gag-pol表达载体，并在某些实施方式中，所述载体可以是质粒pEV53B。
本文额外提供的是含有本发明修饰细胞的包装细胞，其中所述细胞包括编码至少一种慢病毒结构蛋白的慢病毒核酸序列，其中所述核酸序列是包装信号缺陷的，如此所述细胞自身产生至少一种慢病毒结构蛋白，但是不产生能够复制的感染性病毒。
特别是，关于本发明的慢病毒载体，在某些实施方式中，所述载体源自EIAV。天然EIAV核酸可以从感染病毒的细胞分离，并从其制备载体。用于制备EIVA载体的示例性的方法在Perry等人的J.Virol.664085-4097(1992)中被提供。例如，使用本领域已知的方法，通过逆转录酶，从EIAV RNA可以产生cDNA。那么双链EIAV cDNA可以被制造并克隆到克隆载体中，诸如细菌克隆载体。本领域技术人员已知的和使用的任何克隆载体可以被使用，诸如细菌、酵母或真核载体。在一些实施方式中，本发明的载体可以包括cDNA分子，其可以包括互补于至少部分EIAV基因组的一个或更多核酸序列，并包括用于基因组复制所需的RNA基因组的一部分，所述cDNA分子被置于在靶细胞中功能性的启动子的转录控制之下。
本发明的启动子可以包括真核和/或原核来源的启动子，足以指导细胞中远处定位的序列(即，连接到启动子序列5’末端的序列)的转录。启动子区域还可以包括用于增强或抑制转录的控制元件。适合的启动子的例子是巨细胞病毒立即早期启动子(pCMV)，劳斯肉瘤病毒长末端重复启动子(pRSV)、和SP6、T3、或T7启动子。启动子上游的增强子序列或编码区域下游的终止子序列可以任选的被包括在本发明的载体中以便于表达。本发明的载体还可以含有额外的核酸序列，诸如多腺苷酸化(polyadenylation)序列、定位序列和/或信号序列，足以允许细胞有效率的和有效的表达载体的异源核酸。可能的多腺苷酸化序列的例子是SV40早期区多腺苷酸化位点(Hall等人.，J.Molec.App.Genet.2101(1983))和SV40晚期区多腺苷酸化位点(Garswell and Alwine，Mol.Cell Biol.94248(1989))。这样的附加序列被插入到载体中，如此如果转录是被期望的，它们被可操作的与启动子序列连接，或者如果翻译和加工是被期望的，额外的与起始和加工序列连接。可替换的，被插入的序列可以被置于载体中的任何位置。所述词汇“可操作的连接”被用于描述在核酸序列和启动子和/或其它调节或加工序列之间的连接，如此核酸序列的转录由可操作连接的启动子序列而指导，所述序列的翻译由可操作连接的翻译调节序列指导，以及所述序列的转录后加工由可操作连接的加工序列指导。
用于构建本发明载体的标准技术对于所述领域技术人员是广泛熟知的，并可以见于这样的文献，如Sambrook等人的.，Molecular CloningA Laboratory Manual(Cold Spring Harbor，NY，1989)。各种策略可用于连接DNA片断，它的选择依赖于DNA片断末端的性质，和哪种选择可以由技术人员容易的作出。
在本发明的一个实施方式中，重组慢病毒表达系统包括三种载体。第一载体包括至少部分EIAV基因组的核酸序列，其中载体(i)包含在编码EIAV结构蛋白的至少一个基因中的至少一个缺陷，以及(ii)包含缺陷包装信号。第二载体包括至少部分EIAV基因组的核酸序列，其中载体(i)包含活性的包装信号，以及(ii)包含异源基因可以被插入其中的多克隆位点。第三载体包括病毒核酸序列，其中载体(i)表达病毒包膜蛋白，以及(ii)包含缺陷包装信号。
在发明的另一实施方式中，第一载体是gag/pol表达载体。Gag/pol表达载体表达用于从细胞组装和释放病毒颗粒所需的EIAV蛋白，并包括编码病毒多蛋白Gag和Gag-Pol的基因。第一载体还可以表达编码辅助蛋白Rev和Tat的基因。编码功能未知的蛋白的开放阅读框架S2可以额外的被包括在第一载体中。所述第一载体被构建以包含排除逆转录病毒介导的病毒基因转移的突变。这样的突变可以是病毒env基因中的序列缺失的形式，因此排除产生活性复制的EIAV的可能性，或可以是在基因组3’末端的某些顺式作用序列元件的缺失，其为病毒逆转录和整合所需。因此，即使来自这种构建体的病毒基因被包装到病毒颗粒中，它们将不被复制，以及活性复制的野生型病毒将不能产生。
在另一实施方式中，表达系统的第一载体是质粒pEV53bB，其可以是11874bp的质粒和cDNA克隆，其在碱基对209-863含有CMV立即早期增强子/启动子区域，它位于EIAV主剪接供体位点(bp915-916)，gag编码区域(bp920-2380)，pol编码区域(bp2137-5578)和ORF S2编码区域(bp5741-5938)的上游。载体还包括部分env编码区域(bp5767-7437)和rev编码区域(bp5892-5992和6954-7358)。已知的Rev效应元件(Rev Responsive Element)(RRE)被包含在rev的第一编码区域(bp5892-5992)。载体不表达功能性tat基因，由于tat的第一外显子的缺失，但是tat的第二外显子出现在bp5590-5730。牛生长激素(BGH)的多腺苷酸化信号被提供(bp7463-7677)，还提供了噬菌体f1区域(bp7741-8154)，SV40早期启动子区域和复制起点(bp8218-8543)，新霉素抗性编码区域(bp9389-9628)，SV40多腺苷酸化信号(bp9389-9628)，复制的Col E1起始点(bp10060-10733)，以及β-内酰胺酶(氨苄青霉素抗性)的编码区域(bp10878-11739)。
本发明表达系统的第二载体被设计为用于核酸传递的载体，并包含支持载体核酸的壳体化和逆转录(复制)所需的所有顺式作用元件，以及用于插入编码异源核酸的cDNAs的多克隆位点。在本发明中，包括异源核酸的载体是重组EIAV衍生载体，其挟带将被转导到靶细胞中的遗传信息，以及对于病毒基因组的包装和整合必要的顺式作用序列元件。第二载体可以包含gag编码序列的一些部分，由于人们相信gag序列的某些部分在包装EIAV基因组中起作用。第二载体还可以包含所谓的慢病毒“DNA瓣”区域，它是来自慢病毒DNA的顺式作用序列并含有涉及逆转录的中心聚嘌呤区(tract)(cPPT)和中心终止位点(CTS)序列。此外，第二载体可以包含顺式作用元件以促进新合成的RNA从细胞核到细胞质的有效输出。RNA输出信号的例子包括同源慢病毒Rev效应元件(RRE)，其与Rev一起工作，以及异源的土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(WPRE)，其还可以通过RNA稳定作用或其它方法增加基因表达。此外，被包含在LTR的中5’剪接供体位点可以含有增加所产生病毒的效价的突变，如在例如，Tan等人.，J.Virol.703645-3658(1996)所描述的。
本发明第二载体的例子是质粒pESIN6.1CpuroW，一种6866bp的质粒，源自表达链霉菌Streptomyces alboniger嘌呤霉素报道基因的EIVA。所述质粒含有两个CMV立即早期增强子启动子区域(位于bp1-734和1863-2384)；来自EIAV长末端重复(LTR)的R-U5序列区域(bp735-857)；引导序列，其含有EIAV RNA的壳体化信号(～bp870-1200)、变异的tat翻译起始位点(在bp909-911的CTG到TAG)、在bp996-997的剪接供体位点、变异的gag翻译起始位点(在bp1000-1003的ATG到TAG)、部分的EIAV gag序列(bp1004-1200)；“DNA瓣”序列，其含有EIVA中心聚嘌呤区(cPPT，bp1314-1330)和中心终止位点(CTS)序列(bp1422-1448)；病毒剪接受体序列(bp1753-1754)；Rev效应元件(RRE，bp1755-1857)；嘌呤霉素编码序列(bp2480-3105)；旱獭肝炎病毒转录后调节元件(bp3110-3996)；删除EIAV增强子/启动子序列的EIAV自身灭活(SIN)LTR序列(bp4037-4138)；噬菌体f1区域(bp4280-4735)；氨苄青霉素抗性编码区域(bp5174-6034)；以及复制的ColE1起始点(bp5554-6228)。
本领域技术人员将认识到的是，异源核酸的核苷酸序列可以是任何核苷酸序列。例如，异源核酸可以是报道基因序列或可选择的标记基因序列。如本文使用的报道基因序列是任何基因序列，当其被表达的时候，导致其存在或活性可以被检测的蛋白质的产生。适合的报道基因的例子包括半乳糖激酶，β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、β-内酰胺酶等的基因。可替换的，报道基因序列可以是任何基因序列，它的表达产生以某种可检测的方式影响细胞生理学的基因产物。
可选择的标记基因序列是能够被表达以产生蛋白质的任何基因序列。它的存在允许人们选择性的繁殖包含它的细胞。可选择的标记基因的例子包括能够给予宿主抗生素抗性(例如，嘌呤霉素、氨苄青霉素、四环素、卡那霉素等)、能够给予宿主对氨基酸类似物的抗性、和/或允许细菌在额外的碳源上或在本来不允许的培养条件下生长的基因序列。基因序列既可以是报道基因，也可以是可选择的标记基因序列。本发明报道基因的例子是lacZ基因，其编码E.Coli的β-半乳糖苷酶活性，以及编码嘌呤霉素抗性的基因。
本发明的报道基因或可选择的标记基因序列是那些足以允许普通细胞中载体的识别或选择的基因序列。在发明的一个实施方式中，报道基因序列将编码酶或其它蛋白质，其通常不出现在哺乳动物细胞中，并且它的存在可以因此确定的证实在这样的细胞中的所述载体的存在。
本发明的异源核酸还可以包括所需产物的编码序列，所述产物诸如适合的生物活性蛋白或多肽，免疫原性的或抗原性的蛋白或多肽，或治疗活性蛋白或多肽。可替换的，异源核酸可以包括互补于RNA序列的序列，诸如反义RNA序列，该反义序列可以对受试者给药以抑制在受试者细胞中的互补多聚核苷酸的表达。
异源核酸的表达可以提供免疫原的和/或抗原的蛋白和/或多肽以获得免疫反应，其可以包括抗体反应。这样的抗体可以在疫苗接种中有效赋予患者治疗效果和/或所述抗体可从诸如血液、血清或腹水等动物体液中被收集。
在本发明的另一实施方式中，第三载体包括编码病毒包膜蛋白的核酸。这样的载体将相应的包括编码在适合的启动子控制之下的病毒蛋白的核酸序列。病毒包膜蛋白可以是慢病毒包膜蛋白。但是，可能的是改变本发明的病毒载体可以感染的细胞的宿主范围，通过利用来自另一病毒的包膜蛋白基因来进行。换而言之，可能的是扩展本发明EIAV载体的宿主范围，通过利用某些病毒的包膜蛋白的能力以参与其它病毒的壳体化(encapsidation)。水泡性口膜炎病毒的G-蛋白(VSV-G；见Rose和Gillione，J.Virol.39519-528(1981)；Rose andBergmann，Cell 30753-762(1982))有效的形成带有其它病毒的基因组和基质成分的假型病毒体。这些VSV-G假型载体具有非常宽的宿主范围并可以通过超速离心法被浓缩到高的效价。如本文所使用的，词汇“假型”是指病毒颗粒，其含有一个病毒的核酸以及另一个病毒的包膜蛋白。
本发明第三载体的例子是质粒和cDNA克隆pCI-VSV-G，一种用于包膜糖蛋白VSV-G的表达载体。所述质粒含有5679个碱基对并包括CMV立即早期增强子启动子区域(bp1-795)、嵌合内含子区域(bp857-989)，VSV-G编码区域(bp1088-2633)、噬菌体f1区域(3093-3548)、SV40晚期多腺苷酸化信号(bp2782-3003)，DNA复制的ColE1起始点(bp4992-5666)和氨苄青霉素抗性编码区域(bp3987-4847)。
在本发明的方法中，感染性的、复制缺陷的EIAV颗粒可根据本文所公开的方法结合本领域技术人员已知技术而制备。所述方法包括以本发明载体转染慢病毒受纳细胞；被转染细胞中产生EIAV衍生的颗粒；并从细胞收集病毒颗粒。可根据本领域技术人员已知的任何适合的方法来实施转染慢病毒受纳细胞的步骤。例如，在本发明的方法中，本文所述的三质粒表达系统被用于通过瞬时转染产生EIAV衍生的逆转录病毒载体颗粒。作为另一个例子，载体摄取到细胞中可以通过任何适合的方法而实现，诸如，例如，以DEAE-葡聚糖处理细胞、添加到细胞之前以LIPOFECTIN处理载体-衍生的DNA或RNA，或通过电穿孔法。这些技术在现有领域中是已知的。
促进细胞中感染性病毒颗粒产生的步骤使用常规技术实施，诸如通过在现有技术中广泛熟知的标准细胞培养生长技术。
收集感染性病毒颗粒的步骤也可以使用常规技术实施。例如，感染性病毒颗粒可以通过细胞溶解而被收集，或收集细胞培养上清液，如在现有技术中已知的。可选的，如果需要，收集的病毒颗粒可以被纯化。适合的纯化技术对本领域技术人员是广泛熟知的。
如果技术人员需要，慢病毒母液(stock solution)可以使用本发明的载体和方法被制备。制备病毒母液的方法在技术领域中是已知的，并通过例如，Soneoka等人.，Nucl.Acid Res.23628-633(1995)和Landau等人.，J.Virol.665110-5113(1992)而被说明。在本发明产生母液的方法中，本发明的慢病毒受纳细胞用本发明的载体转染。于是，细胞在适合的细胞培养条件下生长，且慢病毒颗粒或是从细胞本身或是从细胞培养基中被收集，如以上所描述的。
本发明的载体还用于制备包装细胞(即，表达EIAV病毒蛋白的细胞，该细胞不能由自身产生感染性病毒颗粒)。制备表达逆转录病毒蛋白的包装细胞的方法在技术领域中是已知的并通过例如Temin等人的美国专利No.4,650,764中所阐述的方法而被举例说明，以其整体引入本文以便于参考对于这些方法的教导。本发明的包装细胞可以包括本发明的慢病毒受纳细胞，包括编码至少一种EIVA结构蛋白的EIAV核酸，该核酸是包装信号缺陷的，因此使细胞自身能够产生至少一种EIAV结构蛋白，但是不能够产生复制活性的感染性病毒。那么，包装细胞可以具有被引入的其它核酸序列(例如，pSIN61.CpuroW和/或pCI-VSV-G)，其可以包含异源核酸和适合的包装信号。一旦以附加序列转染，包装细胞就被用于产生EIAV病毒的母液，所述EIAV病毒包含异源核酸，但是该病毒是不能自身复制的。
本发明在以下实施例中被更加详细的描述，其仅作为说明，因为本文的许多改变和变体对于本领域技术人员将是显而易见的。
实施例实施例1细胞HEK 293细胞来自美国典型培养物收藏所(American Type CultureCollection(ATCC))。这些细胞的克隆基因库通过限制稀释而被制备，并且被筛选以得到对产生逆转录病毒和慢病毒载体显示最大能力的细胞系(Johnson等人.″Effect of host modification and age on airwayepithelial gene transfer mediated by a murine leukemia virus-derivedvector″J.Virol.728861-72(1998))。这些克隆之一，293.101，被选择用于构建EIAV辅助细胞系和EIAV载体包装细胞。B-241细胞系是EIAV载体辅助细胞系。这些细胞通过以表达载体(EV53B)稳定转染而由293.101细胞获得，该表达载体由CMV启动子表达EIAV gag，pol，S2，以及rev基因。Big-45细胞系是EIAV包装细胞系。这些细胞通过以质粒表达载体稳定转染而得自B-241细胞，该表达载体编码四环素可调节的VSV-G包膜cDNA和CMV启动子驱动的四环素抑制物基因。BiG-45/8Z-20细胞来自以pONY8Z稳定转染的BiG-45细胞，该pONY8Z是编码细菌lacZ报道基因的一种EIAV基因传递载体(Rohll等人.″Design，production，safety，evaluation，and clinicalapplications of nonprimate lentiviral vectors″Methods Enzymol346466-500(2002))。
整联蛋白表达质粒pCXIH表达载体被用于表达人αIIb或αv整联蛋白亚基。pCXIP表达载体被用于表达野生型或突变的人β3整联蛋白亚基。这些载体使用CMV启动子以驱动被插入的cDNA的表达，并包含连接到或潮霉素抗性基因(pCXIH)或嘌呤霉素抗性基因(pCXIP)的IRES序列，其用于动物细胞中的选择。
pCXIP质粒是5562bp长度并是设计为表达靶基因以及嘌呤霉素可选标记的双顺反子(bicistronic)表达载体。这种载体包括CMV立即早期增强子/启动子区域(bp1-532)、用于插入将被表达的序列的多克隆位点区域(bp639-687)、内部核糖体进入位点序列(bp689-1261)、嘌呤霉素抗性基因(bp1298-1894)、来自鼠白血病病毒的poly A添加信号(bp2268-2693)、DNA复制的SV40起始点(bp2973-3259)、DNA复制区域的Col E1起始点(bp3580-4200)，和氨苄青霉素抗性基因(bp4340-5200)。
pCXIH质粒是6161bp长度并是设计为表达靶基因以及潮霉素可选标记的双顺反子(bicistronic)表达载体。这种载体包括CMV立即早期增强子/启动子区域(bp1-532)、用于插入将被表达的序列的多克隆位点区域(bp640-680)、内部核糖体进入位点序列(bp689-1263)、潮霉素抗性基因(bp1287-2321)、来自鼠白血病病毒的poly A添加信号(bp2867-3292)、DNA复制的SV40起始点(bp3572-3858)、DNA复制区域的Col E1起始点(bp4179-4799)，和氨苄青霉素抗性基因(bp4939-5799)。
对于在BiG-45细胞中表达αv和β3两个整联蛋白亚基，pVITRO2-mcs表达载体(InvivoGen，San Diego)被使用。这种载体使用复合人铁蛋白重链起动子/SV40增强子序列以驱动人αv整联蛋白的表达，以及复合人铁蛋白轻链启动子/CMV增强子序列以驱动人β3整联蛋白的表达。
基于293的EIAV产生细胞中整联蛋白亚基的表达编码αIIb、αv和β3亚基的整联蛋白cDNAs被亚克隆到表达载体中，其中使用的CMV启动子，不同组合被稳定转染到B-241 EIAV辅助细胞系中以产生一系列细胞系。药物选择12天之后，来自每次转染的细胞菌落被混合并被分析各整联蛋白亚基αIIb、αv和β3的细胞表面表达，或作为整联蛋白受体αIIbβ3、αvβ3，通过由流式细胞计量法的活细胞免疫荧光法分析(图1)。人们发现每个整联蛋白都在B-241细胞的细胞表面被表达。与表达单独的亚基相比，α和β亚基二者的表达共同增强它们在细胞表面的总表达。免疫荧光研究确认每个整联蛋白的表达相对于内源整联蛋白的表达大大增强了。
整联蛋白修饰的293细胞连接到组织培养基质细胞连接试验被用于测试β3整联蛋白亚基单独或与它的αIIb或αv结合配偶体一起表达是否将导致对组织培养基质的增加的粘连。该试验涉及在基于293的BiG-45 EIAV包装细胞中瞬时表达整联蛋白亚基，所述包装细胞表达绿色荧光蛋白。所述细胞在12孔板中每个孔被铺板3×105个细胞。铺板后1h通过测量在洗涤细胞之前和之后的细胞荧光，确定细胞的铺板效率。与未修饰细胞相比，β3整联蛋白亚基的过表达单独导致293细胞对未处理组织培养板的粘连显著增加(图2)。αv的共表达进一步的增加293细胞的粘连。β3亚基的突变型也被测试，当与血小板上αIIb结合的时候，其引起αIIbβ3受体被永久激活。与野生型β3亚基相比较，单独的或结合αIIb或αv的突变β3亚基不提供任何细胞粘连的增加(图2)。因此，在293衍生的细胞中野生型人αvβ3整联蛋白受体的表达显著增加了它们连接到常规组织培养板的能力。
整联蛋白修饰对293细胞的转瓶培养的影响为了减少产生慢病毒载体所需的时间和努力，整联蛋白-修饰细胞在转瓶培养中的连接和生长的能力被研究。在初期试验中，整联蛋白β3修饰的B-241细胞或未修饰的B-241细胞被接种到转瓶中。第二天，细胞以结晶紫染色并拍照(图3)。β3修饰细胞粘连显著优于未修饰的细胞，即使一些细胞凝集是明显的。为了测试β3与它的αv结合配偶体一起表达的效果，产生EIAV-lacZ载体(BiG-45/8Z-20)的BiG-45包装细胞用表达两种整联蛋白的pVITRO2mcs载体稳定转染，并被接种到转瓶中。接种后一天，细胞被染色用于表达带有X-GaI的lazZ基因。如图3示出的，与单独以β3修饰的细胞相比，细胞显示更加均一的连接而细胞凝集更少。在之后的试验中，接种到转瓶中之后24h，整联蛋白修饰的和未修饰的B-241细胞的铺板效率被测定。对于β3和αvβ3二者修饰的B-241细胞，铺板效率是98.3％±1.5％(n＝6)。与此相反，对于未修饰的B-241细胞，铺板效率仅是45.7％±15.3％(n＝3)。
整联蛋白表达对慢病毒载体生成的影响α在使用磷酸钙介导的转染的瞬时载体产生系统中，通过将编码嘌呤霉素基因的EIAV载体(ESIN6.1CpuroW)以及编码VSV-G包膜的载体共转染到B-241辅助细胞系中，对整联蛋白表达对慢病毒载体生成的影响进行测定。人们发现单独的αIIb或αv整联蛋白亚基表达对载体效价不具有影响(表1)。αIIb和β3的共表达一致地导致载体效价4-5倍的减少。相反，β3的单独表达或与αv整联蛋白的组合的表达导致载体的产生增加30-60％。
用αvβ3整联蛋白对B-241细胞，或其它基于293的细胞系的修饰，导致细胞变平，如此整联蛋白修饰的细胞比未修饰细胞占据更大的表面积。由于优化的转染试验设计通常使用80-90％融合的培养物，这导致比未修饰细胞更少数量的整联蛋白-修饰细胞用于转染试验。为了进一步表征从整联蛋白-修饰细胞产生EIAV载体，每个细胞的感染性载体的产量被测定并与未修饰细胞比较。此外，用于增加DNA摄取效率的试剂(丙三醇或DMSO)的效果被测定(Lopata等人。1984.″High level transient expression of a chloramphenicol acetyltransferase gene by DEAE-dextran mediated DNA transfectioncoupled with a dimethyl sulfoxide or glycerol shock treatment″NucleicAcids Res 125707-17)。如表2示出的，使用以αvβ3整联蛋白修饰的细胞，每个细胞产生的载体产量增加3.6倍。此外，在整联蛋白-修饰细胞中的载体产量可以进一步增加近似3倍，其通过结合丙三醇或DMSO休克处理到试验设计中以增强DNA摄取(表2)。相反，从未修饰培养物的载体产生没有通过以丙三醇或DMSO的处理而被增强。部分的，这被归因于由于未修饰培养物的低粘连性的细胞损失。丙三醇或DMSO处理的期间减少到30秒，导致未修饰培养物的细胞损失减少，但是载体产量没有被增加。
实施例2HEK 293细胞整联蛋白表达分布的改变允许慢病毒载体的方便的大规模转瓶生产使用转瓶的基于EIAV和HIV的慢病毒载体生产使用整联蛋白-修饰的293细胞的转瓶培养而可以实现大规模高效价的载体生产的可能性被研究。在这些研究中，不同的方法被测试用于使用转瓶产生慢病毒载体。一些实施例在表3中示出。在一个实施例中，αvβ3修饰的B-241辅助细胞的转瓶培养物，该辅助细胞稳定表达EIAV gag-pol基因，被编码嘌呤霉素抗性基因和VSV-G包膜基因的EIAV载体(ESIN6.1CpuroW)共转染。1000倍浓缩之后，以1.2×109感染单位/ml的效价制备的载体被获得。这个水平的载体生产与在组织培养板中生长的未修饰细胞产生的载体产生水平相比较是有利的(表1)。
在第二实施例中，以EIAV lacZ基因稳定转染的BiG-45 EIAV包装细胞系被诱导以产生浓缩后具有2×109效价的病毒。第三实施例显示了该过程可以被扩大以产生适用于动物研究的数量的载体。在这种情况下，目标是产生用于离体基因转移到犬造血干细胞所需的载体数量(＞3×109总感染单位)。含有αvβ3修饰的293T细胞的12转瓶的三日质粒转染被执行以产生HIV-1载体。载体(90ml/转瓶)在从转染后48h开始的连续三天中被收集。总共3240ml被收集并被浓缩近似550倍至6ml。总产量是1.4×1010感染载体颗粒，多于实施动物研究所需的量。
人胚肾细胞(HEK 293)是最广泛使用的用于产生病毒基因转移载体的细胞类型。他们用编码病毒蛋白的质粒DNAs是高度可转染的，使用许多转染试剂和试验设计以瞬时表达重组病毒。许多稳定的基于293的包装细胞系还已经产生用于病毒生产。根据非灵长类慢病毒马传染性贫血病毒(EIAV)的基因转移系统已经被开发，其利用稳定的基于293细胞的可诱导包装细胞系(BiG-45)用于高效价病毒生产。使用293细胞的载体的大规模生产通常是困难的，由于它们易于从规则的组织培养板分离。通过使细胞在悬浮培养中生长，这个问题可以被克服，但是这可以导致病毒效价的显著损失。可替换的，培养物可以在容器中生长，所述容器以诸如纤维结合蛋白或聚赖氨酸等细胞连接基质处理。但是，两个策略显著增加大规模载体生产的费用。
在这个研究中，通过修饰它们的整联蛋白表达分布而增加293细胞的粘连特性的新策略被测试。首先被测试的是整联蛋白β3亚基单独或与它的已知结合配偶体αv或αIIb组合的过度表达的影响。所述细胞粘连试验涉及在基于293的EIAV包装细胞中瞬时表达整联蛋白亚基，所述包装细胞表达绿色荧光蛋白。所述细胞以2-4×105个细胞/孔的密度被板在未经处理的多孔板上。铺板后1h通过测量洗涤细胞之前和之后的细胞荧光，所述细胞的铺板效率被测定。被观察到的是，与未修饰细胞相比，在293细胞中的β3整联蛋白亚基的过度表达导致对未经处理组织培养板的细胞粘连的显著增加。αv但不是αIIb的共表达进一步增加293细胞粘连。来自整联蛋白-修饰的293细胞的基于HIV和EIAV二者的慢病毒载体的产生也被研究。作为这种修饰的结果，在靶细胞中的载体效价和报道基因表达不被损害，并且这导致在转瓶中载体产生的扩大，其用于产生用于体内试验中的载体。
总而言之，293细胞中的αv和β3的过度表达增加了对规则的未经处理的组织培养皿的粘连，并不危害病毒载体产生。
前述仅看作发明原理的说明。此外，由于本领域技术人员易于想到许多修改和变化，将发明限制到本文示出和描述的精确的构造和操作不是被期望的。因此，相应的所有适合的修改和等同物落入本发明的范围内。
本文所引用的所有公开出版物、专利申请、专利和其它文献被以其整体引入本文，以参考与该引用所出现的句子和/或段落相关的教导。

1B-241细胞以含有指明的人整联蛋白cDNAs的表达载体修饰。
2细胞以编码嘌呤霉素抗性的EIAV载体质粒和VSV-G包膜表达载体共转染。转染后48h所产生病毒的效价被给出为每毫升未浓缩组织培养上清液的抗嘌呤霉素的菌落。
3相对于未修饰细胞的效价。

1B-241细胞用编码αvβ3人整联蛋白cDNAs的表达载体修饰。
2未修饰的细胞(1×106/6-孔板的35-mm孔)或αvβ3整联蛋白修饰细胞(4.5×105/6-孔板的35-mm孔)以80％融合铺板，并且用编码嘌呤霉素抗性的EIAV载体质粒和VSV-G包膜表达载体共转染。转染后48h产生的载体总产量(在2ml组织培养上清液中)被给出为每细胞载体的抗嘌呤霉素的菌落(感染单位)。结果代表两个独立实验的平均值。
3加入CaPO4-DNA转染混合物后4小时，培养基被去除，并且培养物以5ml磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤一次。所述细胞在室温下以15％(v/v)的丙三醇在HEPES-缓冲盐水(50mM HEPES(pH7.1)，280mMNaCl和1.5mM Na2HPO4)中处理2分钟。丙三醇溶液被除去，并且培养物以PBS洗涤一次。常规生长培养基被加入，并且所述细胞被送回到37℃保温箱。
4加入CaPO4-DNA转染混合物后4小时，培养基被除去，并且培养物以5ml磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤一次。所述细胞在室温下以PBS中的10％(v/v)的DMSO处理2.5分钟。DMSO溶液被除去并且培养物以PBS洗涤两次。常规生长培养基被加入并且所述细胞被送回到37℃保温箱。

1在2-质粒和3-转染后，在转染的B-241细胞和293T细胞中载体分别被产生。来自BiG-45/8Z-20细胞的载体产生，其挟带整合的EIAV lacZ基因转移载体，通过以10mM丁酸钠和1.5μg/ml脱氧土霉素处理而被诱导。
2病毒载体以高速离心分离法而被浓缩以使编码嘌呤霉素抗性的病毒(100,000×g-小时，在4℃)EIAV载体质粒和VSV-G包膜表达载体成球状。转染后48小时产生的病毒的效价被给出为每毫升组织培养上清液的抗嘌呤霉素菌落。
3载体转导单位/ml。
序列表<110>University of North Carolina at Chapel Hill<120>增强细胞粘连特性的方法和组合物<130>5470-412WO<150>US60/566,613<151>2004-04-29<160>2<170>PatentIn版本3.3<210>1<211>35<212>DNA<213>人工<220>
<223>合成寡核苷酸<400>1tttggcgcgc caggtaagat gggagaccct ttgac35<210>2<211>22<212>DNA<213>人工<220>
<223>合成寡核苷酸<400>2ctacttgatc cttctccttg ac 2权利要求
1.一种修饰细胞，与未修饰细胞的粘连特性相比，其具有增加到至少三倍的粘连特性，其包括选自由以下组成的组的重组核酸a)编码整联蛋白β3亚基的核酸；b)编码整联蛋白αv亚基的核酸；c)编码整联蛋白αIIb亚基的核酸；及d)(a)、(b)和(c)的任何组合。
2.一种293.01细胞，其包括选自由以下组成的组的重组核酸a)编码整联蛋白β3亚基的核酸；b)编码整联蛋白αv亚基的核酸；c)编码整联蛋白αIIb亚基的核酸；及d)(a)、(b)和(c)的任何组合。
3.一种293.101细胞，其包括编码整联蛋白β3亚基的重组核酸和编码整联蛋白αv亚基的重组核酸。
4.一种细胞群体，包括权利要求1、2或3所述的细胞。
5.一种培养容器，其包括权利要求4的所述群体。
6.如权利要求5所述的培养容器，其中所述容器选自由烧瓶、瓶子、转瓶、皿、载玻片、试管、盖玻片、板及其任何组合所组成的组。
7.如权利要求2所述的细胞，其中所述细胞选自由BiG-45细胞、293.101细胞、B-241细胞、293T细胞、HEK293细胞、Dami细胞、中国仓鼠卵巢细胞、杂交瘤细胞、HUVEC细胞、和MS-5细胞所组成的组。
8.如权利要求1、2或3所述的细胞，还包括可操作连接到所述重组核酸的启动子，其中所述启动子选自由以下组成的组CMV立即早期启动子、劳斯肉瘤病毒启动子、延伸因子1α、β-肌动蛋白、真核起始因子4A1、复合CMV增强子/β-肌动蛋白启动子(CAG)、复合延伸因子1α启动子/HTLV5′非翻译区域、复合SV40增强子/人铁蛋白重链-延伸因子1α启动子、复合CMV增强子/人铁蛋白轻链延伸因子1α启动子以及复合CMV启动子/四环素操纵基因。
9.一种将细胞粘连到培养容器表面的方法，包括在所述细胞可以借以粘连到所述培养容器的所述表面的条件下，将所述细胞与所述培养容器的所述表面接触，其中所述细胞包括选自由以下组成的组的重组核酸i)编码整联蛋白β3亚基的核酸；ii)编码整联蛋白αv亚基的核酸；iii)编码整联蛋白αIIb亚基的核酸；及iv)(i)、(ii)和(iii)的任何组合。
10.一种产生被修饰细胞的方法，所述被修饰细胞具有的粘连特性与未修饰细胞的所述粘连特性相比增加到至少三倍，所述方法包括向所述细胞中引入选自由以下组成的组的重组核酸a)编码整联蛋白β3亚基的核酸；b)编码整联蛋白αv亚基的核酸；c)编码整联蛋白αIIb亚基的核酸；及d)(a)、(b)和(c)的任何组合。
11.一种在培养容器中的细胞中产生病毒颗粒的方法，包括在病毒颗粒借以被产生的条件下，向所述培养容器的细胞中引入感染性病毒颗粒，其中所述细胞包括选自由以下组成的组的重组核酸i)编码整联蛋白β3亚基的核酸；ii)编码整联蛋白αv亚基的核酸；iii)编码整联蛋白αIIb亚基的核酸；及iv)(i)、(ii)和(iii)的任何组合。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述病毒颗粒是选自由以下组成的组的病毒的颗粒慢病毒、逆转录病毒、副黏病毒、正黏病毒、黄病毒、腺病毒、腺伴随病毒(AAV)、杆状病毒、微小核糖核酸病毒、α病毒、冠状病毒、疱疹病毒、乳头状瘤多型空泡形病毒和纤丝病毒。
13.如权利要求9、10或11所述的方法，其中所述细胞选自由BiG-45细胞、293.101细胞、B-241细胞、293T细胞、HEK293细胞、Dami细胞、中国仓鼠卵巢细胞、杂交瘤细胞、HUVEC细胞、和MS-5细胞所组成的组。
14.如权利要求9或11所述的方法，其中所述容器选自由烧瓶、瓶子、转瓶、皿、载玻片、试管、盖玻片、板及其任何组合所组成的组。
15.一种在培养容器的细胞中产生重组慢病毒颗粒的方法，包括在重组病毒颗粒借以被产生的条件下，向所述培养容器的所述细胞中引入，其中所述细胞包括选自由以下组成的组的重组核酸i)编码整联蛋白β3亚基的核酸；ii)编码整联蛋白αv亚基的核酸；iii)编码整联蛋白αIIb亚基的核酸；及iv)(i)、(ii)和(iii)的任何组合，I)第一载体，包括编码至少一种慢病毒结构蛋白的慢病毒核酸序列，其中所述载体(1)包括在编码慢病毒结构蛋白的至少一个基因中的至少一个缺陷，以及(2)包括缺陷包装信号；II)第二载体，包括慢病毒核酸序列，所述序列包括所述载体基因组逆转录所需的顺式作用序列元件，其中所述载体包括活性包装信号，以及III)第三载体，包括病毒核酸序列，其中所述第三载体(1)表达病毒包膜蛋白；以及(2)包括缺陷包装信号。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述第二载体对于表达至少一种慢病毒结构蛋白是缺陷的。
17.如权利要求15所述的方法，其中所述细胞是293.101细胞。
18.如权利要求15所述的方法，其中所述第一载体是gag-pol表达载体，以及其中所述载体包括env基因中的缺陷。
19.如权利要求18所述的方法，其中在所述env基因中的所述缺陷是缺失突变。
20.如权利要求15所述的方法，其中所述第一载体和所述第二载体各包括在env基因中的缺陷。
21.如权利要求15所述的方法，其中所述第三载体编码病毒包膜蛋白，其不是慢病毒包膜蛋白。
22.如权利要求21诉述的方法，其中所述第三载体编码水泡性口膜炎病毒G糖蛋白。
23.如权利要求15所述的方法，其中所述第二载体包括异源核酸。
24.如权利要求15所述的方法，其中所述慢病毒是非灵长类慢病毒。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述非灵长类慢病毒是马传染性贫血病毒(EIAV)。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述第一载体是质粒pEV53B；所述第二载体是质粒pESIN6.lCpuroW，以及所述第三载体是质粒pCl-VSV-G。
27.如权利要求15所述的方法，其中所述容器选自由烧瓶、瓶子、转瓶、皿、载玻片、试管、盖玻片、板及其任何组合所组成的组.
28.一种制造包装细胞的方法，包括以包括慢病毒核酸序列的载体转染权利要求1、2或3所述的细胞，其中所述载体包括缺陷包装信号。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述载体是gag-pol表达载体。
30.如权利要求28所述的方法，其中所述载体是质粒pEV53B。
31.一种包括权利要求1、2或3所述的细胞的包装细胞，其包括编码至少一种慢病毒结构蛋白的慢病毒核酸序列，其中所述核酸序列是包装信号缺陷的，如此所述细胞自身产生至少一种慢病毒结构蛋白，但不产生能够复制的感染性病毒。
全文摘要
本发明提供修饰细胞，其具有的粘连特性与未修饰细胞的粘连特性相比是增加的，其包括a)编码整联蛋白β
文档编号C12N15/11GK1980955SQ200580013798
公开日2007年6月13日 申请日期2005年4月28日 优先权日2004年4月29日
发明者J·C·奥尔森, M·帕特尔, D·A·威尔科克斯 申请人:北卡罗来纳-查佩尔山大学, Mcw研究基金会公司