专利名称：一种改进的间充质干细胞保护液及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种改进的间充质干细胞保护液、用途及其 制备方法。
背景技术：
间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是中胚层来源的一类具有多向分 化能力的干细胞，广泛存在于全身多种组织中，可在体外培养扩增，并能在特定条件下分化 成心肌细胞、神经细胞及脂肪细胞等。随着国内外学者对间充质干细胞生物学特性及功能 的深入研究，目前已经可以从多种组织中分离出间充质干细胞。间充质干细胞具有支持造 血和调节免疫等作用，在造血重建、组织修复、免疫治疗等方面具有广阔的临床应用前景。 间充质干细胞不表达MHC 11类分子及共刺激因子B7-1、B7-2、⑶40、⑶40L等，极少表达MHC I类分子，因此免疫原性弱。由于以上间充质干细胞的作用及特性，近年来，间充质干细胞被 用于临床多种疾病的临床试验及治疗中，并且表现出良好的应用前景。目前国内有资质开展大规模分离、扩增、培养人间充质干细胞的机构很少，而间充 质干细胞的临床应用范围却非常广泛，因此急需研究一种间充质干细胞保护液，使间充质 干细胞在此种保护液中活性维持时间较长，可以满足运输到国内大多数地区及周边国家的 要求，并且可以直接应用于人体，安全无毒。目前国内可以大量提供人间充质干细胞的机构通常是采用生理盐水或者细胞培 养基作为临床间充质干细胞应用时的溶液介质。如果将人间充质干细胞分离、培养、扩增 后，立即给病人应用，生理盐水是方便安全的，但是间充质干细胞在生理盐水中活力下降的 速度非常快，单纯用生理盐水保存间充质干细胞，2小时后细胞活力就会降低10%左右，因 此只适用于间充质干细胞的即时使用。现有的另外一种细胞保护液是将细胞培养基作为 成份之一，细胞培养基中含有细胞生长代谢所需的糖类、氨基酸、无机盐、维生素等物质，对 于维持细胞渗透压及活力有较好的作用，但是目前国内大部分细胞培养基均是仅供科研使 用，不作为临床应用的常规试剂，因此临床应用人间充质干细胞的同时直接应用细胞培养 基的安全性及可靠性不确定，并且细胞培养基由于生产厂家、生产方法的不同，质量、纯度、 价格也不等，纯度、质量都比较好的进口培养基价格更贵。现有技术是用TC199无血清培养基、人血白蛋白和低分子肝素钙配置的溶液作为 人间充质干细胞的保存液。该技术将人间充质干细胞分离、培养、收集后分别用含有 人血清白蛋白的TC199和含有1 %人血清白蛋白的生理盐水保存，细胞浓度为5 X 105/ml， 4度保存8小时后，生理盐水组的细胞活力明显低于TC199组；调整人血白蛋白的浓度，分 别使TC199中含有0. 5%、1%、2%、5%的人血白蛋白，1%、2%、5%的人血白蛋白对于保持 间充质干细胞的活力都是有益的；用含人血白蛋白的TC199分别配制含0. 01% EDTA、 75AXaIU/ml低分子肝素钠、75AXaIU/ml低分子肝素钙的溶液保存人间充质干细胞，发现低 分子肝素钙可以有效防止间充质干细胞聚集。总之现有技术是将TC199培养基、人血白蛋 白、低分子肝素钙作为保存液保存人间充质干细胞，干细胞可以保持90%以上的活力24小
3时，细胞活力随时间延长逐渐递减，并且可以防止干细胞与容器内壁的粘附。现有技术的缺点之一在于间充质干细胞保存液中的TC199是一种细胞培养基，细 胞培养基通常被用来进行细胞及组织培养，并非国家批准可以临床应用于人体的试剂，成 份复杂，不同生产厂家的培养基质量不一，进口试剂价格昂贵，而且近年来随着生物试剂领 域的不断发展，TC199已经逐渐退出培养基市场，被其它培养基所替代，因此其来源有限。 总之，尽管现有技术用TC199作为间充质干细胞保存液的有效成份可以保持细胞活力24小 时，从试剂来源、临床应用的合法性、试剂成本方面考虑都是不利于间充质干细胞临床推广 使用的。本发明的这种改进的间充质干细胞保护液中使用的溶液介质是5%葡萄糖注射液， 它是国家批准可以临床使用的试剂，用其替代TC199，价格低廉、来源丰富、临床应用安全可罪。现有技术的另外一个不足之处在于其保持间充质干细胞活力的时间较短，间充质 干细胞在现有技术的细胞保存液中可以保持90%以上活力仅24个小时，并且随着时间延 长，细胞活力下降，那么就意味着超过24小时，细胞活力将下降到90%以下，然而干细胞治 疗及临床试验已经在国内多数城市及国外多个国家开展，利用现有的交通工具，24小时的 活力维持时间明显限制了间充质干细胞的应用范围。而本发明将现有间充质干细胞保护液 进行改进，使间充质干细胞在此种保护液中保持90%以上活力可以维持48小时，这样就延 长了间充质干细胞的活性维持时间，大大扩大了临床干细胞广泛应用的范围，利用现有交 通工具，可以运输到国内大多数城市及周边国家。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明改进的间充质干细胞保护液是用5%葡萄糖注 射液、-5%人血白蛋白和低分子肝素钙作为有效成份，与现有技术的间充质干细胞保护 液相比，延长了间充质干细胞的活性维持时间，降低了保护液的制备成本、来源广泛、制备 简单、临床直接应用安全可靠，间充质干细胞在此种保护液中保存48小时后，细胞形态正 常、不影响其增殖扩增能力、不影响间充质干细胞表型特征。本发明所采用的技术方案是一种改进的间充质干细胞保护液，是含人血白蛋白注射液 1 % -5 % (体积比)和低分子肝素钙75AXaIU/ml的5% (质量比)葡萄糖注射液。所述的人血白蛋白注射液是含人血白蛋白10g/50ml的注射液。其中所述的人血白蛋白注射液的优选浓度为1%。其中所述的间充质干细胞为脐带间充质干细胞。所述5%葡萄糖注射液为临床批准使用的葡萄糖注射液。所述人血白蛋白注射液为临床批准使用的人血白蛋白注射液。所述低分子肝素钙为临床批准使用的低分子肝素钙。
图1 脐带间充质干细胞流式细胞术细胞表型分析结果
图2 脐带间充质干细胞经本发明保护液保存后的细胞表型分析结果技术效果葡萄糖是人体重要营养成分和主要热量来源之一，也是细胞代谢的主要能源物 质，葡萄糖经过细胞代谢分解成二氧化碳和水，临床常用葡萄糖注射液作为能量及水分的 补充液，5%葡萄糖作为一种等渗溶液通常被用来溶解药物应用于临床。基于葡萄糖的以上作用，本发明采用5%葡萄糖注射液代替TC199，结果表明间充 质干细胞在此种改进的细胞保护液中，在环境温度2-8°C时细胞活力在90%以上可以维持 48小时，细胞形态好，间充质干细胞特性保持不变，大大扩大了临床间充质干细胞的应用范 围，可以满足多国多地区的间充质干细胞应用需要。本发明采用临床上常用的5%葡萄糖注射液替代TC199，来源更丰富、成本更低 廉、安全性更高、细胞活性维持时间更长，扩大了临床间充质干细胞的应用范围，提高了干 细胞保护液直接应用的安全性及可靠性。本发明中所使用的细胞保存液成分均为临床批准使用的溶剂，其中白蛋白为临床 使用的人血白蛋白，肝素为临床使用的低分子肝素钙，避免间充质干细胞应用时所可能产 生的不良反应。
具体实施例方式1、脐带间充质干细胞的分离、培养及表型鉴定(1)将脐带在含100IU/L青霉素、100mg/L链霉素的无菌PBS缓冲液(Solarbio公 司)中浸泡10-15分钟。(2)用上述含青霉素、链霉素的无菌PBS缓冲液充分冲洗脐带，将脐带组织块尽量 剪碎，剪碎成Imm3小块。(3)将剪碎的组织加入到DMEM培养基(Gibco公司，美国)洗涤，在2000rpm条件 下离心10分钟，弃上清。(4)将胰酶(Sigma公司，美国)加入DMEM培养基中，配成终浓度为0. 25% (体积 比)的消化液，用消化液悬浮组织块，置于37°C培养箱中消化30分钟，离心，弃上清。(5)加入DMEM培养基悬浮组织块，将全部组织块接种到细胞培养皿中，置37°C、 5% CO2的饱和湿度培养箱(Thermo公司，美国)中培养。(6)组织块培养1周后全量换DMEM培养基，弃去组织块及非贴壁细胞。(7)以后每3天半量换DMEM培养基，每日观察细胞生长状态，观察细胞至80%融 合时，用上述消化液消化细胞，按1 3传代。(8)收集细胞以FITC标记的CD45、CD90、CD146(BD公司，美国)，PE标记的CD105、 CD34(BD公司)及HLA-DR(BD公司)进行流式细胞仪(Fascalibur，BD公司，美国)检测。脐带间充质干细胞流式细胞术细胞表型分析结果表明间充质干细胞高表达 〇090、、00105、00146，不表达0045、0034及!11^-01 。(如图 1)2、5%葡萄糖注射液(青岛华仁药业股份有限公司)及TC199培养基(Gibco公 司)对人间充质干细胞的影响(表1)以下所述的人血白蛋白注射液(含人血白蛋白10g/50ml)购自广东双林生物制药 有限公司，低分子肝素钙购自江苏万邦生化医药股份有限公司。
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(1)配置保存液I 含(体积比)人血白蛋白注射液+75AXaIU/ml低分子肝素 钙的TC199培养基(2)配置保存液II 含(体积比)人血白蛋白注射液+75AXaIU/ml低分子肝素 钙的(质量比)5%葡萄糖注射液(3)分别用上述两种细胞保护液重悬人脐带间充质干细胞，调整细胞浓度为 1 X 106/ml，置于灭菌的西林瓶中，每支2ml，置于4°C下，保存48小时，期间分别于第12、24、 36,48小时时用台盼兰染色计数间充质干细胞存活率。结果人脐带间充质干细胞在5%葡萄糖注射液组中4°C保存48小时后，细胞活 力仍然在90%以上，细胞形态不变，细胞膜光滑，细胞轮廓清晰，细胞大小均勻，细胞分散度 好，折光度好；而保存于TC199组的人脐带间充质干细胞在同样的条件下保存24小时细胞 活力即下降到90%以下，随着保存时间的延长，细胞活力下降明显，并且细胞形态变得大小 不等，细胞轮廓模糊，细胞体积变大。(表 1)
TC199培养基组细胞存活率5%葡萄糖组细胞存活率12小时91% (220-20) /22097.4% (229-6) /22924小时88.9% (216-24) /21695% (221-11) /22136小时78% (200-44) /20094.5% (220-12) /22048小时59.1% (198-81) /19892.9% (225-16) 7225细胞存活率=(细胞总数-着色细胞数)/细胞总数X 100%3、(体积比-10%人血白蛋白注射液浓度的选择(表2)(1)配置保存液I 含人血白蛋白注射液+75AXaIU/ml低分子肝素钙的5%葡 萄糖注射液(2)配置保存液II 含5%人血白蛋白注射液+75AXaIU/ml低分子肝素钙的5%葡 萄糖注射液(3)配置保存液III 含10%人血白蛋白注射液+75AXaIU/ml低分子肝素钙的5% 葡萄糖注射液分别用三种细胞保护液重悬人脐带间充质干细胞，调整细胞浓度为1 X 106/ml，置 于灭菌的西林瓶中，每支2ml，置于4°C，期间分别于12、24、48小时计数间充质干细胞存活率。结果人脐带间充质干细胞保存于含有不同浓度人血白蛋白注射液+75AXaIU/ml 低分子肝素钙的5%葡萄糖注射液的保护液中，人血白蛋白注射液浓度分别为1%、5%、 10%，结果表明-5%浓度的人血白蛋白对于细胞活力及形态的维持较适宜，并非人白 蛋白浓度越高，细胞活力越好。(表 2) 细胞存活率=(细胞总数-着色细胞数)/细胞总数X 100%4、人脐带间充质干细胞在保护液中保存48小时后细胞表型鉴定(图2)人脐带间充质干细胞在本发明的细胞保护液中(以含5%人血白蛋白注射液 +75AXaIU/ml低分子肝素钙的5%葡萄糖注射液为例)，在4°C下保存48小时后，流式细胞 仪检测细胞表面 CD45、CD90、CD146、CD105、CD34 及 HLA-DR。结果人脐带间充质干细胞在本发明的保护液中4°C保存48小时后，细胞表型不 变，符合间充质干细胞表型特征。(如图2)
权利要求
一种改进的间充质干细胞保护液，其特征在于是含人血白蛋白注射液体积比1％ 5％和低分子肝素钙75AXaIU/ml的质量比5％葡萄糖注射液。所述的人血白蛋白注射液是含人血白蛋白10g/50ml的注射液。
2.如权利要求1的保护液，所述的人血白蛋白注射液的优选浓度为体积比1%。
3.如权利要求1的保护液，所述的间充质干细胞为脐带间充质干细胞。
4.如权利要求13任一所述的保护液，所述5%葡萄糖注射液为临床批准使用的葡萄糖 注射液；所述人血白蛋白注射液为临床批准使用的人血白蛋白；所述低分子肝素钙为临床 批准使用的低分子肝素钙。
全文摘要
本发明涉及一种改进的间充质干细胞保护液、用途及其制备方法。该保护液可有效延长间充质干细胞的活性维持时间，降低保护液的制备成本，原料来源广泛、制备简单、临床直接应用安全可靠，间充质干细胞在此种保护液中保存48小时后，细胞活性仍在90％以上，细胞形态仍正常、不影响其增殖能力、不影响间充质干细胞表型特征。
文档编号A01N1/02GK101919380SQ20101024642
公开日2010年12月22日 申请日期2010年8月6日 优先权日2010年8月6日
发明者张学峰, 张美荣, 王丽, 胡建霞, 高宏, 魏斯溧 申请人:青岛奥克生物开发有限公司