专利名称：一种用于长期冻存脐带间充质干细胞的冻存液的制作方法
技术领域：
本发明属生物技术领域，具体涉及一种用于长期冻存脐带间充质干细胞的冻存液 及其制备方法。
背景技术：
间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一群中胚层来源的具有自我更 新和多向分化潜能的多能干细胞，其在骨髓、胎盘、脐带、羊膜、肌肉、胎儿肝脏、脐血等组织 中广泛存在，因其具有取材方便、体外扩增简单迅速等优点，在临床治疗中具有广阔的应用 前景。间充质干细胞不仅具有多向分化的能力，还具有支持造血、调节免疫等作用，国内外 已将间充质干细胞应用于大量动物试验及临床试验的研究中。间充质干细胞具有可以大量 扩增的特点，扩增后的干细胞有时需要被冻存起来，以备于科研及临床随时复苏使用。而现 有的细胞冻存常规技术是使用二甲基亚砜(DMSO)、胎牛血清、细胞培养基按照一定的比例 构成细胞冻存液，通常使用10% DMSOUO% -90%胎牛血清、其余份额由细胞培养基补足， 采用现有技术的细胞冻存液长期冻存间充质干细胞，复苏后细胞活力好，可以满足科研及 临床应用的需要。现有技术的缺点在于其冻存液中所使用的胎牛血清大多源于进口，进口血清价格 昂贵，而且欧洲多国发生疯牛病，进口胎牛血清的应用也受到了一定的限制。随着人们对细 胞冻存液的深入研究，还发现冻存液中添加的胎牛血清浓度与间充质干细胞的冻存效果呈 正相关，有研究表明长期与胎牛血清接触的间充质干细胞会对溶液介质中的胎牛血清发生 内吞，内吞胎牛血清后的间充质干细胞有可能发生某些蛋白表达的变化，应用于人体后有 可能发生异种动物蛋白引起的免疫反应，从而导致间充质干细胞移植后成功率降低以及不 良反应的发生。因此，在间充质干细胞长期冻存液中去除胎牛血清而以一些更加安全的试剂取而 代之无疑在间充质干细胞临床应用的安全性方面又迈进了一步。目前有一种间充质干细胞 冻存液，其中不含有胎牛血清，而是用人血白蛋白代替，但是其保存间充质干细胞活性的时 间短，不适宜间充质干细胞的长期冻存。
发明内容
针对现有技术的不足，发明人发现了一种新的胎牛血清替代品，即来源于脐带血 的血浆，用其制备的冻存液冻存间充质干细胞，可以长期保护间充质干细胞免受冷冻伤害， 复苏后活力可以达到传统冻存液长期冻存的效果。本发明采用以下技术方案一种间充质干细胞冻存液的制备方法，其包括以下步骤1)将脐带血置于无菌离心管中，在1000rpm-1200rpm条件下离心15-18分钟；2)吸取上清液，转移入新的离心管中，在4000g_4200g条件下离心18-20分钟，上 清即为冻存用脐血浆；3)取二甲基亚砜与上述冻存用脐血浆按体积比1 9比例混合均勻，即得间充质干细胞冻存液。该冻存液可用于间充质干细胞冻存。所述的间充质干细胞优选为脐带间充质干细胞，进一步的可优选为人脐带间充质 干细胞。本发明还特别包括利用上述方法制备的间充质干细胞冻存液。
图1 脐带间充质干细胞冻存复苏后流式细胞仪细胞表型检测结果。技术效果1、本发明冻存液中使用脐带血来源的血浆替代胎牛血清，脐带血来源丰富、采集 方法简单，脐血浆制备方法简单易行，用其替代胎牛血清冻存间充质干细胞，避免了细胞在 冻存过程中接触异种动物血清，并且降低了细胞冻存成本，细胞冻存效果与传统冻存方法 无异。2、间充质干细胞冻存液中含有胎牛血清最大的弊端在于间充质干细胞与其长期 接触会对胎牛血清产生内吞，从而引起细胞某些蛋白表达的变化，应用于人体后可能出现 某些异种蛋白引起的免疫反应，本发明采用脐带血浆，避免了上述不良反应。
具体实施例方式1、脐血浆的制备(1)将含有质量比2. 5%枸橼酸钠(可不含，不影响本发明的技术效果)的脐带血 置于50ml无菌离心管中，在IOOOrpm条件下离心15分钟；(2)吸取上清液，转移入新的离心管中，在4000g条件下离心20分钟，去除血小板， 上清即为冻存用脐血浆。2、间充质干细胞冻存液的制备I液取DMSO ( 二甲基亚砜，购自SIGMA)与上述脐血浆按体积比1 9比例混合 均勻，置于4°C下备用；II液取DMSO(二甲基亚砜)与胎牛血清(购自GIBC0)按体积比1 9比例混 合均勻，置于4°C下备用。3、脐带间充质干细胞的冻存及复苏后活力的检测(1)收集培养的脐带间充质干细胞，离心后分别用上述I液、II液重悬脐带间充质 干细胞，调整细胞浓度为IXlOfVml ；(2)将上述干细胞先后在4°C条件下放置30分钟，-20°C放置2小时，_80°C放置 16-18小时，然后置于液氮中长期保存一年；(3)从液氮中取出冻存间充质干细胞的小管置于37°C -40°C水浴中，迅速摇晃至 溶解，加入DMEM培养基中，在1500rpm下离心10分钟，弃上清；(4)DMEM培养基重悬脐带间充质干细胞，台盼兰染色计数细胞活性率(表1)。
细胞存活率=(细胞总数-着色细胞数)/细胞总数X 100%结果镜下观察两组复苏后的脐带间充质干细胞，大小均勻，细胞轮廓清晰完整， 折光度好；利用脐血浆制备的冻存液长期冻存脐带间充质干细胞后，细胞活力好，与胎牛血 清配制的冻存液冻存细胞效果无差别。4、脐带间充质干细胞复苏后细胞表型的检测将复苏后的细胞以FITC标记的⑶45、⑶90、⑶146(BD公司，美国)，PE标记的 ⑶105、⑶34 (BD公司，美国)及HLA-DR(BD公司，美国)进行流式细胞仪检测。结果本发明冻存液长期冻存的脐带间充质干细胞高表达⑶90、⑶105、⑶146，不 表达⑶45、⑶34、及HLA-DR，符合间充质干细胞表型特征(如图1)。
权利要求
一种间充质干细胞冻存液的制备方法，其特征在于包括以下步骤1)将脐带血置于无菌离心管中，在1000rpm 1200rpm条件下离心15 18分钟；2)吸取上清液，转移入新的离心管中，在4000g 4200g条件下离心18 20分钟，上清即为冻存用脐血浆；3)取二甲基亚砜与上述冻存用脐血浆按体积比1∶9比例混合均匀，即得间充质干细胞冻存液。
2.如权利要求1所述的方法制备的间充质干细胞冻存液。
3.如权利要求2所述的间充质干细胞冻存液的用途，其特征在于用于间充质干细胞长 期冻存。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述的间充质干细胞为脐带间充质干细胞。
5.如权利要求2所述的冻存液，其中所述的间充质干细胞为脐带间充质干细胞。
6.如权利要求3所述的用途，其中所述的间充质干细胞为脐带间充质干细胞。
全文摘要
本发明涉及一种用于长期冻存间充质干细胞的冻存液及其制备方法以及其用途，特别是脐带间充质干细胞。主要采用一种新的胎牛血清替代品，即来源于脐带血的血浆，用其制备的冻存液冻存间充质干细胞，可以长期保护间充质干细胞免受冷冻伤害，复苏后活力可以达到传统冻存液长期冻存的效果，并且避免了间充质干细胞在冷冻保存过程中接触异种动物源血清，使间充质干细胞的临床应用安全性更进了一步。
文档编号A01N1/02GK101919379SQ201010246419
公开日2010年12月22日 申请日期2010年8月6日 优先权日2010年8月6日
发明者张学峰, 张美荣, 王丽, 胡建霞, 高宏, 魏斯溧 申请人:青岛奥克生物开发有限公司