保留脐带血管获得间充质干细胞的制备方法
【专利说明】
[0001]技术领域:
本发明涉及一种保留脐带血管获得间充质干细胞的制备方法。
[0002]【背景技术】:
有报道表明脐带血管周围华通氏胶中分离培养的间充质干细胞未分化状态较好，并且分化能力较高，并有发现表明在脐带静脉内进行胰酶消化，然后将消化后的细胞进行培养，能够获得少量间充质干细胞。但现有脐带间充质干细胞提取方法主要从脐带中分离并废弃血管，未对脐带血管附着的间充质干细胞进行分离培养，而是直接获得华通氏胶以及脐带羊膜，然后进行培养，损失了高活性间充质干细胞。本发明最大限度保留脐带血管周围间充质干细胞，并能够使间充质干细胞与脐血细胞、上皮细胞、内皮细胞及血管来源细胞分离。
[0003]另外，现阶段脐带来源间充质干细胞向结缔组织分化研究较少，本发明能够通过使用不同诱导培养基培养细胞，使分离得到的间充质干细胞分化生成结缔组织，如骨组织、软骨组织、脂肪组织和肌肉组织，对今后的器官移植及疾病治疗具有重大意义。
[0004]
【发明内容】
:
本发明的目的是提供一种保留脐带血管获得间充质干细胞的制备方法。
[0005]上述的目的通过以下的技术方案实现:
一种保留脐带血管获得间充质干细胞的制备方法，该方法包括如下步骤:
(1)首先脐带的采集；
(2)对采集后的脐带进行脐带的运输和脐带的交接；
(3)对脐带华通氏胶及血管进行分离；
(4)进行原代培养和传代培养；
(5)结缔组织诱导培养；
(6)最后对保留脐带血管获得间充质干细胞冻存。
[0006]所述的保留脐带血管获得间充质干细胞的制备方法，步骤(I)首先脐带的采集方法是，足月胎儿娩出后即刻按产科常规结扎断脐截取脐带，用PBS磷酸缓冲盐溶液冲洗脐带，再用医用酒精消毒，将脐带置于脐带保存液中4°C恒温保存，从母体中抽取母血以及从胎盘端抽取脐血各5ml作为检测样本，从胎盘端另抽取脐血5ml做收集血清用，脐带保存液的成分为含青霉素100U/ml、链霉素100U/ml的PBS磷酸缓冲盐溶液。
[0007]所述的保留脐带血管获得间充质干细胞的制备方法，步骤(2)对采集后的脐带进行脐带的运输方法是，将脐血、母血检测样本和置于脐带保存液中保存的脐带送至交接实验室；交接实验室登记后将脐血、母血检测样本交给质控实验室做微生物学和免疫学检测，将脐带转交给分离实验室分离。
[0008]所述的保留脐带血管获得间充质干细胞的制备方法，步骤(3)对脐带华通氏胶及血管进行分离的方法是，所有操作都在生物安全柜中进行，用PBS洗脐带3次，目的是洗去血液，转入装有培养液的器皿中，剪下6cm脐带放入解剖板上，其余脐带30-45cm放入装有培养液的容器中，37°C孵育；拉直脐带，两端固定，沿纵向剪1-2_深并露出华通氏胶，分离上皮与华通氏胶，370C PBS冲洗，从一端开始分离血管，分离后将血管两端扎紧形成环状，并将血管放入50ml管中，其中含PBS为溶剂的0.5mg/ml胶原酶，37°C孵育，其它两条血管同样处理方法；对于血管周围组织，剪开剥去上皮细胞，剪碎，放入含胶原酶的50ml管中，上皮膜放入废弃桶；剩余30-45cm脐带同样方法处理。
[0009]所述的保留脐带血管获得间充质干细胞的制备方法，步骤(4)进行原代培养和传代培养方法是，在分离18-24小时后，血管瓶中上清用PBS稀释2-5倍，1150r离心5分钟，将离心后底部细胞部分用8倍体积的4%NH4C1室温下重悬5分钟，1150r离心5分钟，细胞计数后，转入培养瓶中培养，37°C孵育24-72小时，每2天换液一次；贴壁细胞每7天用0.1%胰酶传代一次，当达到80%-90%时，依此扩增可得到P5代的间充质干细胞。
[0010]所述的保留脐带血管获得间充质干细胞的制备方法，步骤(5)结缔组织诱导培养方法是，对于骨组织:接种于35mm培养皿或6孔板，细胞密度为4X 103 /cm2，添加培养基及地塞米松、β-Gp、抗坏血酸，诱导三周后，用茜素红染色，检测细胞成骨能力；对于脂肪:培养于6孔板添加培养基中，每2天换液一次，达到60%细胞时，换为脂肪诱导培养基，每2天换液一次，培养10天后，10%福尔马林固定，油红O将脂肪细胞脂质空泡染成红色。
[0011]所述的保留脐带血管获得间充质干细胞的制备方法，步骤(6)最后对保留脐带血管获得间充质干细胞冻存方法是，将P5代细胞加入2-8°C的冻存保护液中，分装到2ml的冻存管中，将冻存管置于程控降温仪中至_80°C，然后转移至液氮罐内保存，所述冻存保护液为含甘油1M、二甲基亚砜0.5M、甘露醇0.1M、自体脐血血清为10%的培养液DMEM/F12。
[0012]有益效果:
1.本发明脐带血管周围华通氏胶中分离培养的间充质干细胞未分化状态较好，并且分化能力较高，现有脐带间充质干细胞提取方法主要从脐带中分离并废弃血管，未对脐带血管附着的间充质干细胞进行分离培养。本发明能够最大限度保留脐带血管周围高分化活性的间充质干细胞，并能够使间充质干细胞与脐血细胞、上皮细胞、内皮细胞及血管来源细胞分离，避免高分化活性的间充质干细胞的损失，使储存、制备的间充质干细胞具有高度分化性能，为以后的治疗应用提供高分化活性原材料。
[0013]【附图说明】:
图1是制备出的P2人脐带间充质干细胞示意图。
[0014]图2是制备出的P2代间充质干细胞成骨诱导鉴定图成骨诱导图。
[0015]图3是制备出的P2代间充质干细胞成骨诱导鉴定图正常干细胞细胞图。
[0016]图4是制备出的P2代间充质干细胞成脂诱导鉴定图成脂肪诱导图。
[0017]图5是制备出的P2代间充质干细胞成脂诱导鉴定图正常干细胞细胞图图。
[0018]图6是制备出的P2代间充质干细胞的生长曲线图。
[0019]图7是制备出的P2代间充质干细胞表面标记的流式检测图。
[0020]图8是制备出的P2代间充质干细胞表面标记的流式检测图。
[0021]【具体实施方式】:
实施例1:
一种保留脐带血管获得间充质干细胞的制备方法，该方法包括如下步骤:
(1)首先脐带的采集；
(2)对采集后的脐带进行脐带的运输和脐带的交接； (3)对脐带华通氏胶及血管进行分离；
(4)进行原代培养和传代培养；
(5)结缔组织诱导培养；
(6)最后对保留脐带血管获得间充质干细胞冻存。
[0022]实施例2:
根据实施例1所述的保留脐带血管获得间充质干细胞的制备方法，步骤(I)首先脐带的采集方法是，足月胎儿娩出后即刻按产科常规结扎断脐截取脐带，用PBS磷酸缓冲盐溶液冲洗脐带，再用医用酒精消毒，将脐带置于脐带保存液中4°C恒温保存，从母体中抽取母血以及从胎盘端抽取脐血各5ml作为检测样本，从胎盘端另抽取脐血5ml做收集血清用，脐带保存液的成分为含青霉素100U/ml、链霉素100U/ml的PBS磷酸缓冲盐溶液。
[0023]实施例3:
根据实施例1或2所述的保留脐带血管获得间充质干细胞的制备方法，步骤(2)对采集后的脐带进行脐带的运输方法是，将脐血、母血检测样本和置于脐带保存液中保存的脐带送至交接实验室；交接实验室登记后将脐血、母血检测样本交给质控实验室做微生物学和免疫学检测，将脐带转交给分离实验室分离。
[0024]实施例4:
根据实施例1或2或3所述的保留脐带血管获得间充质干细胞的制备方法，步骤(3)对脐带华通氏胶及血管进行分离的方法是，所有操作都在生物安全柜中进行，用PBS洗脐带3次，目的是洗去血液，转入装有培养液的器皿中，剪下6cm脐带放入解剖板上，其余脐带30-45cm放入装有培养液的容器中，37°C孵育；拉直脐带，两端固定，沿纵向剪l_2mm深并露出华通氏胶，分离上皮与华通氏胶，37°C PBS冲洗，从一端开始分离血管，分离后将血管两端扎紧形成环状，并将血管放入50ml管中，其中含PBS为溶剂的0.5mg/ml胶原酶，37°C孵育，其它两条血管同样处理方法；对于血管周围组织，剪开剥去上皮细胞，剪碎，放入含胶原酶的50ml管中，上皮膜放入废弃桶；剩余30-45cm脐带同样方法处理。
[0025]实施例5:
根据实施例1或2或3或4所述的保留脐带血管获得间充质干细胞的制备方法，步骤
(4)进行原代培养和传代培养方法是，在分离18-24小时后，血管瓶中上清用PBS稀释2-5倍，1