一种悬浮-贴壁法制备饲养层细胞的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及饲养层（Feeder)细胞的制备方法，具体涉及一种悬浮-贴壁法制备饲 养层细胞的方法，属于体外细胞培养技术领域。
【背景技术】
[0002] 诱导型多潜能干细胞（inducedpluripotentstemcells，iPSCs)很多特性与胚 胎干细胞极为相似，能分化为几乎所有的成体细胞，由于其可通过细胞重编程技术从终末 分化的成体细胞得到，因此可获得患者特异性或疾病特异性的iPSCs，促使其成为研究疾病 发生机制、个体化药物治疗、药物筛选和细胞治疗的热点，进一步拉近了干细胞和临床疾病 治疗的距离。iPSCs在长期培养过程中容易发生分化和核型不稳定情况，在长期培养过程中 维持iPSCs正常不分化状态和自我更新能力是一项极具挑战性的工作。而长期培养在饲养 层体系中是维持iPSCs不分化状态和核型稳定最简单、直接和有效的方法，因此制备高质 量的Feeder成为培养iPSCs的关键技术。
[0003] 目前，Feeder制备方法主要有射线照射法和丝裂霉素（Mitomycin C，MMC)处 理法：Y射线法的优点是可大批量处理细胞，但是由于Y射线存在放射性污染及储存监 管程序繁琐，费用昂贵等缺点，世界上很多地区已找不到放射源，因此多数实验研究仍采用 MMC法来制备Feeder。小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblasts，MEFs)，是最 常用的Feeder细胞来源；而CF-1 MEFs是培养人iPSCs (hiPSCs)最常用的Feeder细胞来 源，具有增殖能力极强、可覆层生长、密度依赖性高、低密度时易发生老化等特点。
[0004] 传统MMC法制备CF-1 MEF Feeder时，通常需要将细胞以较低密度铺至细胞培养 皿/瓶中，待其长至<100%融合(保证细胞为单层存在)时，用MMC抑制其有丝分裂，在这一 过程中存在诸多问题：1) MEFs的生物学行为易受影响：由于MEFs低密度时易发生老化，分 泌hiPSCs必需营养因子的能力就会下降，可能影响到hiPSCs的生长状态；2)有丝分裂抑制 不充分或得到的Feeder质量不高：MEFs增长速度过快，易出现覆层生长，若此时用MMC直 接处理MEFs，部分细胞可能由于与MMC接触不充分、甚至接触不到MMC，产生细胞增殖抑制 不充分的现象，或需要延长MMC处理时间，而长时间接触MMC会影响细胞的状态，进而影响 所得Feeder支持hiPSCs的能力；3)处理时间受限：为了充分抑制细胞增殖并保证Feeder 的质量，最好在细胞生长至80%~90%融合时用MMC处理，但MEFs增殖速度很快，易出现覆层 生长从而错过最佳处理时间。因此，急需一种方法，既能获得高质量Feeder细胞，又能使操 作灵活方便。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种悬浮-贴壁法制备 饲养层细胞的方法；该方法可克服传统MMC法制备MEFFeeder时易出现细胞有丝分裂抑制 不充分、所得Feeder质量不高、MEFs增殖速度过快、最佳处理时间不易掌握等技术缺陷；本 发明方法既能充分抑制细胞有丝分裂，又能筛选出状态良好的细胞作为Feeder，可提高所 制备Feeder的质量，制备时间更为灵活方便。
[0006] 为了达到上述目的，本发明采用的技术方案如下： 一种悬浮-贴壁法制备饲养层细胞的方法，包括CF-1MEFs原代获取、CF-1MEFs传 代培养和悬浮-贴壁法CF-1MEFFeeder制备三个步骤，制备CF-1MEFFeeder时采用悬 浮-贴壁法，具体包括以下步骤： (1)CF-1MEFs原代（P0)获取： I、 取孕12. 5天的CF-1小鼠，脱颈处死、无菌条件下取出胚胎，用10mlPBS(即磷酸盐 缓冲液）清洗后放于无菌培养皿中；去除胚胎头部和内脏，用l〇mlPBS清洗2次； II、 将剩余组织移至新的无菌培养皿中，用无菌剪刀将组织剪碎，每个胚胎加入lml消 化液，同时吹打数次，放入培养箱中消化5min;加入与消化液等体积的培养液终止消化后 充分吹打尽量分散为单细胞； III、 将上述细胞悬液混匀后，每个T75培养瓶添加2个胚胎的细胞悬液和13ml培养 液，然后将培养瓶放到培养箱中培养，培养瓶上注明细胞名称、代次P0及日期。
[0007] (2)CF-1MEFs传代培养： ① 、P0代CF-1MEFs培养3天后，倒置显微镜下观察MEFs长满T75培养瓶底时，吸弃 培养液，用l〇mlPBS清洗细胞一遍，然后加入2ml消化液将其混至覆盖整个培养瓶底部； ② 、培养瓶置于培养箱中孵育3分钟，用手轻拍培养瓶侧壁使MEFs细胞脱落；用2ml培 养液终止消化，同时轻轻吹打形成单细胞悬液； ③ 、将上述细胞悬液均分到3个175培养瓶中（即为1 :3传代培养)，用培养液补至15ml 进行传代，放入培养箱中继续培养； ④ 、用此方法，将细胞传至第3代。
[0008] (3)、悬浮-贴壁法CF-1 MEF Feeder制备： A、CF-1MEFs传代至第3代的第4天后，吸弃培养液，用10mlPBS清洗细胞一遍，添加 2ml消化液于培养箱中消化3分钟，然后用手轻拍侧壁使细胞脱落，再用2ml培养液中止消 化，同时轻轻吹打形成单细胞悬液，将细胞收集到离心管中后计数； B、 将步骤A中收集的细胞按照8X104个/cm2~11X104个/cm2的密度转移至直径10cm 的细胞培养皿中，用培养液将总体积补至6ml，充分混匀； C、 将装有细胞的培养皿转移到培养箱中，细胞会逐渐贴至培养皿底壁，从放入培养箱 内开始计时，2~3小时后避光条件下将MMC加至上述培养皿中，将MMC浓度调整至lOPg/ml， 充分混匀后放回培养箱； D、 在培养箱中MMC处理0. 5小时~3. 5小时后，迅速吸弃培养皿中含MMC的培养液及未 贴壁细胞； 整个悬浮-贴壁过程是从步骤C中的细胞放入培养箱中开始，到步骤D中的MMC处理 结束为止，整个悬浮-贴壁过程(贴壁处理2~3小时+MMC处理时间)总时间要求彡3. 5小时 ~4. 5小时，可保证状态良好的细胞在3. 5小时~4. 5小时内贴壁；MMC最佳处理时间为0. 5 小时~3. 5小时，因此在合理时间范围内加入MMC可以尽可能的让状态好的细胞贴壁，从而 筛选出状态良好的细胞作为Feeder，提高Feeder的质量和回收细胞量； E、 贴壁细胞用6~8mlPBS冲洗7次，弃掉因冲洗脱落下来的细胞及PBS; F、 仍贴壁的细胞用lml消化液于培养箱中消化3分钟后，用手轻拍侧壁使细胞脱落； 用lml培养液终止消化，同时轻轻吹打形成单细胞悬液，将其收集到离心管中，1000转/分 钟条件下离心5分钟后弃掉上清液，沉淀细胞冻存备用。
[0009] 优选的，悬浮-贴壁法制备CF-1MEFFeeder时，步骤B中，所述的细胞按照9X104 个/cm2~10X104个/cm2的密度转移至直径10cm的细胞培养皿中。
[0010] 优选的，悬浮-贴壁法制备CF-1MEFFeeder时，步骤F中，冻存液配方各成分体 积比为为培养液：胎牛血清（FBS):二甲基亚砜（DMS0)