专利名称：一种制备饲养层细胞的方法
技术领域：
本发明涉及一种制备饲养层细胞的方法。
背景技术：
饲养层细胞是用特定的细胞(如皮肤成纤维细胞、输卵管上皮细胞等)经射线照射或丝裂霉素-C等阻断有丝分裂处理后制备的单层细胞，饲养层细胞能分泌成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子等促有丝分裂因子，促进胚胎干细胞(Embryonic stem cell, ES细胞)的增殖，同时也能分泌白血病抑制因子(Leukemia inhibitory {actor, LIF)等细胞分化抑制因子，抑制ES细胞的分化。ES细胞是从胚胎内细胞团或原始生殖嵴中分离，经体外抑制分化培养获得的一种高度未分化的具有多发育潜能性的细胞系。ES细胞对体外培养条件要求极为严格，饲养层的质量好坏直接关系到ES细胞的分离成功与否。小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层能有效促进胚胎干细胞及诱导多能性干细胞增殖并维持其未分化特性和多潜能性，故而常用于ES 细胞的体外分离培养，是各实验室开展干细胞研究的前提，是干细胞研究不可缺少的环节。 目前小鼠胚胎成纤维细胞fmouse embryonic fibroblast，MEF)制备饲养层主要使用的方法有、射线照射或者使用丝裂霉素C处理。、射线的优点是可大批处理MEF细胞，但是一些小的实验室不具备实验条件。因此多数实验研究均采用丝裂霉素C处理MEF来制备饲养层。但是，目前分离培养饲养层细胞的方法大多数属于经验性，制备过程繁琐，工作量大，细胞处理的方法、条件尚无确切的规程和报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种制备饲养层细胞的方法。本发明提供的制备饲养层细胞的方法，包括如下步骤(1)将离体的成纤维细胞用10 μ g/ml丝裂霉素C处理，分别收集培养液上清和贴壁细胞；(2)将离体的成纤维细胞用前一步骤收集的培养液上清处理，收集贴壁细胞；在所述步骤(1)和所述步骤( 之间还包括0至2次的如下步骤将离体的成纤维细胞用前一步骤收集的培养液上清处理，分别收集培养液上清和贴壁细胞；以上每一步骤得到的贴壁细胞均为饲养层细胞。所述步骤(1)中，所述成纤维细胞(离体的)具体可在含10 μ g/ml丝裂霉素C的完全培养基中进行所述处理。所述完全培养基可为任何市售的用于细胞培养的完全培养基，具体可由DMEM培养基和如下溶质组成10% (体积比)FBS，2mmol/Lglutamine。所述步骤(1)，和/或所述步骤O)，和/或所述步骤⑴和所述步骤⑵之间的步骤中，所述处理的条件具体可为37°C、5% CO2培养箱中培养2.证。在进行所述方法前，所述成纤维细胞可先进行传代；用传代后的成纤维细胞(离体的)进行所述步骤(1)，和/或所述步骤O)，和/或所述步骤(1)和所述步骤( 之间的步骤。所述传代的方法具体如下将所述成纤维细胞(离体的)进行消化后培育2-4天 (如2-3天)，然后进行(1 3)-(1 幻传代。所述传代的次数具体可为2-5次(如3-5 次)，优选为3次。所述成纤维细胞(离体的)进行所述消化后培育2-4天后达到的细胞密度具体可为 80-90% ο所述方法还可包括将所述贴壁细胞进行消化的步骤。所述方法优选包括如下步骤将每一步骤得到的所述贴壁细胞消化后立即于4°C 放置30分钟，然后置于-80°C。进行所述4°C放置之前，所述贴壁细胞具体可用完全培养基重悬并与4°C预冷的2X冻存液等体积混合。所述完全培养基具体可由DMEM培养基和如下溶质组成10% (体积比)FBS，2mmol/L glutamine。所述2X冻存液具体可由DMEM培养基和如下溶质组成10% (体积比)DMS0，10% (体积比)FBS，2mmol/Lglutamine。所述成纤维细胞(离体的)具体可为小鼠胚胎成纤维细胞(离体的)。所述饲养层细胞具体可为用于培养胚胎干细胞的饲养层细胞以上任一所述方法得到的饲养层细胞也属于本发明的保护范围。所述饲养层细胞可用于培养胚胎干细胞，如人胚胎干细胞。本发明提供一种较为简捷易掌握的饲养层制备方法，为培养ESC、iPS细胞并开展相关研究奠定了基础。利用该方法制备成纤维细胞饲养层，既简化了实验操作，又节省了实验费用。丝裂霉素C作为一种细胞分裂抑制剂，同时也属于剧毒化学药品，应尽量减少用量。本发明提供的方法中，丝裂霉素C可重复利用2-4次，节约了成本，减少了剧毒药品的用量。本发明提供的方法中，细胞传代不用计数，通过比例及细胞状态来控制，克服计数主观性及不准确性，每次传代及丝裂霉素C处理细胞都处于最好状态，传代间隔2-4天，细胞状态不好及时丢弃，不再进行丝裂霉素C处理及冻存，防止浪费试剂耗材，同时减小对后期实验的影响。本发明提供的方法中，冻存细胞时尽量减少常温状态冻存液与细胞接触时间， 这对得到的饲养细胞质量至关重要。本发明提供的制备饲养层细胞的方法流程简单、经济、效果可靠。经人胚胎干细胞培养实验表明，利用本方法制备的饲养层细胞能够长期长活，并能有效的支持人胚胎干细胞的生长并使其保持未分化状态。
图1为实施例1中内细胞团接种后第7天的照片(尼康倒置显微镜(TS-100_F)40 倍)。图2为实施例1中人胚胎干细胞第5次传代后第5天的照片(尼康倒置显微镜 (TS-100-F)40 倍)。图3为实施例1中人胚胎干细胞第5次传代后第5天的碱性磷酸酶染色结果(尼康倒置显微镜(TS-100-F) 40倍)。图4为实施例1中人胚胎干细胞第5次传代后第5天检测细胞全能型相关细胞因子的(nanog，Oct-4, SSEA-3)表达情况。
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图5为实施例1中人胚胎干细胞第10次传代后第5天检测细胞染色体核型。图6为实施例2中将步骤(7)得到的细胞作为饲养层细胞，人胚胎干细胞第5次传代后第5天的照片(尼康倒置显微镜(TS-100-F) 40倍)。图7为实施例2中将步骤⑶得到的细胞作为饲养层细胞，人胚胎干细胞第5次传代后第5天的碱性磷酸酶染色结果(尼康倒置显微镜(TS-100-F) 40倍)。图8为实施例2中人胚胎干细胞第5次传代后第5天检测细胞全能型相关细胞因子的(nanog，Oct-4, SSEA-3)表达情况。图9为实施例2中人胚胎干细胞第10次传代后第5天检测细胞全能型相关细胞因子的(nanog，Oct-4, SSEA-3)表达情况。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。丝裂霉素C 液(MitomycinC)购自 Sigma，货号为 M^87。PBS 缓冲液购自 GIBC0，货号 14190-144。完全培养基由DMEM培养基(购自Invitrogen，货号11960-044)和如下溶质组成10% (体积比)FBS (购自 Invitrogen,货号 12484028)，2mmol/L glutamine (购自 Chemicon，货号 TMS-002-C)。人胚胎干细胞培养液由Knockout DMEM(Invitrogen，10829018)DMEM 培养基和如下溶质组成15% (体积比)Knockout Serum R 印 lacer (KOSR) (Invitrogen ；货号 0828-028) ,5 % (体积比)FBS (购自 Hyclone,货号 SH30070-03)，2mmol/Lglutamine， 4ng/ml basic fibroblast growth factor(bFGF)(Invitrogen,货号 13256029),0. ImM 2-Mercaptoethanol (β JflSZiII ；Chemicon, ^ES-007-E) ,0. ImMNonessential Amino acids (Chemicon，货号 TMS-001-C)。2 X冻存液由DMEM培养基和如下溶质组成10 % (体积比)DMSO (购自Sigma，货 D2650), 10% (体积比)FBS，2mmol/L glutamine。ICR孕鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。消化液Trypsin-EDTA(0. 05% Trypsin with EDTA 4Na ；IX)购自 Gibco，货号 25300054。用于检测细胞因子nanog的一抗购自Santa Cruz Biotechnology,货号为 sc-30332。用于检测细胞因子Oct-4的一抗购自(Santa Cruz Biotechnology，货号为 sc-8629。用于检测细胞因子SSEA-3的一抗购自Santa Cruz Biotechnology,货号为 sc-21703。实施例1、饲养层细胞的制备和应用效果—、饲养层细胞的制备
1、制备小鼠胚胎成纤维细胞(原代细胞)(1)取13.5天ICR孕鼠，断颈处死，在酒精中浸泡数秒消毒，控干酒精后置于一个无菌的培养皿中；无菌条件下暴露子宫，用镊子提起近子宫颈端，分离子宫系膜，剪断子宫角；取出整个子宫，置于有PBS缓冲液的平皿内，用PBS缓冲液洗涤三次，弃除表面残余血迹。(2)沿子宫系膜侧剪开子宫，取出带有胎膜的胚胎，置于另一盛有PBS缓冲液的平皿内，充分洗涤，弃除表面红细胞；用小镊子撕破胎膜，取出胎鼠，弃除胎膜，用PBS缓冲液洗涤三次；剪去胎鼠头部、四肢和腹部以及内脏，将躯干部置于另一盛有PBS缓冲液的平皿内，用PBS缓冲液至少洗涤三次，充分弃除红细胞。(3)将步骤( 的胚胎组织尽量剪碎，加入5ml消化液37°C消化十分钟，间隔三分钟摇晃一次；lOOOrpm/min离心5min，弃上清，收集细胞沉淀(P0代)。(4)用完全培养基重悬细胞沉淀(P0代)，接种至IOOmm培养皿中(一个胎鼠获得的细胞沉淀接种一个IOOmm皿)。也可采用市售的成纤维细胞(如小鼠胚胎成纤维细胞)进行后续实验，可以得到相同的实验效果。 2、小鼠胚胎成纤维细胞的传代传代过程中细胞培养均采用完全培养基，传代均在IOOmm培养皿中进行。(1)观察步骤1的PO代细胞的贴壁情况，3天后细胞密度达到90%左右。(2)将步骤⑴的细胞进行消化后1 3传代，即为Pl代，培养2天后细胞密度达到90%左右。(3)将步骤⑵的细胞进行消化后1 3传代，即为P2代，培养2天后细胞密度达到90%左右。(4)将步骤⑶的细胞进行消化后1 3传代，即为P3代，培养2天后细胞密度达到90%左右。(5)收集10皿步骤(4)的细胞，加入含10 μ g/ml丝裂霉素C的完全培养基，37°C、 5% CO2培养箱中培养2. 5h ；收集培养液上清(含丝裂霉素C)；贴壁细胞用PBS缓冲液冲洗 5次，消化后离心，细胞沉淀重悬于完全培养基，每个IOOmm培养皿的细胞用1. 5ml培养液重悬，分装到冻存管内(每只0.5毫升)，然后加入0.5ml预冷的2 X冻存液，迅速混勻，立即放到4°C冰箱30分钟，然后放到_80°C冰箱过夜，转入液氮罐中长期保存。(6)收集10皿步骤(4)的细胞，加入步骤(5)收集的培养液上清，37°C、5% CO2培养箱中培养2. ;收集培养液上清(含丝裂霉素C)；贴壁细胞用PBS缓冲液冲洗5次，消化后离心，细胞沉淀重悬于完全培养基，每个IOOmm培养皿的细胞用1. 5ml培养液重悬，分装到冻存管内(每只0. 5毫升)，然后加入0. 5ml预冷的2 X冻存液，迅速混勻，立即放到4°C 冰箱30分钟，然后放到_80°C冰箱过夜，转入液氮罐中长期保存。(7)收集10皿步骤(4)的细胞，加入步骤(6)收集的培养液上清，37°C、5% CO2培养箱中培养2. ;收集培养液上清(含丝裂霉素C)；贴壁细胞用PBS缓冲液冲洗5次，消化后离心，细胞沉淀重悬于完全培养基，每个IOOmm培养皿的细胞用1. 5ml培养液重悬，分装到冻存管内(每只0. 5毫升)，然后加入0. 5ml预冷的2 X冻存液，迅速混勻，立即放到4°C 冰箱30分钟，然后放到_80°C冰箱过夜，转入液氮罐中长期保存。
(8)收集10皿步骤(4)的细胞，加入步骤(7)收集的培养液上清，37°C、5% CO2培养箱中培养2. 5h ；弃培养液上清；贴壁细胞用PBS缓冲液冲洗5次，消化后离心，细胞沉淀重悬于完全培养基，每个IOOmm培养皿的细胞用1.5ml培养液重悬，分装到冻存管内(每只0. 5毫升)，然后加入0. 5ml预冷的2X冻存液，迅速混勻，放到4°C冰箱30分钟，然后放到_80°C冰箱过夜，转入液氮罐中长期保存。二、饲养层细胞的应用效果分别检测步骤( 保存的细胞、步骤(6)保存的细胞、步骤(7)保存的细胞和步骤 (8)保存的细胞作为饲养层细胞的应用效果，具体步骤如下1、用0.丨“^明胶处理培养板力？！力^ CO2培养箱中孵育半小时备用。2、将保存的饲养层细胞解冻，每只冻存管解冻后，细胞可接种至6个4孔板(或6 个35mmDish)中，37°C、5% CO2培养箱中培养8小时，备用。3、吸弃培步骤2的培养液上清，用人胚胎干细胞培养液漂洗一次，然后每孔加入 500微升人胚胎干细胞培养液，37°C、5% CO2培养箱中培养2小时。4、利用离体人囊胚期胚胎，用机械法分离内细胞团细胞，将其接种至步骤3的饲养层细胞上，培养7天后用机械法进行第一次传代，之后每5天传代一次，每次原孔留10个切割消化后的小克隆；每天更换新的人胚胎干细胞培养液；连续观察培养过程中的细胞克隆形态。采用步骤(8)保存的细胞作为饲养层细胞，内细胞团细胞(人胚胎干细胞)接种后第7天的照片见图1，克隆周围的细胞是饲养层细胞。采用步骤(5)保存的细胞、步骤(6) 保存的细胞或步骤(7)保存的细胞作为饲养层细胞，内细胞团细胞(人胚胎干细胞)接种后第7天的照片与图1 一致。采用步骤(8)保存的细胞作为饲养层细胞，人胚胎干细胞第5次传代后第5天的照片见图2，可见细胞边界清晰。采用步骤(5)保存的细胞、步骤(6)保存的细胞或步骤(7) 保存的细胞作为饲养层细胞，人胚胎干细胞第5次传代后第5天的照片与图2 —致。采用步骤(8)保存的细胞作为饲养层细胞，人胚胎干细胞第5次传代后第5天进行碱性磷酸酶染色的照片见图3，可见细胞染色阳性。采用步骤( 保存的细胞、步骤(6)保存的细胞或步骤(7)保存的细胞作为饲养层细胞，人胚胎干细胞第5次传代后第5天进行碱性磷酸酶染色的照片与图3 —致。采用步骤(8)保存的细胞作为饲养层细胞，人胚胎干细胞第5次传代后第5天检测细胞全能型相关细胞因子的(nanOg，0ct-4，SSEA-3)表达情况，照片见图 4，各个细胞因子的检测结果均为阳性。采用步骤( 保存的细胞、步骤(6)保存的细胞或步骤(7)保存的细胞作为饲养层细胞，人胚胎干细胞第5次传代后第5天检测细胞全能型相关细胞因子的(nanog，Oct-4, SSEA-3)表达情况，照片与图4 一致。采用步骤(8)保存的细胞作为饲养层细胞，人胚胎干细胞第10次传代后第5天检测细胞核型，见图5，细胞核型正常，为46XX。采用步骤(5)保存的细胞、步骤(6)保存的细胞或步骤(7)保存的细胞作为饲养层细胞，人胚胎干细胞第10次传代后第5天检测细胞核型，图片与图5—致。采用本发明提供的饲养层细胞，人胚胎干细胞经传代五十次后，所得到的干细胞仍然保持良好的全能性。也可用所述饲养层细胞培养其它现有的人胚胎干细胞，同样可以长时间的维持细胞全能型。
实施例2、饲养层细胞的制备和应用效果一、饲养层细胞的制备小鼠胚胎成纤维细胞购自美国sciencell公司，货号为M7M0。2、小鼠胚胎成纤维细胞的传代传代过程中细胞培养均采用完全培养基，传代均在IOOmm培养皿中进行。(1)培养小鼠胚胎成纤维细胞(P0代细胞)，观察贴壁情况，3天后细胞密度达到 90%左右。(2)将步骤到80%左右。(3)将步骤到80%左右。(4)将步骤到80%左右。(5)将步骤到80%左右。(6)将步骤到80%左右。(7)收集10皿步骤(6)的细胞，加入含10 μ g/ml丝裂霉素C的完全培养基，37°C、 5% CO2培养箱中培养2. 5h ；收集培养液上清(含丝裂霉素C)；贴壁细胞用PBS缓冲液冲洗 5次，消化后离心，细胞沉淀重悬于完全培养基，每个IOOmm培养皿的细胞用1. 5ml培养液重悬，分装到冻存管内(每只0.5毫升)，然后加入0.5ml预冷的2 X冻存液，迅速混勻，立即放到4°C冰箱30分钟，然后放到_80°C冰箱过夜，转入液氮罐中长期保存。(8)收集10皿步骤(6)的细胞，加入步骤(7)收集的培养液上清，37°C、5% CO2培养箱中培养2. ;收集培养液上清(含丝裂霉素C)；贴壁细胞用PBS缓冲液冲洗5次，消化后离心，细胞沉淀重悬于完全培养基，每个IOOmm培养皿的细胞用1. 5ml培养液重悬，分装到冻存管内(每只0.5毫升)，然后加入0.5ml预冷的2 X冻存液，迅速混勻，立即放到4°C 冰箱30分钟，然后放到_80°C冰箱过夜，转入液氮罐中长期保存。二、饲养层细胞的应用效果分别检测步骤(7)保存的细胞和步骤(8)保存的细胞作为饲养层细胞的应用效果，具体步骤如下1、用0. !^明胶处理培养板力了！力^ CO2培养箱中孵育半小时备用。2、将保存的饲养层细胞解冻，每只冻存管解冻后，细胞可接种至6个4孔板(或6 个35mmDish)中，37°C、5% CO2培养箱中培养8小时，备用。3、吸弃培步骤2的培养液上清，用人胚胎干细胞培养液漂洗一次，然后每孔加入 500微升人胚胎干细胞培养液，37°C、5% CO2培养箱中培养2小时。4、利用离体人囊胚期胚胎，用机械法分离内细胞团细胞，将其接种至步骤3的饲养层细胞上，培养7天后用机械法进行第一次传代，之后每5天传代一次，每次原孔留10个切割消化后的小克隆；每天更换新的人胚胎干细胞培养液；连续观察培养过程中的细胞克隆形态。
(1)的细胞进行消化后1 5传代，即为Pl代，培养3天后细胞密度达
(2)的细胞进行消化后1 5传代，即为P2代，培养3天后细胞密度达
(3)的细胞进行消化后1 5传代，即为P3代，培养3天后细胞密度达
(4)的细胞进行消化后1 5传代，即为P4代，培养3天后细胞密度达
(5)的细胞进行消化后1 5传代，即为P5代，培养3天后细胞密度达
采用步骤(7)保存的细胞作为饲养层细胞，内细胞团细胞(人胚胎干细胞)第5 次传代后第5天的照片见图6，可见细胞边界清晰。采用步骤(8)保存的细胞作为饲养层细胞，内细胞团细胞(人胚胎干细胞)第5次传代后第5天的照片见图7，可见细胞边界清晰。 采用步骤(7)保存的细胞作为饲养层细胞，人胚胎干细胞第5次传代后第5天检测细胞全能型相关细胞因子的(nanog，Oct-4, SSEA-3)表达情况，照片见图8，各个细胞因子的检测结果均为阳性。采用步骤(8)保存的细胞作为饲养层细胞，人胚胎干细胞第5次传代后第 5天检测细胞全能型相关细胞因子的(nanog，Oct-4, SSEA-3)表达情况，照片与图8 一致。采用步骤(7)保存的细胞作为饲养层细胞，人胚胎干细胞第10次传代后第5天检测细胞全能型相关细胞因子的(nanog，Oct-4, SSEA-3)表达情况，照片见图9，各个细胞因子的检测结果均为阳性。采用步骤(8)保存的细胞作为饲养层细胞，人胚胎干细胞第10次传代后第5天检测细胞全能型相关细胞因子的(nanog，Oct-4，SSEA-3)表达情况，照片与图 9 一致。采用本发明提供的饲养层细胞，人胚胎干细胞经传代五十次后，所得到的干细胞仍然保持良好的全能性。
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权利要求
1.一种制备饲养层细胞的方法，包括如下步骤(1)将离体的成纤维细胞用10μ g/ml丝裂霉素C处理，分别收集培养液上清和贴壁细胞；(2)将离体的成纤维细胞用前一步骤收集的培养液上清处理，收集贴壁细胞；在所述步骤⑴和所述步骤⑵之间还包括0至2次的如下步骤将离体的成纤维细胞用前一步骤收集的培养液上清处理，分别收集培养液上清和贴壁细胞； 以上每一步骤得到的贴壁细胞均为饲养层细胞。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(1)中，所述成纤维细胞在含 10 μ g/ml丝裂霉素C的完全培养基中进行所述处理。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述步骤(1)，和/或所述步骤O)，和 /或所述步骤(1)和所述步骤( 之间的步骤中，所述处理的条件为37°C、5% CO2培养箱中培养2. 5h。
4.如权利要求1至3中任一所述的方法，其特征在于在进行所述方法前，所述成纤维细胞先进行传代；用传代后的成纤维细胞进行所述步骤(1)，和/或所述步骤0)，和/或所述步骤(1)和所述步骤( 之间的步骤。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述传代的方法如下将所述成纤维细胞进行消化后培育2-4天，然后进行(1 3)-(1 幻传代。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于所述成纤维细胞进行所述消化后培育2-4 天后达到的细胞密度为80-90%。
7.如权利要求1至6中任一所述的方法，其特征在于所述方法还包括将所述贴壁细胞进行消化的步骤；所述方法优选包括如下步骤将每一步骤得到的所述贴壁细胞消化后立即于4°C放置30分钟，然后置于_80°C。
8.如权利要求1至7中任一所述的方法，其特征在于所述成纤维细胞为小鼠胚胎成纤维细胞；所述饲养层细胞为用于培养胚胎干细胞的饲养层细胞。
9.权利要求1至8中任一所述方法得到的饲养层细胞。
10.权利要求9所述饲养层细胞在培养胚胎干细胞中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种制备饲养层细胞的方法。本发明提供的方法，包括如下步骤(1)将离体的成纤维细胞用10μg/ml丝裂霉素C处理，分别收集培养液上清和贴壁细胞；(2)将离体的成纤维细胞用前一步骤收集的培养液上清处理，收集贴壁细胞；在所述步骤(1)和所述步骤(2)之间还包括0至2次的如下步骤将离体的成纤维细胞用前一步骤收集的培养液上清处理，分别收集培养液上清和贴壁细胞；以上每一步骤得到的贴壁细胞均为饲养层细胞。本发明提供的制备饲养层细胞的方法流程简单、经济、效果可靠。经人胚胎干细胞培养实验表明，利用本方法制备的饲养层细胞能够长期传代，并能有效的支持人胚胎干细胞的生长并使其保持未分化状态。
文档编号C12N5/0735GK102277329SQ20111023737
公开日2011年12月14日 申请日期2011年8月18日 优先权日2011年8月18日
发明者严杰, 乔杰, 于洋, 张妍, 李蓉, 闫丽盈, 靳红艳 申请人:北京大学第三医院