150r离心5分钟，将离心后底部细胞部分用8倍体积的4%NH4C1室温下重悬5分钟，1150r离心5分钟，细胞计数后，转入培养瓶中培养，37°C孵育24-72小时，每2天换液一次；贴壁细胞每7天用0.1%胰酶传代一次，当达到80%-90%时，依此扩增可得到P5代的间充质干细胞。
[0026]实施例6:
根据实施例1或2或3或4或5所述的保留脐带血管获得间充质干细胞的制备方法，步骤(5)结缔组织诱导培养方法是，对于骨组织:接种于35mm培养皿或6孔板，细胞密度为4X103 /cm2，添加培养基及地塞米松、β _Gp、抗坏血酸，诱导三周后，用茜素红染色，检测细胞成骨能力；对于脂肪:培养于6孔板添加培养基中，每2天换液一次，达到60%细胞时，换为脂肪诱导培养基，每2天换液一次，培养10天后，10%福尔马林固定，油红O将脂肪细胞脂质空泡染成红色。
[0027]实施例7: 根据实施例1或2或3或4或5或6所述的保留脐带血管获得间充质干细胞的制备方法，步骤(6)最后对保留脐带血管获得间充质干细胞冻存方法是，将P5代细胞加入2-8°C的冻存保护液中，分装到2ml的冻存管中，将冻存管置于程控降温仪中至_80°C，然后转移至液氮罐内保存，所述冻存保护液为含甘油1M、二甲基亚砜0.5M、甘露醇0.1M、自体脐血血清为1 %的培养液DMEM/F12。
[0028]实施例8:
根据实施例1或2或3或4或5或6或7保留脐带血管获得间充质干细胞的制备方法，
以下是对最佳实施例制备出的P2代脐带间充质干细胞进行的如下测试:所涉及的参数是由下述仪器测定的:倒置显微镜、FACSCanto流式细胞仪、酶标仪、培养箱、低温冰箱、液氮罐等。
[0029]一 )显微镜拍照
培养出的P2代人脐带间充质干细胞融合至60-80%，将其置于倒置显微镜下拍照，细胞形状为短梭形，大小均一，排列整齐，如图1所示。
[0030]二)多向分化能力鉴定
检测成骨能力:将P2细胞接种于35mm培养皿或6孔板，细胞密度为4X 10 3 /cm2，添加培养基(75% alpha-MEM或DMEM、15% FBS、10%抗生素)及 1(Γ8地塞米松、5 mM β -Gp,50 μδ/ml抗坏血酸，诱导三周后，用茜素红染色，检测细胞成骨能力，如图2和图3所示。
[0031]检测脂肪分化能力:培养于6孔板添加培养基中，每2天换液一次，达到60%细胞时，换为脂肪诱导培养基(88%DMEM、3%FBS、33PM生物素、17μΜ泛酸、5μΜ PPAR- Y、10nM牛胰岛素、?μΜ地塞米松、200μΜ异丁基甲基黄嘌呤、10%抗生素)，每2天换液一次，培养10天后，10%福尔马林固定，油红O将脂肪细胞脂质空泡染成红色，如图4和图5所示。
[0032]三)生长曲线的绘制
取制备好的Ρ2代细胞，消化至单细胞悬液；以含10%牛血清的培养液DMEM/F12调整浓度至lX104/ml，点加入96孔板中；设13组每组8个复孔，每孔200 μ 1，置于37°C、含5%的C02、饱和湿度的培养箱中培养；每2天换液，分别在培养至1、3、5、7天后，每孔加20 μ I的浓度为5mg/mL的噻唑蓝(MTT)，继续培养；4小时后小心移去培养上清；每孔加入ΙΟΟμ I的二甲基亚砜，微量振荡器震荡5分钟；置酶标仪上测570nm或490nm下的光吸收值，统计学分析后绘制出生长曲线，增殖状态良好，无异常，如图6所示。
[0033]四)流式细胞检测
将5 X 16细胞消化成单细胞悬液；以PBS洗涤两遍后调整浓度至1X10 5/ml，流式细胞仪检测细胞表面标记⑶73和⑶105，阳性细胞率均超过95%，符合间充质干细胞的特征，如图7和图8所示。
【主权项】
1.一种保留脐带血管获得间充质干细胞的制备方法，其特征是:该方法包括如下步骤: (1)首先脐带的采集； (2)对采集后的脐带进行脐带的运输和脐带的交接； (3)对脐带华通氏胶及血管进行分离； (4)进行原代培养和传代培养； (5)结缔组织诱导培养； (6)最后对保留脐带血管获得间充质干细胞冻存。
2.根据权利要求1所述的保留脐带血管获得间充质干细胞的制备方法，其特征是:步骤(I)首先脐带的采集方法是，足月胎儿娩出后即刻按产科常规结扎断脐截取脐带，用PBS磷酸缓冲盐溶液冲洗脐带，再用医用酒精消毒，将脐带置于脐带保存液中4°C恒温保存，从母体中抽取母血以及从胎盘端抽取脐血各5ml作为检测样本，从胎盘端另抽取脐血5ml做收集血清用，脐带保存液的成分为含青霉素100U/ml、链霉素100U/ml的PBS磷酸缓冲盐溶液。
3.根据权利要求1或2所述的保留脐带血管获得间充质干细胞的制备方法，其特征是:步骤(2 )对采集后的脐带进行脐带的运输方法是，将脐血、母血检测样本和置于脐带保存液中保存的脐带送至交接实验室；交接实验室登记后将脐血、母血检测样本交给质控实验室做微生物学和免疫学检测，将脐带转交给分离实验室分离。
4.根据权利要求1或2或3所述的保留脐带血管获得间充质干细胞的制备方法，其特征是:步骤(3)对脐带华通氏胶及血管进行分离的方法是，所有操作都在生物安全柜中进行，用PBS洗脐带3次，目的是洗去血液，转入装有培养液的器皿中，剪下6cm脐带放入解剖板上，其余脐带30-45cm放入装有培养液的容器中，37°C孵育；拉直脐带，两端固定，沿纵向剪l_2mm深并露出华通氏胶，分离上皮与华通氏胶，37°C PBS冲洗，从一端开始分离血管，分离后将血管两端扎紧形成环状,并将血管放入50ml管中，其中含PBS为溶剂的0.5mg/ml胶原酶，37°C孵育，其它两条血管同样处理方法；对于血管周围组织，剪开剥去上皮细胞，剪碎，放入含胶原酶的50ml管中，上皮膜放入废弃桶；剩余30-45cm脐带同样方法处理。
5.根据权利要求1或2或3或4所述的保留脐带血管获得间充质干细胞的制备方法，其特征是:步骤(4)进行原代培养和传代培养方法是，在分离18-24小时后，血管瓶中上清用PBS稀释2-5倍，1150r离心5分钟，将离心后底部细胞部分用8倍体积的4%NH4C1室温下重悬5分钟，1150r离心5分钟，细胞计数后，转入培养瓶中培养，37°C孵育24-72小时，每2天换液一次；贴壁细胞每7天用0.1%胰酶传代一次，当达到80%-90%时，依此扩增可得到P5代的间充质干细胞。
6.根据权利要求1或2或3或4或5所述的保留脐带血管获得间充质干细胞的制备方法，其特征是:步骤(5)结缔组织诱导培养方法是，对于骨组织:接种于35mm培养皿或6孔板，细胞密度为4X103 /cm2，添加培养基及地塞米松、β _Gp、抗坏血酸，诱导三周后，用茜素红染色，检测细胞成骨能力；对于脂肪:培养于6孔板添加培养基中，每2天换液一次，达到60%细胞时，换为脂肪诱导培养基，每2天换液一次，培养10天后，10%福尔马林固定，油红O将脂肪细胞脂质空泡染成红色。
7.根据权利要求1或2或3或4或5或6所述的保留脐带血管获得间充质干细胞的制备方法，其特征是:步骤(5)最后对保留脐带血管获得间充质干细胞冻存方法是，将P5代细胞加入2-8°C的冻存保护液中，分装到2ml的冻存管中，将冻存管置于程控降温仪中至-80°C，然后转移至液氮罐内保存，所述冻存保护液为含甘油1M、二甲基亚砜0.5M、甘露醇0.1M、自体脐血血清为10%的培养液DMEM/F12。
【专利摘要】保留脐带血管获得间充质干细胞的制备方法。现有脐带间充质干细胞提取方法主要从脐带中分离并废弃血管，未对脐带血管附着的间充质干细胞进行分离培养，而是直接获得华通氏胶以及脐带羊膜，然后进行培养，损失了高活性间充质干细胞。 本发明方法包括：一种保留脐带血管获得间充质干细胞的制备方法， 该方法包括如下步骤： （ 1 ）首先脐带的采集；（ 2 ）对采集后的脐带进行脐带的运输和脐带的交接；（ 3 ）对脐带华通氏胶及血管进行分离；（ 4 ）进行原代培养和传代培养；（ 5 ）结缔组织诱导培养；（ 6 ）最后对保留脐带血管获得间充质干细胞冻存。 本发明用于保留脐带血管获得间充质干细胞的制备方法。
【IPC分类】C12N5-0775
【公开号】CN104531614
【申请号】CN201410826278
【发明人】徐霜, 宋云庆, 栾志伟, 张阳
【申请人】哈尔滨壹加壹再生医学科技有限公司
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2014年12月26日