制备单酰基化多元醇的酶促催化方法

专利名称：制备单酰基化多元醇的酶促催化方法
制备单酰基化多元醇的酶促催化方法本发明涉及用于制备例如来自南极假丝酵母(Candida antarctica)脂肪酶 B(CALB)的三酰基甘油脂肪酶突变体催化的单酰基化多元醇的生物催化方法；对映选择性制备由同一酶突变体催化的不对称单酰基化多元醇的生物催化方法；以及突变的三酰基甘油脂肪酶在制备单酰基化多元醇的方法中的用途。本发明还提供新的突变体、其编码序列， 和携带所述编码序列的重组微生物。
背景技术：
三酰基甘油脂肪酶(EC 3. I. I. 3)是例如在去污剂工业、油脂化学、食品工业和精细化学品生产中具有多种工业用途的有价值的有效催化剂(Schmid R. D. , Verger, R. , Angew. Chem. Int. Au Sg. 37:1608 - 33 (1998))。脂肪酶是羧基酯水解酶，其催化甘油三酯以及其他一般疏水酯的水解作用和合成。三维晶体结构已经被阐明的所有三酰基甘油脂肪酶属于α/β-水解酶折叠蛋白质家族，其具有相似的整体结构(Ollis D. L，Cheahj Ε.，Cyglerj Μ.，Dijkstraj B.，Frolowj F.，Frankenj S. Μ.，Harelj Μ.，Remingonj S. Μ.，Silmanj L，Schragj J. D.，Protein Eng. 5:197-211 (1992))。南极假丝酵母脂肪酶B (此处也命名为CALB)是许多反应的有效催化剂，并用于例如立体选择性转化和聚酯合成(Anderson Ε. Μ.，Larssonj K. Μ.，Kirk, 0.，Biocat. Biotransform. 16:181 - 204(1998))。CALB 具有溶剂易进入的活性中心(Uppenberg J.，Hansen，Μ. Τ·，Patkar，S.，Jones, A.，Structure 2:293 - 308 (1994))并且不展不相间激活(Martinelle M. , Holmquist Μ. , Hult K. , Biochim. Biophys. Acta 1258 (3) : 272 -6(1995))。活性中心是窄的漏斗，并且CALB为此对羧酸酯，例如辛酸乙酯比对甘油三酯具有更高的活性(Martinelle 1995，上文)。有机介质中CALB的活性与在水中的活性相当，特别是CALB对仲醇的高对映选择性这样的事实使得该酶成为目前用于生物技术中最重要的脂肪酶之一。近期描述了通过随机诱变对CALB的修饰(Chodrorge M.，Fourage L.，Ullmann
C.,Duvivier V. , Masson J. M. , Lefevre F.，Adv. Synth. Catal. 347:1022-1026 (2005)。也已经在文献中报道了通过合理的酶设计改进CALB用于特定应用的若干尝试。尽管这些中的一些尝试取得了好的结果(Patkar S.，Vind J.，Kelstrup E.，Christensen M. W.，Svendsen A.，Borch Κ. ,KirkO. ,Chem.Phys.Lipids 93 (1-2) :95 - 101 (1988) ;Rotticci
D."Understandingand Engineering the Enantioselectivity of Candida antarctica Lipase B towards sec_Alcohols〃· Stockholm:Royal institute of Technology
I-61 (2000))，但因为对酶催化性质的了解不充分，合理的酶设计的可能性仍然是有限的。Zhang 等在 Protein Engineering, 16 卷，8 号(2003) 599 中报道了目的在于提高 CALB对不可逆热失活的耐性实验。通过应用定向进化技术，制备了含有突变V210I、V221D 或A281E的单突变体。双突变体(V210I、A281E)和三突变体(V210I、A281E、V221D)以及单突变体A281E显示，它们的熔点(Tm)相对于野生型酶的Tm具有显著提高。Suen 等在 Protein Engineering, Design & Selection，17 卷，2 号(2004),133 中描述了用于提高CALB活性和热稳定性的另一方法。DNA家族改组技术用于产生来自南极假丝酵母和Crytococcus tzukbaensis以及Hyphozyma sp.的嵌合脂肪酶B蛋白质。通过高通量筛选，可鉴定嵌合体，其对底物3-(3’，4’ - 二氯苯基)戊二酸盐显示更高的活性， 45° C下提高的半衰期和提高的熔点(Tm)。Magnusson 等在 J. Am. Chem. Soc. 123 (2001)，4354 中描述了 CALB 的单突变体，它们在对两种乙酯3_羟基丁酸乙酯和2-羟基丙酸乙酯的水解方面的对映选择性不同。具体而言，其中描述了单突变体T40A和T40V。未教导或提示单酰基化多元醇的制备。Rotticci等在ChemBiochem. 2 (2001), 766中公开了用于提高CALB对不同旋光仲一元醇的对映选择性的实验。具体而言，已经通过合理设计制备了单一突变体S47A、S47N、 S47H、T42N、T42D、T42H、T42V、W104H 以及双突变体(T42V, S47A)，并进行了进一步的研究。Branneby 等在 J. Am. Chem. Soc. 125 (2003)，874 中公开了 CALB 的单突变体 S105A 和S105G，以及它们在醛醇缩合反应过程中的行为。Magnussen 等在 ChemBiochem. (2005) 1051 中公开了具有增大的底物口袋的 CALB 的突变体，所述突变体具有利用更大的仲一元醇的能力。具体而言，研究了单突变体T42V、 S47A、W104A、W104H、W104Q 和双突变体(T42V, S47A)。结果，上述文件中没有一个文件教导或提示在单酰基化多元醇，特别是非环状多元醇的方法中利用CALB酶。因为预期单酰基化的中间物会被同一酶快速地进一步酯化，从而预期多元醇的单酯仅是反应过程中形成的中间物并且随着酯化反应的进行，单酯化产物的比例越来越少这样的事实，认为单酰基化的多元醇的选择性制备是难以实现的。因此，持续需要提供用于选择性单酰基化多元醇，如二元醇，特别是非环状二元醇的酶促催化方法。具体而言，需要方法，允许单酰基化多元醇的改善的优先制备。这方面的改善特征在于单酯的增加的最大产量、单酯产物与更高或完全酯化产物例如二酯的摩尔比例提高、单酯产物与总酯化产物的摩尔比例提高，和/或更高程度转化下的更高的单酯产量。还需要用于在具有不对称碳原子的酶底物情况下对映选择性制备这种单酰基化多元醇的方法。发明简述令人惊奇的是，上述问题可以通过提供制备单酰基化多元醇的酶促催化方法来解决，所述方法利用突变的三酰基甘油脂肪酶，例如CALB的突变体，所述突变体经改造以显示提高的选择性，i. P.区域选择性，允许单酰基化多元醇的优先形成。本发明允许在单酯产物产生的过程中进行多元醇酯化反应，不仅在低的多元醇转化程度，令人惊奇的是还在高的多元醇转化程度下，所述单酯产物以相对于完全酯化产物显著摩尔过量产生。例如，在高达约50到90%的转化程度上观察到至少90%的产物分布(定义为单酯与所有酯化产物总和的比例)，因此允许进行反应至几乎完成，并从反应混合物中分离高产量的期望的单酯产物。参考附图进一步解释本发明。附图描述图I代表了机理图，其阐明了在转酯反应过程中CALB反应中心的氨基酸残基 Asp 187、Ser 105和His 224的相互作用，所述转酯反应将第一个酯ROC(O) R1的酰基残基C(O)R1转移到醇HOR2上，形成新的第二个酯化合物R2OC(O)R115在反应中心的氧阴离子洞 (oxianion hole)中稳定四面体中间物，因此利于转酯反应。图2示意性地阐明了 CALB氧阴离子洞的位置106和40中的氨基酸残基参与稳定化转酯反应过程中形成的氧阴离子中间物中。图2A阐明了通过在氧阴离子和氨基酸残基 Gln 106和Thr 40之间形成3个氢键稳定氧阴离子。所阐明的酯具有通式R1OC(O)R。图 2B显示了与图2A中相同底物的稳定化，但现在位于CALB的单突变体T40A中，其中由于Thr 40被Ala替换，一个稳定化氢键丢失，因此去稳定化所述过渡态。图2C阐明了如在丁二醇单酯HOButOC(O)R的转酯反应过程中观察到的在同一突变体T40A中出现的过渡态的稳定过程中的底物协助。二醇的游离羟基基团与氧阴离子通过氢键相互作用，以便重新获得过渡态的稳定性。所述二醇分子的所述底物协助解释了 T40A突变体催化的转酯反应过程中二醇优先性。图3阐明了在利用在乙酸乙酯中溶解的1，4- 丁二醇作为底物的转酯反应中CALB 野生型和CALB T40A突变体催化的转酯反应中观察到的实验结果。单乙酸酯和二乙酸酯的产量显示为％转化的函数。(A)阐明了 CALB野生型的结果。(B)阐明了 CALB突变体T40A 获得的结果。如所见，在宽％转化范围内优选获得单乙酸酯。图4阐明了在利用在乙酸乙酯中溶解的1，2-乙二醇作为底物的转酯反应中CALB 野生型和CALB T40A突变体催化的转酯反应中观察到的实验结果。单乙酸酯和二乙酸酯的产量显示为％转化的函数。(A)阐明了 CALB野生型获得的结果。(B)阐明了 CALB突变体 T40A获得的结果。如所见，利用T40A，在宽％转化范围内优先获得单乙酸酯。野生型酶的最大单酯产量是43% ;突变体的最大单酯产量显著提高到77%，表明突变体对单酯的提高的选择性。图5显示了在利用在乙酸乙酯中溶解的1，2-乙二醇的转酯反应中野生型和T40A CALB在产物分布上的差异。(A)和(B)中阐明的是来自同一实验的两种给定产物分布的二醇转化。对于75%的产物分布，利用野生型转化了 17%的二醇，利用T40A CALB转化了 99% (见(A))。90%的产物分布的相应图是利用野生型转化9%和利用T40A CALB转化78% (见 (B))。图6阐明了基于等式1-3拟合到模型的数据。显示二醇(菱形)、单酯(正方形)和二酯(三角形)的点是测量值。误差线显示了使用在等式1-3中获得的krat/KM-值计算的值。 (A)和(B)分别对应于野生型和T40ACALB。图7阐明了在利用2-甲基-1，3-丙二醇作为底物和在MTBE中溶解的丁酸乙烯酯作为酰基供体的转酰基反应中单酯和二酯的产量。野生型(A)和T40A(B)CALB用作催化剂。 如所见，在宽％转化范围优先获得单丁酸酯。图8显示了在利用MTBE中溶解的丁酸乙烯酯作为酰基供体的反应中表示为 1，4-丁二醇转化的函数的单酯和二酯的产量。野生型(A)和T40A (B) CALB用作催化剂。如所见，在宽％转化范围优先获得单丁酸酯。图9显示了竞争底物的转化。二醇的转化表示为I-丁醇转化的函数。展示了两种不同的二醇1，2-乙二醇(A)和1，4-丁二醇(B)。使用乙酸乙酯作为酰基供体和溶剂进行反应。比较了野生型(菱形)和T40A(正方形)CALB催化的反应。在A和B中，T40A催化的反应比野生型CALB催化的反应，对二醇相对于I- 丁醇的选择性更高。


图10显示了竞争底物的转化。二醇的转化表示为I- 丁醇转化的函数。展示了两种不同的二醇1，2-乙二醇(A)和1，4-丁二醇(B)。使用丁酸乙烯酯作为酰基供体和MTBE 作为溶剂进行反应。比较野生型(菱形)、T40A(正方形)和T40V (三角形)CALB催化的反应。在A和B中，T40A和T40V催化的反应比野生型CALB催化的反应对二醇相对于1_ 丁醇的选择性更高。图11显示了随时间流逝每克酶转化的1，2-乙二醇。在A中乙酸乙酯用作酰基供体和溶剂。在B中，丁酸乙烯酯用作酰基供体，MTBE用作溶剂。反应速率在野生型和T40A CALB之间不同，说明野生型(菱形)相比于T40A (正方形)变体是更有效的催化剂。当使用乙酸乙酯而非丁酸乙烯酯作为酰基供体时，反应速率的差异更大。图12显示了在市售酶(Novo 435)(填充的圆点代表)、A282L突变体(空白正方形)或L278S突变体(空白三角形)酶促催化后，多种转化率下4-羟基丁二醇相对于丁二醇二丙烯酸酯的过量。在各自检测范围内，两种CALB突变体在宽范围的所实现转化上显示了 4-羟基丁二醇的可测量的过量。图13显示了产物过量或转化率依赖于CALB Novo 435和CALBA282L的流速。填充的或空白的点分别代表Novo 435或A282L的转化，而填充的或空白的正方形分别代表Novo 435或A282L在给定转化下完成的4-HBA过量。图14显示了与CALB Novo 435和本发明所选CALB突变体比较，所产生的单丙烯酸酯相对于转化程度的过量。结果基于直接从培养基中获取的样品。图14A:包含来自A282C(十字形标记)；A282P(空白三角形)；A282I (空白正方形)；A282D(空白菱形，阴影线)的结果；图14B包含来自A282L(空白正方形)；A282V(空白三角形，阴影线)；A282R(空白菱形)和L278S/A282L(十字形)的结果，而在图14A和图14B中填充的点代表Novo435。图15显示了与CALB Novo 435和本发明所选CALB突变体比较，所产生的单丙烯酸酯相对于转化程度的过量。结果基于Resindinon Diaion HP20L珠子(Resindion SRL, Mitsubishi Chemical的子公司)上固定的酶。图15A包含来自A282I(空白三角形代表)；A282R(空白菱形)，和L278S/A282L(空白正方形，阴影线)的结果；图15B包含来自A282C(空白菱形)，I285F(空白正方形)和A282L/I285F(空白三角形)的结果，而在图 15A和图15B中填充的点代表Novo 435。发明详述I. 一般定义在缺少相反信息的情况下，应该应用以下一般定义根据本发明，“三酰基甘油脂肪酶”根据IUBMB酶命名法表示类型E. C. 3. I. I. 3的酶(http://www. iubmb. unibe. ch;http://www. chem. qmul. ac. uk/iubmb/enzyme/)。根据本发明方法的特定实施方案，功能表达的三酰基甘油脂肪酶是脂肪酶B，其为来自南极假丝酵母的CALB的基因产物。描述了 CALB基因(Uppenberg等，1994)，并且其核苷酸或蛋白质序列以登录号Z30645和CAA83122. I保存在GenBank。除非更精确地命名，此处CALB表示具有该登录号的核苷酸序列。三酰基甘油脂肪酶的另一实例是来自 Pseudozyma tsukubaensis 的月旨肪酶B (Suen, ff. C. , Zhang, N. , Xiao, L, Madison, V. , Zaks, A. Protein Eng. Des. Sel. 17 (2) : 133—40 (2004))。
“酶促催化的”或“生物催化的”方法表示所述方法在酶(包括如此处定义的酶突变体)的催化作用下进行。因此，可在存在分离(纯化、富集)或天然形式的所述酶的情况下或在存在细胞系统，具体而言天然或重组微生物细胞的情况下进行所述方法，所述微生物细胞含有活性形式的所述酶，并具有催化此处公开的转化反应的能力。术语“选择性单酰基化多元醇”或“增加对单酰基化多元醇的选择性” 一般表示在此处公开的酯化反应过程中，即在所述反应的整个过程中(即在反应开始和终止之间)、在所述反应的某个时间点上、或在所述反应的“间隔”中，以比至少一种，优选所有高级酯化多元醇组分更高的比例或量(在摩尔基础上比较)产生所述多元醇的单酯。具体而言，可在对应于多元醇底物初始量I到99%、2到95%、3到90%、5到85%、10到80%、15到75%、20到70%、 25到65%、30到60%或40到50%转化的“间隔”中观察所述选择性。例如可在以下方面表述所述更高的比例或量-在整个反应过程中或其所述间隔中观察的单酰基化多元醇的更高最大产量；-在多元醇的确定％转化值下更高的相对量的单酰基化产物；和/或-更高％程度的转化值下相同的相对量的单酰基化产物；其各自在相对于参考方法下观察，所述参考方法在利用相应的非突变脂肪酶在其他方面相同条件下进行。术语“产物分布”描述了在此处描述的酶催化方法的过程的某一时间点上或“间隔”中形成的某一反应产物的部分量相对于所述方法形成的所有产物的总量的比例，以百分比表示。因此，某一多元醇的单酯的“产物分布”定义了所述单酯相对于酯(单酯和聚酯) 的总量的比例(百分比)，其在某一时间点上或在所述酶促酯化反应开始后的确定间隔中在此处定义的酶影响下产生。“旋光”化合物是具有至少一个不对称中心，S卩，至少一个不对称碳原子的那些化合物。术语“约”表明所述值土25%的可能变化，特别是土 15%、土 10%、土5%、土2%或土 1%
的可能变化。术语“基本上”表明所述值±10%的可能变化，特别是±5%、±1%、±0，5%、±0. 2% 或±0. 1%或更少的可能变化。“立体选择性”或“对映选择性”描述了产生立体异构或对映异构纯形式的旋光化合物或特异地转化特定立体异构体的能力或从大量立体异构体或对映体中制备单酰基化多元醇对映体的酶促催化方法。更特别地，这表示本发明的产物针对特定立体异构体或对映体进行了富集。这可通过以下公式计算的对映体纯度％ee参数来定量%ee= [XA_XB] / [XA+XB] *100，其中Xa和Xb代表对映体A和B的摩尔比例(Molenbruch)。可获得至少90%ee,像至少95%ee,或至少98%ee或至少99%ee或更高的对映体纯度。术语“能够形成氢键”指本发明酶分子的氨基酸残基与另一分子，例如所述酶的另一氨基酸残基或与定位在所述酶分子上或分子内的底物分子或其中间状态形成氢键的能力。“稳定”氧阴离子过渡态的条件表示这样的条件，其使得所述氧阴离子状态如果与非稳定状态相比在能量上更有利。例如通过阴离子的负电荷的离域作用实现稳定化。如此处定义的酶的“底物口袋”或其“反应中心”在待催化的反应过程中携带了底 物分子并将其转化成通式I的产物。所述底物口袋由某些“结构元件”，即具有不同功能的 所述底物口袋的部分组成。所述结构元件彼此“功能排列”，即它们在待催化的反应过程中 协同作用。“序列基序”或“模式”代表了大量氨基酸残基的特征性排列或“指纹图谱”，所述氨 基酸残基在特定氨基酸序列内彼此邻接，或彼此以特定方式分隔，即由特征性长度的中间 间隔序列分隔。“扩展的底物特异性”指如果与参考酶相比，转化额外结构上不同的底物的酶。“改变的/修饰的底物特异性”指如果与参考酶相比转化部分或完全不同组底物分 子的酶。因此，术语“改变的底物特异性”可描述这样的情形，其中例如通过突变产生的脂 肪酶比参考酶(例如非突变的酶)更好地适合于特定底物分子的酰基化。例如，酶变体形成 的结合口袋更高的底物亲和力可引起更高的优先性或特异性。“改变的/修饰的区域选择性”指如果与参考酶相比，以改变优先性转化底物分子 的一个或多个潜在反应位点的酶。因此，术语“改变的区域选择性”可描述这样的情形，其 中例如通过突变产生的脂肪酶比参考酶(例如非突变的酶)更好地适应于具有多于一个可 酰基化官能团的特定底物分子的单酰基化。由于酶促反应的可逆性，本发明也涉及此处所述生物催化酰基化反应的相应可逆 (即脱酰基)反应。2.本发明的特定实施方案本发明提供以下特定实施方案1.制备单酰基化多元醇，特别是通式(I)的单酰基化二醇的生物催化酶促催化方 法
权利要求
1.制备通式(I)的单酰基化多元醇的生物催化方法
2.权利要求I的方法，其中所述突变的脂肪酶含有至少一个氨基酸突变，如果与相应的非突变脂肪酶相比，所述突变增加了脂肪酶对所述多元醇的单酰基化的选择性。
3.前述权利要求之一的方法，其中所述突变体包含至少一个突变，其从酶反应中心部分去除了稳定性功能氨基酸，所述稳定性功能氨基酸稳定待形成的通式(I)的单酰基化多元醇的羰基的氧阴离子过渡态。
4.前述权利要求之一的方法，其中a)获得了最大单酯产量，其比通过相应野生型酶获得的最大产量高至少1%；b)在这样的多元醇转化率下达到了单酯与聚酯3:1的摩尔比例，所述多元醇的转化率比相应野生型酶获得的相应转化率高至少1% ;和/或c)在多元醇总量的基础上产生90%单酰基化多元醇的反应时间的比例(T9CI(突变体)/ T9Q(野生型))高于I。
5.前述权利要求之一的方法，其中所述酶是南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)的突变体， 其包含SEQ ID NO: 2的在至少一个位置上发生了突变的氨基酸序列。
6.权利要求5的方法，其中所述突变体包含SEQID N0:2的氨基酸序列，其中氨基酸 Thr40发生了突变。
7.权利要求6的方法，其中所述突变使得在氧阴离子中间体与位置40的氨基酸残基之间基本上不会发生稳定化相互作用。
8.权利要求7的方法，其中所述突变包含单突变Thr40Ala、Thr40Val或Thr40Ser。
9.权利要求8的方法，其中所述突变体选自具有SEQID NO: 4的氨基酸序列的突变体或所述突变体的具有至少60%的序列同一性的变体，所述变体在对应于SEQ ID NO:4的位置Thr40的氨基酸位置上仍然含有突变。
10.权利要求7至9中一项的方法，其中所述突变体额外地在SEQID N0:2或4的氨基酸位置Leu 278、Ile 285和Pro 280之一上包含至少一个突变。
11.权利要求10的方法，其中所述突变体和其变体在促成酶的催化位点的其他氨基酸位置中没有发生突变。
12.权利要求11的方法，其中所述突变体在氨基酸位置Serl05、ASpl87、His224(催化性三联体)和Glnl06上没有发生突变，并且其中所述变体在对应于那些位置的氨基酸位置上没有发生突变。
13.权利要求5至12任何一项的方法，其中在SEQID NO: 2中或在包含根据SEQ ID N0:4 在氨基酸 Thr40 上突变的 SEQ ID N0:2 中，Leu278、Ala281、Ala282 或 Ile285 中的一个或多个发生了突变。
14.权利要求13的方法，其中一个或多个突变独立地选自Leu278Ser、Ala281Val 或Ala281Glu，和Ala282Leu、Ala282Thr、Ala282Cys、Ala282Pro、Ala282Ile、Ala282Asp、Ala282Val、 Ala282Met 或 Ala282Arg。
15.权利要求14的方法，其中SEQID NO:2包含选自Ala281Val、Ala281Glu、 Ala282Leu、Ala282Thr、Ala282Cys、Ala282Pro、Ala282Ile、Ala282Asp、Ala282Val、 Ala282Met、Ala282Arg和Ile285Phe的一个突变，或其中SEQ ID N0:2包含双突变 Leu278Ser 和 Ala282Leu。
16.前述权利要求之一的方法，其中在分离的酶突变体或功能性表达所述突变体的重组微生物的存在下进行所述反应。
17.前述权利要求之一的方法，其中所述多元醇是通式(II)的化合物，其中A选自-(CH2) n-和-(CH2) m-CR2R3- (CH2) m’ -其中η是2-6的整数，m和m’各自独立地是1-3的整数，R2和R3各自独立地选自H、OH、SH、NH2、任选取代的碳环或杂环和烃基残基，条件是R2 和R3不同时是H。
18.前述权利要求之一的方法，其中通式(III)的所述供体选自化合物，其中R1是 C1-C6-烷基，并且Don是-OR残基，其中R选自C1-C6-烷基和C2-C4-烯基。
19.对映选择性制备通式(I)的不对称单酰基化多元醇的酶促催化方法
20.权利要求19的方法，其中应用权利要求2至15任何一项中定义的酶突变体，所述突变体是分离的酶突变体形式或功能性表达所述突变体的重组微生物的形式。
21.权利要求19或20的方法，其中所述多元醇是通式(II’)的化合物，其中A*选自-(CH2)m-CHR2-(CH2) m，_其中m、m’和R2如上定义。
22.突变的三酰基甘油脂肪酶(EC3. I. I. 3)在制备如上定义的通式(I)或(I’)的单酰基化多元醇的方法中的用途。
23.南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)突变体，其显示了SEQ ID NO:2的氨基酸序列的至少两个突变的模式，所述模式选自表A中显示的模式。
24.权利要求23的突变体，其额外地显示选自Val210Ile、Ala281Glu、Val221Asp的一个突变。
25.南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)突变体，其在SEQID NO:2的氨基酸序列中具有一个或多个突变，所述突变独立地选自Leu278Ser,Ala281Val 或Ala281Glu，和Ala282Leu、Ala282Thr> Ala282Cys> Ala282Pro> Ala282Ile、Ala282Asp、Ala282Val、 Ala282Met 或Ala282Arg。
26.权利要求25的突变体，其在SEQID NO:2中具有选自Ala281Val、Ala281Glu、 Ala282Leu、 Ala282Thr> Ala282Cys> Ala282Pro> Ala282Ile、 Ala282Asp、 Ala282Val、 Ala282Met、Ala282Arg和Ile285Phe的一个突变，或在SEQ ID N0:2中具有双突变 Leu278Ser 和 Ala282Leu。
27.权利要求23或24的突变体，其额外地具有在权利要求25或26任何一项中定义的至少一个突变。
28.核酸分子，其编码权利要求20至27之一的突变体。
29.表达载体，其包含任选地在调节性核酸序列控制下的权利要求28的至少一个编码序列。
30.微生物宿主，其携带权利要求29的至少一个表达载体或权利要求28的编码序列。
全文摘要
本发明涉及制备例如来自南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)的三酰基甘油脂肪酶突变体催化的单酰基化多元醇的生物催化方法；对映选择性制备不对称单酰基化的多元醇的生物催化方法，其由相同的酶突变体催化；以及突变的三酰基甘油脂肪酶在制备单酰基化多元醇的方法中的用途。本发明还提供了新的突变体、其编码序列，和携带所述编码序列的重组微生物。
文档编号C12N9/18GK102612557SQ201080051575
公开日2012年7月25日 申请日期2010年9月16日 优先权日2009年9月16日
发明者A·汉伯格, A·麦格努松, B·豪尔, C·克瓦尔斯特罗姆布兰尼比, K·胡尔特 申请人:巴斯夫欧洲公司