专利名称：：方法方法本发明涉及用于在培养物中制备叶生物质的方法。在本说明书中明显地先前公开的文件的列出和讨论不应必然地被认为是承认该文件是现有技术的一部分或者是公共知识。培养物中制备生物质可用于制备基因工程多肽；制备包括药用物质、多糖、木质素和脂质的内源性植物产品；通过代谢工程制备自然条件下在植物中未发现的新的简单和复杂化学品，所述化学品包括新形式的多糖、木质素、糖、芳香族和脂肪族化合物；以及捕获ニ氧化碳。所述生物质也可以用来做某些环境下的燃料。WO00/57690涉及从分化植物碎片微繁殖(micropropagation)和生成植物药物(phytopharmaceutical)植物。尤其是WO00/57690涉及刺激提取自成株的分化細胞的小碎片生成新的小植株，所述新的小植株可以生长为完整的生成植物药用的植物，该植物能够在典型植物培养基(例如，土壌、堆肥)中进行正常植物生长。WO01/94602涉及用于再生植物的方法和其应用固体生长培养基繁殖和/或转化植物的用途。由WO01/94602中描述的方法生成的植物为可存活植物，该可存活植物可以在典型植物生长培养基(例如，土壌、堆肥)中在正常生长下生长。WO2008/028115涉及通过使用转基因的単一容器体系在短时间内生成大量转基因玉米植株，井生长成为可存活植物的高通量方法。所生成的玉米植株是具有根、茎和叶结构的可存活植株，并且该玉米植株在典型植物生长培养基(例如，土壌、堆肥)中能够进行正常植物生长。例如在Etienne&Berthoulバ2002)PlantCell,TissueandOrganCulture69,215-231,Hanhineva&Karenlampi(2007)BMCBiotechnology7，11-23，以及在Ducos^A(2007)InVitroCellular&DevelopmentalBiology_Plant43:652-659中已知临时液体浸渍培养体系(例如临时浸渍生物反应器或TIB)的使用。例如，Hanhineva&Karenlampi(2007)描述了TIB在生成转基因草莓植株中的用途，其中产生的植株包含外源基因和包含根和苗两者的形成，使得它们能够在例如土壌或堆肥中进行正常植物生长。为什么研究者们选择了植物来表达生物药物和其他高值蛋白，主要的原因之ー是与植物生长关联的尺度放大的強大可能性和非常低的維持成本。然而，使用转基因植物具有其缺点，即公众关心的转基因向周围的非转基因作物的转移和食物链污染的可能性(Fox,2003)。很长一段时间以来，人们假定大多数物种中的质体基因组在花粉中不存在并且由母体遗传(Hagemann,2004；Zhang等人，2003；kottandffilkinson,1999)。因此，认为将基因插入到叶绿体基因组或原质体系中从而产生转质体植物(transplastomicplant)对花粉介导的转基因流提供固有天然屏障。然而，ー些最近的出版物表明，叶绿体DNA包含物的渗漏比最初认为的更加频繁和广泛。例如，估计叶绿体DNA到花粉的转移，在粟(Setariaitalica)(foxtail)中达到0.03%(Wang等人，2004)、在烟草中达到0.01-0.00029%(Ruf等人，2007;Svab和MaligEi,2007)以及在拟南芥(Arabidopsisthaliana)中达到0.0039%(Azhagiri和MaligEi,2007)。5关注的另一点在于随着时间推移叶绿体DNA转移到核基因组的可能性(Skppard等人，2008)，所述转移从其可以传递的地方到附近的非转基因物种，并采用与传统核转化体相同的方式。畑草中检测到的频率为每16000个花粉粒中一个叶绿体DNA转移到核DNA(Huang等人，2003)。考虑到，根据烟草物种，每英亩地可以生长5000-16000株烟草植物的事实，叶绿体DNA转移到核的风险不容忽视。还引起关注的是，抗生素抗性盒例如用于选择叶绿体转化体的aadA基因可以被转移到土壤细菌(Monier等人，2007)和在植食性昆虫的肠道内发现的細菌中(BrinkmarmandTebbe,2007)。为了避免在田地中种植转质体种子可以产生的任何环境问题，ー种方案是植物细胞悬浮培养物中制备重组蛋白，所述培养物是在限制性条件下生长的。实际上，已经将植物细胞悬浮液改性为表达多种异源蛋白(Hellwig等人综述，2004)。对于制备重组蛋白植物细胞悬浮液相对于完整的植物显示出ー些优点，例如收获前的时间段较短、生长完全受控制和不受天气状况或疾病限制。也可以容易地应用基于细菌生产系统的现行药品生产质量管理规范，cGMP，导致联邦药品管理局(FDA)或欧洲药品评价局(EMEA)的更快监管批准(Ma等人综述，2003；Fischer等人，2004；Twyman等人，2003)。与細菌一祥，植物细胞悬浮培养物的生长和维持成本低廉。由于植物细胞悬浮培养物既不隐藏人病原体，也不产生内毒素，因而它们在本质上也是安全的。植物细胞悬浮液可以在简单的合成培养基中維持，但是也可以如动物細胞一祥合成复杂的多聚蛋白质。与田地生长的植物相反，培养的植物細胞的特性与气候、土壤质量、季节和日长无关。没有霉菌毒素、除草剂或杀虫剂(Doran，2000)污染的风险，并且副产品(例如，纤维、油、蜡、酚类化合物)较少。相对于完整植株，植物细胞悬浮培养物最重要的优点也许是产品的分离和纯化过程简单很多(Fischer等人，1999)。然而，植物细胞悬浮培养物的主要缺点是生长缓慢和通过核转化生产重组蛋白的产量通常较低(Hellwig等人，2004)。另ー个弱点是，植物細胞培养物的产率可以变化相当大，其重组蛋白水平通常为可溶性总蛋白(TSP)的0.0064%-4%，虽然在特殊情况下可以达到TSP的20%(Huang等人，2001)。一般来说，叶绿体转化比传统的核转化的重组蛋白更好地出产重组蛋白。例如，将大肠杆菌(E.coli)不耐热肠毒素B亚单位(LTB)在烟草中通过核转化和质体转化两者表达。当将肠毒素基因插入到质体基因组时，重组蛋白收率高250倍(Kang等人，200。同样地，当由核和质体DNA表达霍乱毒素B抗原(CTB)吋，畑草叶绿体中的抗原产量比由核中高410倍(Daniell等人，2001)。即使对于ー些蛋白的过表达而言叶绿体转化看起来是更优的，但关于在转质体中重组GFP的可能产量高于植物细胞悬浮液，仅发表了一个报道(Langbecker等人，2004)。该研究描述了黑暗生长的烟草植物細胞培养物的质体转化，但是没有对表达的潜カ进行估计。在实施例描述的工作中，已经研究了质体编码的重组蛋白的表达水平，在这种情况下，叶组织、愈伤组织和细胞悬浮液中的绿色荧光蛋白GFP+的变体在不同条件下生长(Scholz等人，2000)。结果表明，在细胞悬浮培养物中的表达，对于叶绿体中外源蛋白的高水平和限制性表达是可行的途径，尽管表达水平远低于在植物叶中的表达水平。还描述了基于临时浸渍生物反应器开发的新表达体系，该表达体系能够从细胞悬浮培养物开始制备非常高水平的重组蛋白，并且能够由未分化植物細胞制备高水平的叶生物质。本发明的第一方面提供了用于从未分化的植物細胞中制备叶生物质的方法，该方法包括提供未分化的植物細胞；将其接触促进细胞分化为叶组织的试剂；和使该细胞在临时液体浸渍培养体系中生长。所谓“未分化植物細胞”我们包括以下的含义，即細胞大体上没有显示分化为任何特定植物组织如苗或叶的迹象，并且在不存在诱导未分化細胞分化的试剂的条件下，尤其是应当没有诱导未分化細胞分化为苗的试剂的条件下，它们将在这种状态下保持至少ー个月。所述未分化細胞可以是转基因細胞或非转基因細胞。通常，未分化細胞可以得自永久愈伤组织或愈伤组织材料。永久愈伤组织是未分化植物細胞的細胞培养物。这种永久愈伤组织細胞保持未分化的形式至少ー个月。未分化細胞也可以从分化的植物材料在体外得到，所述分化的植物材料例如叶、茎、花、种子或根，将所述叶、茎、花、种子或根切割并与某些植物激素，例如生长素接触放置。当该植物材料与激素接触吋，在植物材料的某些区域将会形成愈伤组织。认为通过激素对未分化植物材料诱导形成的愈伤组织不是永久愈伤组织。当植物不是转基因植物吋，提供未分化細胞的步骤包括放置植物切割碎片(植物材料)与植物激素接触，然后该植物激素在那些切割碎片的边缘生成愈伤组织；然后将所述愈伤组织作为愈伤组织继代培养，并保持没有任何选择性。所述切割植物材料可以是整个或部分的根、叶、茎、花或种子。当植物是质体转基因植物吋，提供未分化細胞的步骤包括通过靶向叶绿体DNA的同源重组方法将转基因核酸分子引入到植物細胞的叶绿体中。诱导含有转基因核酸分子的植物細胞，从而形成未分化細胞的愈伤组织；和将该愈伤组织在有效实现同型异源性的条件下繁殖。本发明工作的愈伤组织是永久性愈伤组织，所述永久性愈伤组织作为未分化細胞已经培养和维持至少ー个月。优选地，当与试剂接触时仅存在的细胞为未分化細胞。通常，当与试剂接触时，存在的细胞中至少90%、或95%、或99%、或99.9%、或99.99%为未分化細胞。优选地，基本上所有的叶和叶状生物质材料是由未分化細胞接触试剂之后分化产生。通常，由使用试剂处理未分化細胞制备的植物材料应为至少50%，优选地70%，和更优选地大于85%的叶生物质。所谓“叶”和“叶状”生物质，我们包括植物材料为叶或“叶状”组织的形式的含义。通过组织碎片的形状、叶绿体的数量和显著的光合作用活性将这些叶组织与其他植物组织区分开。例如，对于任何给定的植物，按照植物组织共聚焦显微分析计数，叶材料有更多的叶绿体和发育中的叶绿体，并且如植物组织吸收ニ氧化碳检测的，这些叶绿体比非叶材料的叶绿体具有更高的光合作用活性(使用荧光计測定Fv/Fm)和更高的叶绿素含量(通过吸收分光光度法分析提取的色素)。该确定方法对于技术人员来说是熟知的，例如在(Baker(2008)Ann.Rev.PlantBiol.59:89-113)中描述的。所述临时液体浸渍培养体系可以是如本领域已知的任何此种体系(例如参见Etienne&Berthouly(2002)PlantCell,TissueandOrganCulture69，215-231，Hanhineva&KJirenlampi(2007)BMCBiotechnology7，11-23，并且也可以来自Ducos等人(2007)InVitroCellular&DevelopmentalBiology-Plant43:652-659，将它们所有引入本文作为参考。通常，所述体系包括细胞居住在其上的多孔固体基质(例如，网或海绵或泡沫)，如以下进一步描述的该多孔固体基质浸入液体生长培养基中持续短的时间。所述植物细胞可以是来自单子叶植物或双子叶植物的细胞。适合的双子叶植物包括烟草、马铃薯、番茄、豆、大豆、胡萝卜、木薯或拟南芥(Arabidopsis)中任意的。适合的单子叶植物包括玉米(corn)、黑麦、燕麦、小米、甘蔗、高粱、玉米(maize)、小麦或水稻中任意的。在优选的实施方案中，植物细胞来自药用植物，该药用植物中主要的药用物质在叶中产生。应理解到，该方法代表通过从叶生物质提取药用物质从而获得它们的有利方法。适合的药用植物包括颠茄属(Atropasp)、莨菪属(Hyoscyamussp)、曼陀罗M(Daturasp)>S1M(Papaversp)>^ICIIfM(Scopoliasp)>^iiilItM(Digitalissp)、油麻藤属(Macunasp)、红豆杉属(iTaxussp)、喜树属(Camptothecasp)、三尖杉属(Cephalotaxussp)或者长春花属(Catharanthussp·)、蒿属(Artemisiasp)例如黄花蒿(Artemisiaannua)中任意的。可以得自这些药用植物的药品包括但不限于莨菪烷类生物碱，例如阿托品、东莨菪碱和莨菪碱以及它们的前体和衍生物；吗啡烷型生物碱，例如可待因、吗啡、蒂巴因、去甲血根碱、血根碱和隐品碱以及它们的前体和衍生物；强心苷，例如毛地黄毒苷、毛地黄毒苷配基、芰皂配基、双羟洋地黄毒甙、吉托洛苷(Gitaloxigenin)以及它们的前体和衍生物；L-DOPA(L-3,4-二羟基苯丙氨酸)及其前体和衍生物；抗肿瘤化合物，例如紫杉醇及其前体和衍生物、喜树碱及其衍生物、高三尖杉酯碱、三尖杉酯碱、异三尖杉酯碱和三尖杉碱以及它们的前体和衍生物；和长春花生物碱，例如长春花碱、长春新碱、长春花朵灵、长春碱，它们的前体和衍生物；疟疾药物，例如青蒿素，其前体和衍生物。由叶生物质制备的药用化合物可以通过与药学上可接受的赋性剂、稀释剂或载体组合加入药物组合物中。在进一步优选的实施方案中，所述植物可以是能源作物。所谓能源植物，我们指用于制备包括乙醇或生物柴油的生物燃料的植物物种。本发明使生物质能够不依赖于季节和植物物种地连续制备，所述生物质可以用于生物燃料的连续制备。所生成的生物质可以内源性含有相对升高水平的多糖，所述多糖用于基于发酵的乙醇制备过程，或相对高水平的一种或多种脂质，所述脂质可以进一步加工用于制备生物柴油。这些升高水平的有益化合物也可以通过基因工程由生物质生成。适当地，所述植物是芒属(Miscanthussp)、麻风树属(Jatrophasp)、黍属(Panicumsp)、柳树、棕榈树、玉米、木薯或杨树中任意的。通常，促进细胞分化为叶组织的试剂是植物激素(植物激素(phytohormone)或植物生长调节剂)，优选为细胞分裂素。细胞分裂素为一组主要影响细胞分裂和苗形成的化学品，但是也具有延迟细胞衰老的作用、负责介导生长素贯穿植物中的运输并且影响节间长度和叶生长。生长素是对细胞膨大、芽形成和根发生有正面影响的化合物。它们还促进其他激素的生成，并与细胞分裂素共同控制茎、根、果实的生长和将茎转变为花。所述细胞分裂素可以是任意属于腺嘌呤型或苯脲型的天然或人工细胞分裂素。优选地，所述细胞分裂素是具有细胞分裂素活性的腺嘌呤、激动素、玉米素、6-苄氨基嘌呤、二苯脲、噻苯隆(TDZ)和它们各自的衍生物中任意的。所述试剂可以促进、诱导和激发分化，使得苗从得自本发明的愈伤组织/细胞悬液的任何单个未分化植物细胞开始快速生长，优选地以指数方式快速生长。这些苗发育为叶生物质或叶状生物质。优选地，促进细胞分化为叶组织的试剂是噻苯隆(TDZ)。所述试剂可以方便地与另一种植物激素联合使用，所述另一种植物激素例如生长素，如天然存在的生长素4-氯-吲哚乙酸、苯乙酸(PAA)、吲哚-3-丁酸和吲哚-3-乙酸，或合成的生长素类似物1-萘乙酸(NAA)、2，4_二氯苯氧乙酸。通常，将所述试剂以0.01-100μΜ的浓度加入到培养基中。优选地，所述浓度为0.1-10μM0所述试剂可以在在临时液体浸渍培养步骤的开始时或过程中加入。为了优化叶生物质的制备或用于优化叶生物质中特定产物的浓度，可以选择任何合适的浸渍方案，所述产物如目的多肽或药用物质。通常，每培养2-Μ小时浸渍时间为1-30分钟。优选地，每培养2-6小时浸渍时间为1-10分钟。为了以最有效的方式，即以最合适的速度、数量和质量生成用于特定目的的特定生物质，技术人员能够根据植物物种和来源容易地选择最合适的浸渍培养参数，例如时间、温度和生长培养基。临时液体浸渍培养物中液体的体积可以是任何合适的体积，但通常为1-10000升。可供选择地，所述体积可以为1-5000升、1-1000升或1-500升。含有所述临时液体浸渍培养体系的容器可以是任意合适的大小，并且通常为1-10000升。可供选择地，所述体积可以为1-5000升、1-1000升或1-500升。在本发明的一个实施方案中，将所述植物细胞不经基因工程改造。如熟知的，植物在它们的叶子中内源地产生许多重要的产物，如上面描述的药用物质，还有油、色素、抗氧化剂、简单和复杂的生物化学品，例如糖(碳水化合物)、脂类、氨基酸、挥发性芳香族化合物和多种香料/香料前体。目的植物材料也可以能够浓缩、捕获或降解样品中，例如给水源的样品中的毒性污染物(基于植物的体外净化/纯化)。所述植物材料也可以用于将包含在临时反应溶液中的一种化合物转化为一种或多种其他化合物。在本发明的另一个实施方案中，将所述植物细胞经基因工程改造为，例如表达多肽。所述多肽可以是任意的目的多肽，但是优选是治疗多肽、酶、生长因子、免疫球蛋白、激素、结构蛋白、植物应激反应中涉及的蛋白、生物药物、肽或疫苗抗原中的任意一种。当多肽是酶时，其可以用于改变叶材料的代谢，从而使得能够产生新型聚合物和代谢物。也可以在叶材料内表达一种或多种多肽，以增强叶组织纯化或降解在样品中例如水源中发现的污染物的能力。所述经基因工程处理的植物细胞(重组的或转基因的植物细胞)可以为(i)核转化植物细胞，其中外源核酸(转基因)存在于核中；(ii)转质体植物细胞，其中外源核酸(转基因)存在于质体例如叶绿体中；或(iil)既是核转化的也是转质体的的植物细胞。制备核转化植物和转质体植物的方法是本领域熟知的。例如，可以使用粒子轰击、微注射、聚乙二醇-电穿孔、农杆菌介导的转化、植物病毒等方法将核酸分子引入植物细胞中(参见，例如Birch1997，Maliga2004，Gleba等人，2008)。如果所述植物是转质体植物，则是优选的。也可以采用多种本领域认可的方式来转化植物。本领域技术人员将理解，方法的选择可以依赖于靶向转化的植物的类型。转化植物细胞的适当方法的实例包括微注射(Crossway等人，BioiTechniques4:320-334(1986))、电穿孔(Riggs等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA835602-5606(1986)、农杆菌介导的转化(Hinchee等人，Biotechnology6915-921(1988))、直接基因转移(Paszkowski等人，EMB0J.32717-2722(1984))和使用得自Agracetus,Inc.,Madison,WisconsinandDupont,Inc.,Wilmington,Delaware的装置的冲击粒子加速(参见例如，Sanford等人第4，945，050号美国专利)。通常，农杆菌介导的转化对于单子叶植物是无效的，而对于单子叶植物，上面提到的其他方法是优选的。可以通过熟知的技术鉴定成功转化的细胞，即含有本发明的DNA构建体的细胞。例如，一个选择技术涉及将编码转化细胞中可选性状的DNA序列(标记物)合并到表达载体中。这些标记物包括二氢叶酸还原酶、针对真核细胞培养物的G418或新霉素抗性基因，和用于在大肠杆菌和其他细菌中培养的四环素、卡那霉素或氨苄青霉素抗性基因。可供选择地，该种可选性状的基因可以位于用于共转化需要的宿主细胞的另一个载体上。所述标记基因可以用于鉴定转化体，但是希望确定哪一个细胞含有重组DNA分子和哪一个细胞含有自身连接载体分子。这可以通过使用克隆载体来实现，所述克隆载体中DNA片段的插入破坏了存在于分子上的基因中的一个的完整性。因而，由于该基因功能的丢失，可以鉴定重组体。另一种鉴定成功转化细胞的方法涉及使由本发明的表达构建体的引入所产生的细胞生长，从而制备本发明的多肽。可以使用例如由Southern(1975)J.Mol.Biol.98，503或Berent等人(198Biotech.3，208描述的方法来收获和裂解细胞，并且检查其DNA含量来检查DNA的存在。可供选择地，上清中蛋白质的存在，可以使用如下描述的抗体来检测。当重组DNA能够直接表达蛋白质时，除了直接检测重组DNA的存在以外，可以通过熟知的免疫学方法验证成功的转化。例如，用表达载体成功转化的细胞产生显示适当抗原性的蛋白质。收获怀疑被转化的细胞样品并使用适当的抗体检测蛋白质。本领域的技术人员将会理解，可以通过植物转化技术来制备稳定或不稳定(临时)的转化体。所述临时的转化体仅临时表达含有由DNA构建体编码的本发明化合物的产品。该临时表达系统可以用于分子遗传研究也用于某些特定商业应用，其中在转化后不久，收获负责制备有价值蛋白的转化细胞。当异源DNA序列整合到宿主基因组中时，可以产生稳定的转化体。对于植物而言，可以将所述异源DNA插入到染色体的一个中或插入到细胞器基因组中(线粒体，叶绿体)。本领域技术人员将理解，大肠杆菌可以用作中间宿主，并且其可以用于使用标准的或修饰的质粒载体来构建各种包含编码序列的质粒。植物转化可以使用从该中间宿主中回收的并用于例如通过基因枪装置直接转化细胞的质粒DNA来实现。可供选择地，可以将含有编码序列的嵌合DNA构建体链接到用于在农杆肿瘤菌(Agrobacteriumtumefaciens)或农杆根群菌(Agrobacteriumtumefaciens)中繁殖的基于Ti或Ri质粒的载体中，并且随后通过农杆菌属(Agrobacterium)介导的基因转移转化到植物细胞中。载体的实例包括克隆载体、表达载体和穿梭载体。克隆载体包括，为了制备更多DNA序列的目的，用于携带DNA片段进入受体的试剂。表达载体含有携带DNA序列进入宿主，并且在宿主中指导特定产物例如蛋白或反义转录物合成的试剂。表达载体可通过将编码DNA序列插入到载体中含有插入位点的表达盒中来制备。穿梭载体包括遗传元件，所述遗传元件被构建成具有用于两个宿主的复制原点，以使其可以用于携带外源序列到一个以上的宿主。例如，穿梭载体可以具有用于大肠杆菌和农杆根群菌(A.tumefaciens)的复制原点。通常，将DNA以表达的适当方向和正确阅读框插入到载体中。如果必要，可以将所述DNA与由需要的宿主识别的合适的转录和翻译调节控制核苷酸序列相连，虽然通常载体中有这些控制。调节元件可以得自植物或得自替代来源，所述替代来源包括植物病毒或农杆菌属的Ti/Ri质粒。可以将所述DNA插入物可操作地与合适的启动子连接，所述启动子例如植物病毒启动子或植物启动子。优选的启动子包括组成型启动子、诱导型启动子、临时调控启动子、发育调控启动子、细胞优选启动子和/或细胞特异启动子、组织优选启动子和/或组织特异启动子和化学调节启动子。所述启动子也可以是由转录因子结合位点的人工组合构建的合成启动子或人工启动子。组成型启动子包括CaMV35S和19S启动子(Fraley等人，第5，352，605号美国专利)。可以将McElroy等人，Mol.Gen.Genet231,150-160(1991)描述的启动子表达盒容易地进行修饰用于编码序列的表达，并且其特别适用于在单子叶植物宿主中使用。再另一个优选的组成型启动子得自泛素，所述泛素是已知在许多细胞类型中积累的另一种基因产品。所述泛素启动子已从几个物种中克隆，在转基因植物中使用(例如Binet等人，PlantScience79,87-94(1991)。诱导型启动子包括对非生物和生物环境刺激有应答的启动子。非生物环境刺激包括光、温度和水分有效性。生物环境刺激包括病原体(包括病毒诱导的启动子、细菌诱导的启动子、真菌诱导的启动子、昆虫诱导的启动子和线虫诱导的启动子)，与共生生物和食草动物的相互作用。所述启动子也可以对移动、触摸、组织损伤和植物激素(包括脱落酸、细胞分裂素、生长素、赤霉素、乙烯、油菜素内酯和肽，所述肽如系统素和结瘤因子)有应答。临时调节启动子包括昼夜节律调节启动子(circadianregulatedpromoter),以及那些响应非昼夜节律的守时机制的启动子。所述发育调节启动子包括用于器官和其他结构的组织特异启动子和细胞类型特异启动子，所述其他结构包括叶、茎、根、花、种子、胚、花粉和胚珠。用于表达植物中，特别是玉米和甜菜中编码序列的组织特异启动子或组织优选启动子是那些在根、髓、叶或花粉中指导表达的启动子。实例是来自拟南芥(Arabidopsisthaliana)bl-微管蛋白基因的TUBl启动子(Snustad等人，PlantCell4,549,1992),来自豌豆(Pisumsativum)的类金属硫蛋白基因的I^sMTA启动子区域(Evans等人，FEBSLetters262，29，1990)、来自拟南芥(A.thaliana)的RPLl6A和ARSKl启动子和在WO97/20057和WO93/07278中公开的另外的启动子。此外，化学诱导启动子用于指导表达，且也是优选的(参见WO95/19443)。尤其优选的是16SrRNA、psbA和rbcL启动子。除了启动子以外，可以将多种转录终止子引入到本发明的DNA构建体中。所述转录终止子负责终止超出转基因的转录和它的正确多聚腺苷酸化作用。所述转录终止子可以得自与启动子相同的基因或可以得自不同的基因。在优选实施方案中，将所述编码序列与它的天然存在的多聚腺苷酸信号序列可操作地连接。合适的转录终止子和那些已知在植物中发挥作用的终止子包括CaMV35S终止子、tml终止子、pearbcSE9终止子和本领域已知的其他终止子。合适的终止区域也可以得自农杆根群菌(ltumefaciens)的Ti质粒，例如章鱼碱合成酶和胭脂碱合酶终止区域。参见，例如Rosenberg等人，Gene,56，125(1987)；Guerineau等人，Mol.Gen.Genet.，262,141-144(1991)；Proudfoot,Cell,64，671-674(1991)。除上述以外，本发明的DNA构建体也可以包含可以调节表达水平的任意其他序列。已经发现许多序列从转录单元内增强基因表达，并且这些序列可以与编码序列共同使用，以提高在转基因植物中的表达。已经表明许多内含子序列增强表达，尤其是在单子叶细胞中的表达。例如，已经发现，当玉米Adhl基因的内含子导入玉米细胞时，显著增强其同源的启动子下的野生型基因的表达(Callis等人，GenesDevelop.1，1183-1200(1987))。内含子序列常规地引入到植物转化载体中，通常是引入到非翻译的前导区内。所述构建体也可以包括与合适的核苷酸序列可操作地连接的调控子，所述调节子例如叶绿体定位信号、叶绿体特异启动子、用于驱动同源同源重组的叶绿体特异序列、核定位信号(Lassner等人，PlantMolecularBiologyl7,2四_2；34(1991))、植物翻译共有序^lJ(Joshi,C.P.,NucleicAcidsResearchl5,6643-6653(1987))、内含子(Luehrsenandffalbot,Mol.Gen.Genet.225，81-93(1991))等。通常使用的植物转化载体为通过感染递送DNA的农杆菌属载体。其他载体包括基因枪载体和适用于DNA介导的转化的载体。这些方法对于本领域的技术人员来说是已知的。参见，例如，C.P.Lichtenstein禾口S.L.Fuller,的综述“Vectorsforthegeneticengineeringofplants，，,GeneticEngineering,ed.P.W.J.Rigby,vol.6,104-171(AcademicPressLtd.1987)。本发明的第一个方面的方法也可用于捕获二氧化碳。空气可以用于这种捕获，虽然如果空气富含二氧化碳时其是优选的，例如空气可以含有高达10%的二氧化碳。此外，为了使能够更有效地捕获二氧化碳，其允许进一步凭借制备可用于植物细胞的额外的碳来生产生物质。可以通过将含有二氧化碳的空气提供给临时浸渍生物反应器来实现二氧化碳的捕获。二氧化碳的来源可以来自任何来源，包括大气二氧化碳、二氧化碳罐，发电厂的废气或燃烧和/或发酵室的废气。为了调节临时浸渍生物反应器中生长培养基的pH和叶生物质的生长，可以有利地控制二氧化碳的浓度。生物燃料可以通过具有以下步骤的方法制备使叶生物质在以上描述的临时浸渍生物反应器中生长，例如所述生物反应器为一个或多个封闭的临时浸渍生物反应器；以连续的、半连续的或分批模式方法收获叶生物质；以及将来自叶生物质的脂质或碳水化合物转变为生物燃料。所述脂质或碳水化合物从叶生物质中的提取可以在转变为生物燃料之前或者作为转变为生物燃料的过程的一部分。可供选择地，所述脂质或碳水化合物可以由叶生物质分泌到培养基中，并从培养基中收获，用于转变为生物燃料。为了改进由叶生物质制备生物燃料，可以将生物质经受环境压力或几个压力的组合，从而提高脂质或碳水化合物的产量。为了改进将要转变为生物燃料的脂质或碳水化合物的产量和可达性(例如通过促进分泌到培养基中)，所述叶生物质也可以是经基因工程改造的。生物柴油可以通过酯基转移过程由油/脂质制备，并且是一种组成上与化石/矿物柴油类似的液体。它的化学名称是脂肪酸甲酯(或乙酯)(FAME)。将油与氢氧化钠和甲醇(或乙醇)混合，而化学反应生成生物柴油(FAME)和甘油。生物醇化合物是生物制备的醇，最常见的是乙醇(生物乙醇)和不太常见的是丙醇和丁醇，并且其是通过微生物和酶的作用，经糖、淀粉或纤维素的发酵制备的。本发明的第二个方面提供了在体外植物细胞中制备多肽的方法，所述方法包括提供含有叶绿体的未分化植物细胞，所述叶绿体携带编码所述多肽的转基因核酸分子，其中所述植物细胞显示同型异源性；和根据本发明的第一个方面的方法增殖植物细胞，以制备含有多肽的叶生物质，换句话说，所述细胞通过包括以下步骤的方法增殖，即提供未分化植物细胞，将植物细胞与促进细胞分化为叶组织的试剂接触，和使细胞在临时液体浸渍培养体系中生长。可以使用以上描述的及实施例中的方法将转基因核酸分子导入到叶绿体中。所谓同型异源性，我们指植物细胞的每个叶绿体中大部分或所有的多拷贝叶绿体DNA都被转化的情况。同型异源性可以通过在含有选择性剂的培养基上继代培养转质体材料数代来实现。所述选择性剂与转化构建体中使用的选择性标记相结合，并且可以是任何适当的选择性标记，如抗生素的抗性基因，所述抗生素如壮观霉素或卡那霉素。应用DNA印迹法对同型异源性的实现进行标准验证。提供其中植物不是转基因植物的未分化细胞的步骤包括放置植物切割碎片(植物材料)与植物激素接触，然后该植物激素在这些切割碎片的边缘生成愈伤组织；然后将所述愈伤组织亚培养为愈伤组织，并保持没有任何选择性。所述切割植物材料可以是整个或部分的根、叶、茎、花或种子。提供其中植物是转基因植物的未分化细胞的步骤包括通过靶向叶绿体DNA的同源重组方法将转基因核酸分子导入到植物细胞的叶绿体中。诱导含有转基因核酸分子的植物细胞，从而形成未分化细胞的愈伤组织；和将该愈伤组织在有效实现同型异源性的条件下繁殖。所述转基因构建体应包含至少两个与靶向叶绿体DNA相似(例如85%同源性以上)的核酸序列，从而实现同源重组(所谓的左右边界)；选择性标记基因和编码的肽或多肽序列；关于转质体未分化细胞的使用，同型异源性通过使用抗生素选择来实现，例如使用链霉素、壮观霉素或卡那霉素选择。可以通过本领域技术人员熟知的各种方法来实现愈伤组织的同型异源性，所述方法包括但不限于(i)将核酸导入叶的叶绿体DNA中，再生成(生长)植物，将该植物继代培养(将其切片，置于选择性培养基上，从而从叶部分再生苗)至少2次以达到同型异源性。当例如通过DNA印迹检测到同型异源性时，将选择的植物转移到新的培养基中从而生成根，并在最后将选择的植物转移到土壤中，直到其长出花和种子。然后将种子种于选择性培养基上，并且将长出的苗用于生成愈伤组织。(ii)按照上述⑴的方法，但是没有将植物转移到土壤中并开花。一旦达到同型异源性，便将所述植物的叶用于生成愈伤组织。(iii)将核酸导入到叶的叶绿体DNA中，然后当第一个叶子长出时，在选择性培养基上诱导愈伤组织(该植物材料为异源质体，因为其含有转化的与未转化的叶绿体DNA的混合物，其可以通过DNA印迹来验证)，然后将愈伤组织(callus)在选择性培养基上继代培养为多个愈伤组织(cal1i)，直到其最后达到同型异源性。(iv)将所述核酸导入到未分化细胞的叶绿体DNA中，并在选择性培养基上将转质体愈伤组织继代培养为愈伤组织，直到达到同型异源性。优选地，所述核酸分子包含选择性标记基因。通常，所述选择性标记基因是抗生素抗性基因，例如aadA、nptII、AphVI。通常，将核酸分子插入到载体或PCR片段中。通常，载体是质粒，并且通常载体可以在大肠杆菌、酵母、昆虫或哺乳动物细胞中增殖。优选地，所述质粒是叶绿体转化质粒。优选的是，多肽的表达是通过强的叶绿体特异启动子来驱动的。适当的启动子包括16SrRNA启动子、psbA启动子和rbcL启动子。植物细胞和叶绿体转化的方法是本领域技术人员熟知的，并且包括以上所讨论的禾口如SambrookandRussell(2001),MolecularCloning,Alaboratorymanual；GriersonandCovey(1988)Plantmolecularbiology禾口Watson等人(1997)RecombinantDNA中描述的转基因方法。在生长培养基中可利用的光的量和/或蔗糖的量可以影响多肽的制备。为了制备每个特异性多肽，技术人员可以基于使用的植物材料和制备需要的生物质，容易地优化所述生长培养基和包括气体混合物(例如，二氧化碳浓度)的条件。本发明的第二个方面的方法优选地包括进一步从叶生物质中获得多肽的步骤。如此获得的多肽也包括在本发明中。适当地，所述多肽通过压碎叶组织从而生成组织提取物并从该组织提取物中分离多肽而获得。适当地，使用过滤、HPLC、离子交换树脂提取、疏水相互作用树脂提取、亲和层析或油水相分离法中的至少一种，从所述组织提取物中纯化多肽。所述多肽可以含有用于纯化多肽的标签。所述标签可以为可裂解或不可裂解的标签，例如GST、生物素、6His、Mr印、HA或myc标签中的任一种。本发明还包括通过本发明的第一个方面的方法获得的叶生物质。由所述方法获得的多肽可以是治疗性多肽、酶、生长因子、免疫球蛋白、激素、结构14蛋白、植物应激反应中牵涉的蛋白、生物药物或疫苗抗原中的任一种。本发明的第三个方面提供了用于获得存在于叶生物质中的成分的方法，所述方法包括根据本发明的第一个方面制备叶生物质和从所述叶生物质中获得所述成分。通常，所述成分以大体上纯的形式获得，因而所述方法可以包括纯化所述成分的进一步的步骤。所述的大体上纯的形式通常包含>90%、或>95%或>99%的所述成分。所述成分可以通过其从叶生物质中的分泌或通过从叶生物质中提取获得，所述提取例如通过压碎叶生物质以释放所述成分。所述获得的成分可以是药用物质、重组表达多肽、碳水化合物、脂质、油、挥发性芳香族化合物、抗氧化剂、色素、香味剂或香味剂前体；并且所述成分可以是内源性的或外源性的。本发明还提供了将所获得的成分加工为进一步产品，例如生物燃料、食品或药用女口广PFtο本发明还包括用于在体外植物细胞中生产多肽的系统，所述系统包括促进未分化细胞分化为叶组织的试剂；和编码多肽的核酸分子，所述核酸分子适用于导入到叶绿体中并在叶绿体中表达。本发明的再一个方面提供了捕获二氧化碳的方法，所述方法包括进行本发明的第一个方面所述的方法。纯化样品的方法包括将所纯化的样品暴露于得自本发明的第一个方面的方法的叶生物质。所述纯化过程可以是去除一种或多种毒素。还提供了生产药物组合物的方法，所述方法包括配制通过本发明的其他方面的方法获得的成分和药学上可接受的载体稀释剂、赋形剂或载体。此外，提供了医药产品，所述医药产品包含通过本发明其他方面的方法获得的成分和药学上可接受的载体稀释剂、赋形剂或载体。在本发明的另一个方面中，提供了生产生物燃料的方法，该方法包括将通过本发明的其他方面的方法获得的成分进行发酵或酯基转移。还提供了通过这种生产方法获得的生物燃料。现参考以下的非限制性实施例和附图来更详细地描述本发明。图1.转质体GFP-6系的DNA印迹分析(A)靶向的叶绿体区域中野生型烟草(Nicotianatabacum)品种petitHavana(fft-ptDNA)和转化的(T_ptDNA)烟草原质体系的物理图谱。每个图谱下的箭头表示各自的基因组DNA经BglII酶消化后预测的DNA片段大小。白色表示载体序列，而橙色为烟草原质体系序列。(B)转基因系GFP-6(GFP-6)和野生型烟草的全基因组DNA使用BglII消化后的DNA印迹分析。将消化的基因组DNA在0.7%(w/v)的琼脂糖凝胶上跑胶，然后转移到尼龙膜上，并使用对应于由引物PHK40-F和rpsl2-0Ut-R(黑色条)扩增靶向区域的Dig-标记的PCR片段进行探测。图2.在转质体GFP-6烟草系中GFP+的检测。在GFP-6同型异源系(GFP-6)中在UV及可见光下可视化GFP表达(A)，对照为野生型(wt)烟草植株。(B)来自GFP-6和野生型系的可溶性蛋白质的蛋白质电泳。将每种植物的5μg全可溶性蛋白提取物和预染色的蛋白质标记物(NewEnglandBiolabs1UK)点样于12.5%(w/v)SDS-PAGE凝胶上，通过银染可视化蛋白质分离。使用特异性抗GFP抗体，通过蛋白质印迹特异性检测GFP。也显示了与染色的标记的迁移。图3.在不同转质体烟草组织中GFP+的表达。生成了来自GFP-6和野生型烟草的愈伤组织、细胞悬浮液和叶的全部可溶性蛋白质提取物。对于愈伤组织和细胞悬浮液，在12.5%(w/v)SDS-PAGE凝胶上，每个泳道点样5yg全可溶性蛋白，然而对于叶提取物每个泳道只点样lyg。(A)对应于银染凝胶，然而(B)代表使用GFP抗体的相应蛋白质印迹。GFP标准品购自RocheLifeScience，UK，而预染色的蛋白质标记购自NewEnglandBiolabs，UK。标记蛋白的梯状大小以kDa计。Wt代表烟草(Nicotianatabacum)品种PetitHavana，而大肠杆菌(E.coli)对应于从使用pFMGFP转化的E.coliKRX菌株中提取的蛋白质。图4.在不同条件下GFP-6转质体愈伤组织的生长。在25°C下生长4周后拍摄同型异源愈伤组织GFP-6的照片。采用与烟草育苗相似的密度，以16/光照生长平板(A，B，C*D)和在黑暗中生长(E，F，G和H)。只有A、B、E和F的培养基中含有3%(w/v)的蔗糖。所有的培养基含有500mg/L的壮观霉素和500mg/L的链霉素。在490nm下激发后，使用Axiovert200M倒置显微镜(CarlZeiss,Goettingen,Germany)以及Axiovision软件(Version3·0)，在520nm下检测荧光发射。对于A、D和E、H的荧光曝光分别是30ms、IOOms和600ms。在A、D、E和H中的显微镜放大倍数相同，为40X。图5.在不同条件下生长的GFP-6愈伤组织中GFP+的检测。从光(L)或黑暗(D)下生长的愈伤组织以及光和糖下生长的野生型(Wt)中提取全可溶性蛋白。培养基中蔗糖的存在以(+)表示，然而没有蔗糖的培养基以(_)表示。将各个愈伤组织的5μg全可溶性蛋白点样于12.5%(w/v)SDS-PAGE凝胶上(L_，L+,D+,D-,wt)，并通过银染检测全蛋白的含量(A)。M代表预染色的蛋白标记(NewEnglandBiolabs1UK),并且在左侧以kDa表示相应的大小。(B)GFP+的存在使用抗GFP抗体进行特异性检测。将GFP标准品(Upstate,USA)按纳克显示的含量加入。图6.在来自临时浸渍生物反应器的新形成的绿色生物质中GFP+的表达。6周的孵育期后，将GFP-6系(A)的烟草生物质从临时浸渍生物反应器中移去。使用丙酮提取方案从新形成的叶中提取全蛋白，并将全蛋白连同预染色的低范围的SDS-PAGE标准品(Bio-fcidLaboratories,UK)点样于10%(w/v)SDS_PAGE凝胶上。使用考马斯亮蓝染色，使来自野生型(wt)和GFP-6系(GFP-6)的蛋白可视化。将不同稀释度的丙酮粉通过使用抗GFP抗体的免疫印迹分析(C)，并与已知含量的GFP蛋白(Upstate，USA)进行比较。图7.丙酮沉淀方案期间GFP的检测。表示来自丙酮提取方案中不同步骤的几个样品中GFP存在的蛋白质印迹。将沉淀直接重悬浮在上样缓冲液中，然而在上样缓冲液加入前将清洗物在speedvac(Savant，NY，USA)中干燥过夜。沉淀⑵样品只点5μ1，然而来自清洗物(W)的所有上清液为1-4倍。图8.烟草(Nicotianatabacum)品种PetitHavana细胞悬浮液的干重和鲜重。在18天的生长期间中每2天测定一次烟草野生型细胞的鲜重和干重。干重为将新鲜烟草细胞在80°C下放置24h后测量得到。测量重复进行三次。棚列1侧丨·糖隨十謝本搞終艦猶目胃0概要叶绿体转化是用于植物重组蛋白的商业制备的有前途的方法。然而，对于本领域中大规模培养转质体植物仍旧存在基因约束的问题。这里，我们评价了使用烟草转质体细胞悬浮液在模型蛋白质的完全约束制备中的潜力，所述模型蛋白质为绿色荧光蛋白(GFP+)的修饰形式。转质体叶中，GFP+的表达达到全可溶性蛋白(TSP)的大约60%。细胞悬浮培养物中的表达少得多(1.5%的TSP)，但是每升液体培养物仍仍旧产生约7.2mgo我们进一步研究了影响愈伤组织中GFP+制备的不同因素和强调了作为输入的光的重要性。最后，我们描述了新蛋白质的制备平台的开发，在该平台中，在噻苯隆的存在下，将转基因细胞悬浮培养物置于临时浸渍生物反应器中，以开始苗的形成。GFP+的产量达到了可观的每L的生物反应器660mg。这个新的制备平台与转质体细胞悬浮培养物的快速生成和临时浸渍生物反应器的使用组合，是用于重组蛋白的完全约束的低成本制备的有前途的途径。结果表达GFP+的同型异源性烟草苗的产生构建用于表达烟草叶绿体中的GFP+的载体得自pJSTIO，所述pJSTIO用于表达烟草叶绿体中的TetC抗原(Tregoning等人，200。质粒pJSTIO靶向烟草叶绿体基因rrnl6S和rpsl2/7之间的表达和选择盒的插入(图1A)。轰击后，由10次独立轰击生成一些壮观霉素抗性苗，并在分析的6个中的4个苗中通过PCR分析检测gfp+整合(数据未显示)。选择GFP-6用于进一步的试验，并在MS选择性培养基上进行了四轮继代培养。为了证实将所有GFP-6系的叶绿体转化，从该植物的叶子中提取全基因组DNA，用BglII消化，并进行DNA印迹分析(图1)。和预期的一样，对应于插入位点的探针与野生型烟草DNA中的4.5kb的单一条带杂交。相反地，在GFP-6系中检测到了7.Ikb条带，该GFP-6系与gfp+基因和选择性标记的插入一致。GFP-6中4.5kb条带的缺少也表明GFP-6是同型异源性的(图IB)。GFP-6系中GFP+的表达将烟草GFP-6系在土壤中生长，并通过将植物暴露于UV/蓝色光源来检测GFP+的表达(图2A)。强的绿色荧光可以在GFP-6中观察到，但是在野生型中观察不到，表明了GFP-6中GFP+的表达。为了证实GFP的累积，从GFP-6和野生型系中提取全可溶性蛋白，并在SDS-PAGE凝胶上将其分离(图2B)。使用特异性抗GFP抗体的免疫印迹分析证实了GFP+的累积和显著分解产物的缺乏。银染(图2B)和考马斯亮蓝染色的凝胶(数据未显示)显示迁移至27kDa的GFP+高度表达，并且是可溶性提取物中的主要蛋白。GFP-6烟草系在叶子、愈伤组织和细胞悬浮液中表达水平的比较将从GFP-6系获得的TO种子在MS平板上体外发芽，并且将得到的幼嫩叶子用于产生相应的转质体愈伤组织和细胞悬浮液。在亲本植物GFP-6的愈伤组织状态、细胞悬浮培养物和叶子中，通过SDS-PAGE(图3A)和半定量免疫印迹分析(图;3B)，使用已知量的在市场上可得到的GFP作为标准，来评价GFP+的表达。该对比的最明显的结果是，与愈伤组织和细胞悬浮液相比，烟草叶子中极高水平的GFP+表达(图3A)。免疫印迹表明，叶子中GFP+的表达是TSP的约60%，其等于按鲜重计约5mg/g，然而在愈伤组织和细胞悬浮液中的表达为TSP的约1.5%(图;3B)。考虑到细胞悬浮液的生长(补充的图8)，将转质体细胞悬浮液中GFP+生产的速率估计为大约0.4mg/L/天。光和糖对愈伤组织中GFP表达的影响为了评估光和外源蔗糖对GFP+表达的重要性，将来自GFP-6系的转质体愈伤组织在使用或不使用光和使用或不使用蔗糖(图4)，但是在用于维持选择的500mg/L壮观霉素的存在下，在愈伤组织诱导培养基上生长大约一个月。如图4所示，通过添加蔗糖，愈伤组织生长得到显著促进，其与光的强度无关。当将光和糖两者都用于转质体愈伤组织时，可以鉴定到大量的表达GFP+的小叶绿体/质体，所述小叶绿体/质体分散在胞质溶胶中(图4A)。如果没有为愈伤组织提供光和糖，则GFP荧光减少和叶绿体/质体的量降低并分布于细胞中心(图4D和4E)。在缺乏光和糖下生长的愈伤组织中没有检测到GFP表达(图4H)。免疫印迹实验证明，在完全黑暗中生长的细胞表达的GFP很少或几乎不表达，然而在有光下，不考虑蔗糖的存在与否，表达均升高(图5)。当在光和蔗糖(L+)存在下生长时，通过免疫印迹估计GFP+表达的水平为TSP的约4%(图5)。当正常化到愈伤组织的鲜重和干重时，该估计值分别相当于高达48μg/gf.w.(鲜重)或约lmg/gd.w.(干重)的GFP+表达水平。用于转质体生物质的制备的临时浸渍生物反应器的使用考虑到叶组织中转质体基因的表达似乎是最高的，我们寻求开发用于从愈伤组织/细胞悬浮液中快速制备叶组织的方法。在预实验中，我们发现已知促进烟草中体细胞胚生长的噻苯隆(TDZ)的添加，能够诱导由在固体MS培养基上生长的GFP-6愈伤组织形成苗(数据未显示)。为了扩大生产能力，将来自烟草GFP-6系的转质体细胞悬浮液装载于2L的生物反应器中，并临时浸入到补加了0.1μΜTDZ的MS培养基中。约6周后，产生了大量的苗(图6Α)。在第一个14天期间，没有检测到生长，并且苗仅在这个期间后才开始生长。可能该停滞期与细胞从愈伤组织再分化为烟草叶组织需要的时间有关，所述细胞再分化与在拟南芥中观察到的愈伤组织和分生组织间的转换方式相似(Gordon等人，2007)。40天后，将全部生物质从生物反应器中移除用于分析。植物材料的检查揭示存在的主要为健康叶片，少量为玻璃化的。2L的生物反应器中产生总量为鲜重约470g的生物质。为了估计在该生物质中产生的GFP+的量，基于丙酮中的蛋白质沉淀开发了蛋白质沉淀方案。使用该方法生产了粉末，称重后，将其点样于SDS-PAGE凝胶上以检测生成的GFP+(图6B)。检测到约27kDa大小的清晰条带，而野生型中没有。为了定量转质体生物质中GFP+的产量，将几个量的丙酮粉末点样，并通过免疫印迹将1μg这种粉末估计为含有大约150ngGFP+(图6C)。这表明表达水平达到了约2.8mg/g鲜重。在该生物反应器中，在40天生长时间内，在近似速率17mg/L/天的GFP下，总的GFP产量达到了约660mg/L。这个值比0.%ig/L/天的细胞悬浮液可潜在达到的速率高约42倍。讨论烟草转质体细胞悬浮培养物到目前为止，在叶绿体转化领域中大部分工作集中在用于表达数个目的基因的叶片上。已经对转质体马铃薯块(Sidorov等人，1999)和转质体番茄果实(Ruf等人，2001)中的表达进行了一些工作，但是表达量相对很少(分别为TSP的0.05%和0.5%)。然而，种植转基因植物，即使它们是转质体的，但大量公众仍然领会到严重性并且可能的环境问题可以对任何未来的发展产生严重影响。此外各个新的转质体领域的获准有非常显著的监管费用。在基于约束转质体细胞的培养物中制备重组蛋白将克服许多这样的问题并且由于这种新制备体系的高度约束本性能显著降低调节费用。为了对比不同类型的表达系统，我们首次创建了烟草的同型异源性系，该同型异源性系表达绿色荧光蛋白变体(GFP+)的变体。先前已经显示，GFP在包括烟草(Khan和Maliga,1999；Newell等人，2003)、马铃薯(Sidorov等人，1999)和莴苣(Kanamoto等人，2006)在内的一系列不同植物的叶绿体中能够高度表达。此处描述的GFP表达的水平在叶中TSP的大约60%，处于表达的高端，并且与莴苣中观察到的GFP表达的值相似，在莴苣中GFP实现了TSP的36%(Kanamoto等人，2006)。我们的结果清楚地显示，与叶中的在TSP的1.5到4%变化的水平(图3和5)相比，愈伤组织和细胞悬浮培养物中GFP+表达的水平较低，所述叶的GFP+表达水平与临时转质体莴苣愈伤组织中GFP的表达为TSP的1%相似(Lelivelt等人，2005)。转质体细胞悬浮液中GFP+的表达达到TSP的约1.5%，其对应于7.2mg/L,生产速率为O.^ig/L/天(图5)。该表达水平可能通过优化培养基，例如通过添加聚乙烯吡咯烷酮和/或明胶来提高，该提高有助于改进在核转化植物细胞中蛋白质表达的量(Kwon等人，2003;Lee等人，2002)。我们也显示当光和糖的量更好地优化时，GFP+水平可提高至约TSP的4%(图5)。如果该结果外推至细胞悬浮液生长期，GFP的产量可以潜在地达到约lmg/L/天。影响转质体愈伤组织中GFP+产量的因子转质体愈伤组织和细胞悬浮液中通常较低的表达水平可以直接通过叶绿体转化载体的选择和特别地通过驱动GFP+表达的各个启动子来解释。pFMGFP中使用的RNA16S基因的启动子，Prrn，与来自水稻的RNA16S启动子相似，所述RNA16S启动子在水稻胚胎发生细胞中的活性与其在叶子中的活性相比降低了7倍(Silhavy和Malign1998)。由于细胞悬浮液质体相对于叶片叶绿体分化较少，此处可能发生了相同的现象。然而，进一步的工作将必须评估叶和愈伤组织两者中GFPmRNA的水平从而能够区分mRNA水平的降低或可能的叶绿体数目改变。光对于显著GFP+表达似乎是明显必需的(图5)，然而蔗糖表现为与增加的细胞生长更为相关。然而，这些结果可能是有偏见的，由于尽管在黑暗中一个月的培养期，GFP+非常稳定并且在黑暗下的补充蔗糖的培养基上生长的愈伤组织中检测到的表达可以相当于在将其转移到黑暗中前，来自烟草细胞的残留GFP+的量。事实上，在马铃薯微管中由相同启动子驱动的GFP的表达只达到TSP的0.05%(Sidorov等人，1999)，其可能表明在prrn启动下GFP的表达的真实基线远远低于此处观察到的基线。在我们的实验中，可注意的到，愈伤组织和细胞悬浮液保持绿色，并且具有大量的叶绿体广泛散布在细胞各处(图4A)。在这些细胞中GFP+达到约TSP的4%，并且此种高的水平可能表明这些细胞实际上是临时的细胞悬浮液，所述临时的细胞不能完全去分化，并且在这些细胞中，质体仍与功能性叶绿体相似。临时浸渍生物反应器中转质体生物质的生产叶中GFP+产量远远优于未分化细胞中的GFP+产量(图3)，因此尝试促进从转质体愈伤组织的诱导苗。向固体培养基中添加噻苯隆(TDZ)，6周后能够诱导苗由愈伤组织的形成(数据未显示)。有趣地，在洋红色盒子中观察到的生长不是线性的，并且在前二周内没有检测到特别的生长。然而，当将转质体细胞悬浮液置于临时浸渍条件下时，“叶”材料的制备是有效和显著的，并且最终生物质的生成非常丰富，在所述条件下使用临时浸渍类型生物反应器将细胞材料偶尔浸入液体中，仅持续短的时间(图6A)。在基于固体培养基的诱导和基于临时浸渍生物反应器的诱导两者中都观察到生物质生长中相似的停滞期，在所述临时浸渍生物反应器中，在最初的2周内没有检测到生长。所述材料主要由健康小叶组成并且估计所述GFP+的含量达到约0.66g/L(图6C)。这些值稍微低于在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(Wilke和Katzek，2003)中观察到的产量，但却是基于植物的系统中获得的最高产量之一。另外，该表达水平是在没有任何优化的情况下获得的，并且将来的发展应该改进工艺的产量和可扩展性。例如，以玻璃瓶换成一次性袋子使得采用临时浸渍生成的咖啡体细胞胚的量几乎翻倍(Ducos等人，2008)，这可能是由于更好地光透过和再分配。如果将相似的系统用于转质体烟草苗，产量可以达到超过lg/L。这里描述的适当规模的系统应比温室中制备整个植株所花费的劳动强度少很多，并且也不需要温室防护设施。其也可以为来自转化组织的靶蛋白的制备提供潜在更快的途径，因为不需要生成种子。实际上，一旦鉴定了同型异源性烟草系，则要获得适于临时浸渍生物反应器的细胞悬浮培养物只需要一个月，然而，如果需要生成种子，则约3个月是必需的(Molina等人，2004)。因而，转质体苗的临时浸渍生长与最近描述的一次性生物反应器(Terrier等人2007;Ducos等人，2008)的组合是植物中生物药物的低成本制备的有希望的途径。实验过程烟草苗、愈伤组织和细胞悬浮液的生成在25°C下，将烟草品种PetitHavana(烟草)幼苗、愈伤组织和细胞悬浮液在30%湿度的Fi-iTotron600H培养箱(Sanyo,Watford,UK)中，在16小时光周期(约100μmol/m2/s)下生长。将烟草幼苗在MS培养基(Murashige和Skoog，1962)上萌发，并通过将叶的小碎片置于愈伤组织诱导培养基(CIM)上来生成愈伤组织，所述愈伤组织诱导培养基为补加了lmg/L的1-萘乙酸(NAA)和0.lmg/L激动素(K)的MS培养基。细胞悬浮液通过将大量的愈伤组织在缺少琼脂的CIM培养基中，于140rpm的恒速搅拌下孵育产生。所有的植物激素和培养基均购自Sigma,StLouis,MO,USA。叶绿体转化载体的构建通过使用Ndel和^Cbal限制性位点双酶切先前表征的烟草叶绿体载体PJSTlO(Tregoning等人，2003)，将TeTC基因用gfp+基因Gcholz等人，2000)替代来创建叶绿体转化载体pFMGFP。转质体烟草植物的生成使用具有IlOOpsi的爆破片的PDS1000/He(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)基因枪设备，在其组成以MS培养基为基础的RMOP培养基(Svab等人，1990)上用烟草叶绿体转化载体pFMGFP对6周龄野生型烟草叶进行基因枪转化，所述MS培养基补加有lmg/L的硫胺素、100mg/L的肌醇、lmg/LN6-苄基腺苷(BAP)和0.lmg/L的萘乙酸(NAA)。根据生产商的建议，将pFMGFP载体包被于550nm的金粒子(SeaShell1LaJolla1CA,USA)上。轰击之后，将叶片在黑暗中保持48小时，然后在将植物材料切成小碎片(5mmχ5mm)并置于补加有500mg/L盐酸壮观霉素的RMOP培养基中。将壮观霉素抗性苗在相同的培养基上继代培养4代。DNA印迹分析整合到烟草原质体系的载体使用在gfp+开始处退火的一个引物，和另一个位于烟草基因组载体pFMGFP的同源区域之外的引物通过PCR进行评价(数据未显示)，并且选择了转质体GFP-6系用于所有进一步实验。通过来自野生型和转质体GFP-6系两者的经酶切的全基因组DNA的DNA杂交来评价同型异源性状态。用BglII酶切约7μg的基因组DNA，并在0.7%(w/v)的琼脂糖凝胶上跑胶。通过毛细作用将DNA凝胶转移到尼龙膜上，在20χSSC缓冲液中过夜。MDIGHighPrimeDNALabellingandDetectionStarterKitII(RocheAppliedkience，UK)，在37°C下将探针进行DIG标记过夜。通过PCR获得与靶区域同源的31Λ探针，所述PCR使用引物pJSTlO-F5’AATTCACCGCCGTATGGCTGACCGGCGA3’和Rps12-0UT-R5‘TTCATGTTCCAATTGAACACTGTCCATT3，，并用烟草基因组DNA作为模板。按照生产商的推荐以最终浓度为25ng/ml，进行探针标记和杂交。按照生产商的指导，通过X射线胶片(Amersham，UppsalEi，Sweden)检测具有给定的CSPD的特异性信号检测。在通过DNA印迹分析证实同型异源性后，将GFP-6小植株转移到土壤中，并使其产生种子。将该Ttl种子在补加有500mg/L壮观霉素的MS培养基上发芽，并将幼嫩的Ttl叶子用于愈伤组织和细胞悬浮液的生成。蛋白质提取首先，根据(Kanamoto等人，2006)进行总可溶性蛋白质的提取。将植物材料(叶片、愈伤组织、细胞悬浮液)使用液氮研磨成细粉末，并与总可溶性提取缓冲液混合(50mMHEPESpH7.6、lmMDTTUmMEDTA,2%(w/v)聚乙烯吡咯烷酮和一片完全蛋白酶抑制剂不含EDTA的混合物(completeproteaseinhibitorsEDTA-freecocktail)(RocheProductsLtd,WelwynGardenCity,UK))。将植物混合物涡旋混合1分钟，并在4°C下，以13，OOOrpm旋转30分钟。将上清液等分并储存在-20°C下，直至进一步使用。第二种方法是以总蛋白提取方案为基础的丙酮沉淀法。将植物材料在液氮中研磨成细粉。将30ml提取缓冲液(80%(ν/ν)丙酮，5mM抗坏血酸盐)加入到2g植物细粉或叶等同物中，并将该混合物使用Ultra-Turrax(IKA,Heidelberg,Germany)在冰上均质15s。通过在4°C下，以5000g离心5分钟来沉淀蛋白质。弃去上清液，将沉淀用相同的提取缓冲液和相同的离心条件洗涤4次。然后，将沉淀重新悬浮在纯丙酮中，并再次均质。将所述蛋白在4°C下，以10，00(^旋转一次以上，每次5!^11。弃去上清液，并将沉淀用纯丙酮洗涤3次以上。在最后一次洗涤中，将该缓冲液等分，并使用Speed-Vac(Savant,Holbrook,NY,USA)干燥，并且将残留的粉末称为丙酮粉末。通过蛋白质印迹分析检测沉淀和不同的洗涤液中GFP的存在(补充的图7)。电泳和蛋白质印迹分析将来自转质体和野生型样品的蛋白质连同蛋白质标记和可商购获得的重组,MA,USA)用12.5%(w/v)SDS-PAGE凝胶再溶，用于定量目的。将蛋白凝胶直接用考马斯亮蓝或银染染色。电泳后，根据生产商的建议，使用miniTrans-Blotsystem(Bio-Rad,Hercules,CA,USA),或通过使用iBlot干转移系统(Invitrogen，UK),将蛋白质转移到0.2μπι的硝酸纤维膜(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)上。转移之后，通过使用以120，000稀释的第一兔多克隆抗GFP抗体(由ProfNixon，ImperialCollegeLondon,M提供)进行GFP特异性检测，而将第二抗体(辣根过氧化物酶缀合的羊抗兔免疫球蛋白G,Amersham,Uppsala,Sweden)稀释为110，000。使用ECLSuperSignalWestPicoChemiluminescenceSubstrate试剂盒(PierceBiotechnologyInc.，UK)进行生物化学检测。临时浸渍生物反应器通过将大约7克的烟草品种PetitHavana细胞悬浮液置于2L的临时浸渍生物反应器中生成烟草生物质(Ducos等人，2007)。在40天的时间内，每三小时使用IL补加有0.1μM噻苯隆(TDZ,Sigma,UK)的MS培养基浸渍5分钟。此外，所述培养基包含100mg/L的壮观霉素来防止污染和选择转质体细胞。据雀巢公司的研究人员估计，基于培养皿中愈伤组织固体诱导，MS培养基中TDZ(噻苯隆)的浓度最优为0.1μM(数据未显示)。将培养基在3分钟内通过空气泵推入2L的容器中，并使其通过重力在2分钟以上退回到原始瓶中。光的条件和温度与愈伤组织和细胞悬浮液的生长实验类似。荧光显微镜使用Axiovert200Μ倒置显微镜(CarlZeiss,Goettingen,Germany)和AxioVision软件(3.O版)观察表达GFP并来源于GFP-6系的转质体烟草愈伤组织和细胞悬浮液。将对于GFP+检测优化的激发波长和发射波长分别设置在491nm和512nm(Scholz等人，2000)。曝光和放大倍数根据实验改变，并将其显示于每个图。表Si.鲜重、干重和丙酮粉末之间的比率。计算这些比率以确定GFP的稳健定量。对于鲜重(f.W.)、干重(d.w.)和丙酮粉末(粉末)，数值代表至少4次重复的平均值。在它们各自生长期的最后，收获愈伤组织和悬浮液(细胞)，并对在2-3周幼嫩小植株(每株大约有4片叶子，与临时浸渍生物反应器中产生的生物质相似)进行叶子的测量。组织粉末/d.w.(%)/叶6.6士0.928.3±1,1细胞4.4±0.314.1=1.4愈伤组织3.6二0.412.4=1.3参考文献AzhagiriAKandMaligaP(2007)ExceptionalpaternalinheritanceofplastidsinArabidopsissuggeststhatlow-frequencyleakageofplastidsviapollenmaybeuniversalinplants.PlantJ52:817-823.BirchRG(1997)PLANTTRANSFORMATION=ProblemsandStrategiesforPracticalApplication.AnnuRevPlantPhysiolPlantMolBiol.48:297-326.22BrinkmannNandTebbeCC(2007)Leaf-feedinglarvaeofManducasexta(Insecta,Lepidoptera)drasticallyreducecopynumbersofaadAantibioticresistancegenesfromtransplastomictobaccobutmaintainintactaadAgenesintheirfeces.Environmentalbiosafettresearch6:121—133·DaniellH,LeeSB,PanchalTandWiebePO(2001)ExpressionofthenativecholeratoxinBsubunitgeneandassemblyasfunctionaloligomersintransgenictobaccochloroplasts.Journalofmolecuarrbiology311:1001-1009.DoranPM(2000)Foreignproteinproductioninplanttissuecultures.Currentopinioninbiotechnology11:199-204.DucosJ，LabbeG，LambotCandPetiardV(2007)Pilotscaleprocessfortheproductionofpre-germinatedsomaticembryosofselectedrobusta(Coffeacanephora)clones.InVitroCellular&DevelopmentalBiology-Plant43:652-659.DucosJ，TerrierB，CourtoisDandPetiardV(2008)Improvementofplastic—baseddisposablebioreactorsforplantscienceneeds.PhytochemistryReviews7:607-613.FarranI,Rio-ManterolaF，IniguezM，GarateS，PrietoJandMingo-CastelAM(2008)High-densityseedlingexpressionsystemfortheproductionofbioactivehumancardiotrophin-1,apotentialtherapeuticcytokine,intransgenictobaccochloroplasts.Plantbiotechnologyjournal6:516-527.FischerR，EmansN，SchusterF，HellwigSandDrossardJ(1999)TowardsmoIecularfarminginthefuture:usingplant—eel1—suspensionculturesasbioreactors.Biotechnologyandappliedbiochemistry30(Pt2):109-112.FischerR，StogerE,SchillbergS,ChristouPandTwymanRM(2004)Plant-basedproductionofbiopharmaceuticals.Currentopinioninplantbiology7:152-158.FoxJL(2003)PuzzlingindustryresponsetoProdiGenefiasco.Naturebiotechnology21:3-4.GillRandSaxenaPK(1993)SomaticembryogenesisinNicotianatabacumL.:inductionbythidiazuronofdirectembryodifferentiationfromculturedleafdiscs.PlantCellReportsl2:154-159.GlebaY,KlimyukVandMarillonetS(2007)Viralvectorsfortheexpressionofproteinsinplants.CurrOpinBiotechnol.18:134-41.GordonSP,HeislerMG，ReddyGV,OhnoC，DasPandMeyerowitzEM(2007)PatternformationduringdenovoassemblyoftheArabidopsisshootmeristem.Development(Cambridge,England)134:3539-3548.HagemannR(2004)TheSexualInheritanceofPlantOrganelles,inMolecularBiologyandBiotechnologyofPlantOrganellespp93-113.HaliouaE(2006)Statusofbiomanufacturingintheworld.Eurobioconference2006.www.eurobio2006.com/DocBD/press/pdf/41.pdf(accessed3/3/09)HellwigS,DrossardJ,TwymanRMandFischerR(2004)Plantcellculturesfortheproductionofrecombinantproteins.Naturebiotechnology22:1415-1422.HuangCYiAyliffeMAandTimmisJN(2003)DirectmeasurementofthetransferrateofchloroplastDNAintothenucleus.Nature422:72-76.HuangJiSutliffTDiWuLiNandiSiBengeKiTerashimaMiRalstonAH,DrohanW，HuangNandRodriguezRL(2001)Expressionandpurificationoffunctionalhumanalpha-l-Antitrypsinfromculturedplantcells.Biotechnologyprogress17:126-133.KanamotoH，YamashitaA，AsaoH，OkumuraS，TakaseH，HattoriM，YokotaAandTomizawaK(2006)EfficientandstabletransformationofLactucasativaLev·Cisco(lettuce)ρlastids.Transgenicresearchl5:205-217.KangTJ，LocNH，JangMO,JangYS，KimYS，SeoJEandYangMS(2003)ExpressionoftheBsubunitofE.coliheat一labileenterotoxininthechloroplastsofplantsanditscharacterization.Transgenicresearchl2:683-691.KhanMSandMaligaP(1999)Fluorescentantibioticresistancemarkerfortrackingplastidtransformationinhigherplants.Naturebiotechnology17910-915.KwonTH,SeoJE,KimJ，LeeJH,JangYSandYangMS(2003)Expressionandsecretionoftheheterodimericproteininterleukin-12inplantcellsuspensionculture.Biotechnologyandbioengineering81:870-875.LangbeckerCL，YeGN，BroylesDL，DugganLL，XuCW,HajdukiewiczPT，ArmstrongCLandStaubJM(2004)High-frequencytransformationofundevelopedplastidsintobaccosuspensioncells.Plantphysiologyl35:39-46.LeeJH,KimNS,KwonTH,JangYSandYangMS(2002)Increasedproductionofhumangranulocyte-macrophagecolonystimulatingfactor(hGM-CSF)bytheadditionofstabilizingpolymerinplantsuspensioncultures.Journalofbiotechnology96:205-211.LeliveltCL,McCabeMS,NewellCA,DesnooCB,vanDunKM,Birch-MachinI，GrayJC,MillsKHandNugentJM(2005)Stableplastidtransformationinlettuce(LactucasativaL.).Plantmolecularbiology58:763-774.MaJK,DrakePMandChristouP(2003)Theproductionofrecombinantpharmaceuticalproteinsinplants.Naturereviews4:794—805·MaligaP(2004)Plastidtransformationinhigherplants.AnnuRevPlantBiol.55:289-313.MolinaA，Hervas-StubbsS，DaniellH，Mingo-CastelAMandVeramendiJ(2004)High-yieldexpressionofaviralpeptideanimalvaccineintransgenictobaccochloroplasts.Plantbiotechnologyjournal2:141—153·MonierJM,BernillonD，KayE，FaugierA，Rybalka0，DessauxY，SimometPandVogelTM(2007)DetectionofpotentialtransgenicplantDNArecipientsamongsoilbacteria.Environmentalbiosafetyresearch6:71-83.MurashigeKandSkoogF(1962)Arevisedmediumforrap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任ー项的方法获得的多肽或通过处理权利要求1至20中任ー项的方法获得的叶生物质后获得的多肽。28.通过权利要求1至20中任一项所述的方法获得的叶生物质。29.ー种用于获得存在于叶生物质中的成分的方法，所述方法包括根据权利要求1至20中任ー项的方法制备叶生物质，和从所述叶生物质中获得所述成分。30.根据权利要求四的方法，其中所述成分通过叶生物质的分泌或通过叶从叶生物质中提取获得，所述提取例如通过压碎叶生物质以释放所述成分。31.根据权利要求四或30的方法，其中所述成分是药用物质、重组表达多肽、碳水化合物、脂质、油、挥发性芳香族化合物、抗氧化剂、色素、风味剂或风味剂前体；并且其中所述成分可以是内源性的或外源性的。32.根据权利要求四至31中任ー项的方法，其中将所述成分加工成进ー步产品，例如生物燃料、食品或药用产品。33.一种用于在植物細胞中体外制备多肽的系统，所述系统包括促进未分化植物細胞分化为叶组织的试剂；和编码多肽的核酸分子，所述核酸分子适用于导入到叶绿体中并在叶绿体中表达。34.一种捕获ニ氧化碳的方法，所述方法包括进行权利要求1至20所述的方法。35.一种纯化样品的方法，所述方法包括将准备纯化的样品暴露于得自权利要求1至20的叶生物质中。36.根据权利要求35的方法，其中所述纯化过程是去除ー种或多种毒素。37.一种制备药物组合物的方法，所述方法包括配制通过权利要求四至31所述的方法获得的成分和药学上可接受的载体稀释剂、赋形剂或载体。38.ー种医药产品，其包含通过权利要求30至32中任一项所述的方法获得的成分和药学上可接受的载体稀释剂、赋形剂或载体。39.一种制备生物燃料的方法，所述方法包括通过权利要求四至31所述方法获得成分的发酵或酯基转移。40.ー种通过权利要求39所述的方法获得的生物燃料。全文摘要一种用于从未分化植物细胞制备叶生物质的方法，所述方法包括提供未分化细胞；将它们与促进细胞分化为叶组织的试剂接触；和使细胞在临时液体浸渍培养体系中生长。本发明的这种方法可以用于制备多肽和天然药用物质，并且可以用于捕获二氧化碳。一种在体外植物细胞中制备多肽的方法，其包括提供含有叶绿体的未分化植物细胞，该叶绿体携带编码多肽的转基因核酸分子，其中所述植物细胞显示同型异源性；和根据以上的方法使细胞增殖，从而制备含有多肽的叶生物质。文档编号C12N15/82GK102595876SQ201080051277公开日2012年7月18日申请日期2010年8月12日优先权日2009年9月11日发明者F·米舒克斯,J·G·麦卡锡,P·尼克松申请人:帝国创新有限公司