一种氧化型辅酶i的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及辅酶I制备技术领域，尤其涉及一种氧化型辅酶I的制备方法。
【背景技术】
[0002] 辅酶I(NAD)，化学名为烟酰胺腺嘌呤二核甘酸或二磷酸烟苷，在哺乳动物体内存 在氧化型（NAD+)和还原型（NADH)两种状态，是人体氧化还原反应中重要的辅酶。参与各 类细胞功能的新陈代谢，对机体免疫能力有重要作用。在健康状态下，人体内辅酶I浓度稳 定，维持各项细胞正常功能。体内的辅酶I浓度决定了细胞衰老的过程和程度，浓度下降会 加速细胞衰老的过程。
[0003] 辅酶I主要存在于酵母细胞线粒体中，属于胞内酶，且酵母细胞壁厚100_300nm， 细胞壁由外及内分别有甘露聚糖层，蛋白质，葡聚糖层组成，其中占30-40%的葡聚糖是不 溶性聚糖，构成细胞刚性骨架，保持细胞坚韧性和形态。胞内物质难以释放出胞外。想要获 得高产量的NAD+，必须充分提高细胞破碎率，从而使得产物能够释放到细胞外，为后期提取 创造条件。
[0004] 目前，经常使用的破壁方法有温差法和高压均浆法，温差法（热处理法）主要通过 水结冰与加热熔化产生的力以及温度突然变化，破坏细胞组织结构，该方法效果不理想；高 压匀浆法需要高压均质机及大容量高速离心机，其破碎原理为细胞在一系列过程中经历了 高速造成的剪切、碰撞以及由高压到常压的变化从而造成细胞的破碎，该方法生产成本高， 效率低，不适合工业化大生产。由上可知，两种方法均无法满足工业化大生产需要。
【发明内容】
[0005] 基于【背景技术】存在的技术问题，本发明提出了一种氧化型辅酶I的制备方法，本 发明能大大增加酵母细胞的破碎率，原料廉价易得，设备简单，操作方便，适合工业化生产。
[0006] 本发明提出的一种氧化型辅酶I的制备方法，包括如下步骤：破碎酵母细胞和提 取麵+;
[0007] 其中，破碎酵母细胞的具体步骤为：将酵母细胞加入浓度为0.01-0. 12mol/l的盐 酸中浸泡〇. 5-2. 5h后，加热至85-100°C，保温3-8min，加冰块冷却至室温，离心得到清液A; 搅拌12-16h，搅拌过程中加入717#树脂，搅拌结束后过滤得到清液B，其中酵母细胞和盐酸 重量体积比（g/ml)为15-25 :80-400,酵母细胞和717#树脂的重量比为15-25 :45-90。
[0008] 优选地，破碎酵母细胞的具体步骤为：将酵母细胞加入浓度为0.06-0.llmol/1的 盐酸中浸泡0. 7-2h后，加热至90-98°C，保温3-5min，加冰块以10-15°C/min的速度冷却 至室温，以4000-6000rpm的速度进行离心10-20min得到清液A;搅拌13-15h，搅拌过程 中加入717#树脂，搅拌结束后过滤得到清液B，其中酵母细胞和盐酸重量体积比（g/ml)为 18-22 :100-300,酵母细胞和717#树脂的重量比为18-22 :55-70。
[0009] 优选地，破碎酵母细胞的具体步骤为：将酵母细胞加入浓度为0.lmol/1的盐酸中 浸泡lh后，加热至95°C，保温4min，加冰块以13°C/min的速度冷却至室温，5000rpm的速 度进行离心15min得到清液A;搅拌14h，搅拌过程中加入717#树脂，搅拌结束后过滤得到 清液B，其中酵母细胞和盐酸重量体积比（g/ml)为20 :120,酵母细胞和717#树脂的重量比 为 20 :60。
[0010] 优选地，提取NAD+包括如下步骤：酸化，交换，洗脱，去盐，分离，洗脱和收集。
[0011] 优选地，提取NAD+的具体步骤如下：
[0012]S1、酸化：向清液B中加入浓度为5-7mol/l的盐酸调节PH为1. 95-2. 05得到溶液 C；
[0013]S2、交换：将S1中得到的溶液C以15-20ml/min的速度上122#柱，上柱结束后，用 蒸馏水以15-25ml/min的速度洗涤，其中，溶液C与蒸馏水的体积比为1 :2-3;
[0014]S3、洗脱：调节液面距122#柱上层树脂层4-5cm，用浓度为0?3-0. 5mol/l的氨水以 5-7ml/min的速度洗脱，当洗脱液pH= 7-8时，开始收集洗脱液D，其中溶液C的体积与氨 水的总体积的比为1 :2-3;
[0015]S4、去盐：向S3中得到的洗脱液D中加入732#树脂，边加边搅拌，至PH为 4. 95-5. 05,过滤得滤液，用蒸馏水洗涤树脂得洗液，合并滤液和洗液得到溶液E;
[0016]S5、分离：用氨水调节S4中得到溶液E至pH为6. 5-7. 5,室温放置7-8天后，以 3. 5-5ml/min的速度上717#树脂柱，上柱结束后，用40-60ml蒸馏水以5-7ml/min的速度洗 涤；
[0017]S6、洗脱：取浓度为 0? 08-0. 12mol/l氯化钾溶液 50-70ml，以 3. 5-5ml/min的速 度洗脱，收集洗脱液，洗脱液以3. 5-5ml/min的速度上769型炭柱，用20-40ml蒸馏水以 5-7ml/min的速度洗涤后，用混合溶剂以0. 5-lml/min的速度洗脱NAD+，其中，混合溶剂由 醋酸乙酯、丙酮、水和氨水组成；
[0018]S7、收集：收集洗脱液，用5. 7-6. 3mol/l硝酸调节PH至2-3,立即加入以洗脱液 体积份为基准的1-4倍的冷丙酮静置30-50min，去上清液，以2000-4000rpm的速度，离心 2-5min，去上清液，干燥沉淀得到NAD+，其中冷丙酮的温度为-5至-15°C。
[0019] 优选地，S2中，将S1中得到的溶液C以18ml/min的速度上122#柱，上柱结束后， 用蒸馏水以20ml/min的速度洗涤，至流出液呈透明淡黄色。
[0020] 优选地，S6中，混合溶剂中醋酸乙酯、丙酮、水和氨水的体积比为100 :400 :500 :2。
[0021] 优选地，S7中，分步收集洗脱液，用丙酮测试洗脱液有无沉淀，合并有沉淀的洗脱 液，用5. 7-6. 3mol/l硝酸调节PH至2-3,立即加入以有沉淀的洗脱液体积份为基准的2-3 倍的冷丙酮静置35-45min，去上清液，以2500-3500rpm的速度，离心3-4min，去上清液，干 燥得到NAD+，其中冷丙酮的温度为-10至-15°C。
[0022] 上述717#树脂为强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂。
[0023] 上述"上柱"是本专业常用术语，意思为将溶液以一定流速从柱子上端倒入柱子 中。
[0024] 上述S2中122#柱为弱酸性酚醛系阳离子交换树脂。
[0025] 上述S4中732#树脂为强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂。
[0026] 上述S6中769型炭柱为活性炭柱。
[0027] 本发明采用酸-热处理的方法来破碎酵母细胞，条件较温和，对内容物分子破坏 性小，且酸性条件有利于辅酶I的稳定，并可以大大增加酵母细胞的破碎率；使用的酵母、 盐酸均廉价易得，可以降低生产成本；本发明设备简单、操作方便，适合工业化生产，而且相 对于化学合成的方法，更加安全，产品中几乎无毒害化学物质残留。
【具体实施方式】
[0028] 下面，通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。
[0029] 实施例1
[0030] -种氧化型辅酶I的制备方法，包括如下步骤：破碎酵母细胞和提取NAD+;
[0031] 其中，破碎酵母细胞的具体步骤为：将酵母细胞加入浓度为0.Olmol/1的盐酸中 浸泡2. 5h后，加热至85°C，保温8min，加冰块以10°C/min的速度冷却至室温，以4000rpm 的速度进行离心20min得到清液A;搅拌16h，搅拌过程中加入717#树脂，搅拌结束后过滤 得到清液B，其中酵母细胞和盐酸重量体积比（g/ml)为15 :400,酵母细胞和717#树脂的重 量比为15 :45;
[0032] 其中，提取NAD+的具体步骤如下：
[0033]S1、酸化：向清液B中加入浓度为5mol/l的盐酸调节PH为2. 05得到溶液C;
[0034]S2、交换：将S1中得到的溶液C以15ml/min的速度上122#柱，上柱结束后，用蒸 馏水以25ml/min的速度洗涤，其中，溶液C与蒸馏水的体积比为1 :2 ;
[0035]S3、洗脱：调节液面距122#柱上层树脂层4cm，用浓度为0?5mol/l的氨水以5ml/ min的速度洗脱，当洗脱液pH= 8时，开始收集洗脱液D，其中溶液C的体积与氨水的总体 积的比为1 :2;
[0036]S4、去盐：向S3中得到的洗脱液D中加入732#树脂，边加边搅拌，至PH为5. 05,过 滤得滤液，用蒸馏水洗涤树脂得洗液，合并滤液和洗液得到溶液E;
[0037]S5、分离：用氨水调节S4中得到溶液E至pH为6. 5,室温放置8天后，以3. 5ml/ min的速度上717#树脂柱，上柱结束后，用60ml蒸馏水以5ml/min的速度洗涤；
[0038]S6、洗脱：取浓度为0. 08mol/l氯化钾溶液70ml，以3. 5ml/min的速度洗脱，收集 洗脱液，洗脱液以5ml/min的速度上769型炭柱，用20ml蒸馏水以7ml/min的速度洗涤后， 用混合溶剂以0. 5ml/min的速度洗脱NAD+，其中，混合溶剂由醋酸乙酯、丙酮、水和氨水组 成，混合溶剂中醋酸乙酯、丙酮、水和氨水的体积比为100 :400 :500 :2;
[0039]S7、收集：分步收集洗脱液，用丙酮测试洗脱液有无沉淀，合并有沉淀的洗脱液，用 5. 7mol/l硝酸调节PH至3,立即加入以有沉淀的洗脱液体积份为基准的