1倍的冷丙酮静置 50min，去上清液，以2000rpm的速度，离心5min，去上清液，干燥沉淀得到NAD+，其中冷丙酮 的温度为_5°C。
[0040] 实施例2
[0041] -种氧化型辅酶I的制备方法，包括如下步骤：破碎酵母细胞和提取NAD+;
[0042] 其中，破碎酵母细胞的具体步骤为：将酵母细胞加入浓度为0.12mol/l的盐酸中 浸泡0. 5h后，加热至100°C，保温3min，加冰块以15°C/min的速度冷却至室温，以6000rpm 的速度进行离心l〇min得到清液A;搅拌12h，搅拌过程中加入717#树脂，搅拌结束后过滤 得到清液B，其中酵母细胞和盐酸重量体积比（g/ml)为25 :80,酵母细胞和717#树脂的重 量比为25 :90;
[0043] 其中，提取NAD+的具体步骤如下：
[0044] SI、酸化：向清液B中加入浓度为7mol/l的盐酸调节PH为1. 95得到溶液C;
[0045]S2、交换：将S1中得到的溶液C以20ml/min的速度上122#柱，上柱结束后，用蒸 馏水以15ml/min的速度洗涤，其中，溶液C与蒸馏水的体积比为1 :3;
[0046] S3、洗脱：调节液面距122#柱上层树脂层5cm，用浓度为0? 3mol/l的氨水以7ml/ min的速度洗脱，当洗脱液pH= 7时，开始收集洗脱液D，其中溶液C的体积与氨水的总体 积的比为1 :3 ;
[0047]S4、去盐：向S3中得到的洗脱液D中加入732#树脂，边加边搅拌，至PH为4. 95,过 滤得滤液，用蒸馏水洗涤树脂得洗液，合并滤液和洗液得到溶液E;
[0048]S5、分离：用氨水调节S4中得到溶液E至pH为7. 5,室温放置7天后，以5ml/min 的速度上717#树脂柱，上柱结束后，用40ml蒸馏水以7ml/min的速度洗涤；
[0049]S6、洗脱：取浓度为0.12mol/l氯化钾溶液50ml，以5ml/min的速度洗脱，收集洗 脱液，洗脱液以3. 5ml/min的速度上769型炭柱，用40ml蒸馏水以5ml/min的速度洗涤后， 用混合溶剂以lml/min的速度洗脱NAD+，其中，混合溶剂由醋酸乙酯、丙酮、水和氨水组成， 混合溶剂中醋酸乙酯、丙酮、水和氨水的体积比为100 :400 :500 :2;
[0050] S7、收集：分步收集洗脱液，用丙酮测试洗脱液有无沉淀，合并有沉淀的洗脱液，用 6. 3mol/l硝酸调节PH至2,立即加入以有沉淀的洗脱液体积份为基准的4倍的冷丙酮静置 30min，去上清液，以4000rpm的速度，离心2min，去上清液，干燥沉淀得到NAD+，其中冷丙酮 的温度为-15°C。
[0051] 实施例3
[0052] -种氧化型辅酶I的制备方法，包括如下步骤：破碎酵母细胞和提取NAD+;
[0053] 其中，破碎酵母细胞的具体步骤为：将酵母细胞加入浓度为0.llmol/1的盐酸中 浸泡0. 7h后，加热至98°C，保温7min，加冰块以12°C/min的速度冷却至室温，以5500rpm 的速度进行离心18min得到清液A;搅拌13h，搅拌过程中加入717#树脂，搅拌结束后过滤 得到清液B，其中酵母细胞和盐酸重量体积比（g/ml)为22 :100,酵母细胞和717#树脂的重 量比为22 :70;
[0054] 其中，提取NAD+的具体步骤如下：
[0055]S1、酸化：向清液B中加入浓度为6. 5mol/l的盐酸调节PH为1. 98得到溶液C;
[0056]S2、交换：将S1中得到的溶液C以19ml/min的速度上122#柱，上柱结束后，用蒸 馏水以18ml/min的速度洗涤，其中，溶液C与蒸馏水的体积比为1 :2. 8;
[0057]S3、洗脱：调节液面距122#柱上层树脂层4. 8cm，用浓度为0?35mol/l的氨水以 6. 5ml/min的速度洗脱，当洗脱液pH= 7. 3时，开始收集洗脱液D，其中溶液C的体积与氨 水的总体积的比为1 :2. 8;
[0058]S4、去盐：向S3中得到的洗脱液D中加入732#树脂，边加边搅拌，至PH为4. 97,过 滤得滤液，用蒸馏水洗涤树脂得洗液，合并滤液和洗液得到溶液E;
[0059]S5、分离：用氨水调节S4中得到溶液E至pH为7. 2,室温放置7天后，以4. 5ml/ min的速度上717#树脂柱，上柱结束后，用45ml蒸馏水以6. 5ml/min的速度洗涤；
[0060]S6、洗脱：取浓度为0.09mol/l氯化钾溶液55ml，以4. 5ml/min的速度洗脱，收集 洗脱液，洗脱液以4ml/min的速度上769型炭柱，用35ml蒸馏水以5. 5ml/min的速度洗涤 后，用混合溶剂以〇.9ml/min的速度洗脱NAD+，其中，混合溶剂由醋酸乙酯、丙酮、水和氨水 组成，混合溶剂中醋酸乙酯、丙酮、水和氨水的体积比为100 :400 :500 :2;
[0061] S7、收集：分步收集洗脱液，用丙酮测试洗脱液有无沉淀，合并有沉淀的洗脱液，用 5. 8mol/l硝酸调节PH至2. 3,立即加入以有沉淀的洗脱液体积份为基准的3倍的冷丙酮静 置35min，去上清液，以3500rpm的速度，离心3min，去上清液，干燥得到NAD+，其中冷丙酮的 温度为-12°C。
[0062] 实施例4
[0063] -种氧化型辅酶I的制备方法，包括如下步骤：破碎酵母细胞和提取NAD+;
[0064] 其中，破碎酵母细胞的具体步骤为：将酵母细胞加入浓度为0.06mol/l的盐酸中 浸泡2h后，加热至90°C，保温5min，加冰块以14°C/min的速度冷却至室温，以4500rpm的 速度进行离心15min得到清液A;搅拌15h，搅拌过程中加入717#树脂，搅拌结束后过滤得 到清液B，其中酵母细胞和盐酸重量体积比（g/ml)为18 :300,酵母细胞和717#树脂的重量 比为18 :55;
[0065] 其中，提取NAD+的具体步骤如下：
[0066]S1、酸化：向清液B中加入浓度为5-7mol/l的盐酸调节PH为2. 02得到溶液C;
[0067]S2、交换：将S1中得到的溶液C以16ml/min的速度上122#柱，上柱结束后，用蒸 馏水以22ml/min的速度洗涤，其中，溶液C与蒸馏水的体积比为1 :2. 2;
[0068]S3、洗脱：调节液面距122#柱上层树脂层4. 2cm，用浓度为0?45mol/l的氨水以 5. 5ml/min的速度洗脱，当洗脱液pH= 7. 7时，开始收集洗脱液D，其中溶液C的体积与氨 水的总体积的比为1 :2. 2;
[0069]S4、去盐：向S3中得到的洗脱液D中加入732#树脂，边加边搅拌，至PH为5. 03,过 滤得滤液，用蒸馏水洗涤树脂得洗液，合并滤液和洗液得到溶液E;
[0070]S5、分离：用氨水调节S4中得到溶液E至pH为6. 7,室温放置8天后，以4ml/min 的速度上717#树脂柱，上柱结束后，用55ml蒸馏水以5. 5ml/min的速度洗涤；
[0071]S6、洗脱：取浓度为0.llmol/1氯化钾溶液65ml，以4ml/min的速度洗脱，收集洗 脱液，洗脱液以4. 5ml/min的速度上769型炭柱，用25ml蒸馏水以6. 5ml/min的速度洗涤 后，用混合溶剂以〇.7ml/min的速度洗脱NAD+，其中，混合溶剂由醋酸乙酯、丙酮、水和氨水 组成，混合溶剂中醋酸乙酯、丙酮、水和氨水的体积比为100 :400 :500 :2;
[0072]S7、收集：分步收集洗脱液，用丙酮测试洗脱液有无沉淀，合并有沉淀的洗脱液，用 6. 2mol/l硝酸调节PH至2. 7,立即加入以有沉淀的洗脱液体积份为基准的2倍的冷丙酮静 置45min，去上清液，以2500rpm的速度，离心4min，去上清液，干燥得到NAD+，其中冷丙酮的 温度为-i〇°c。
[0073] 实施例5
[0074] -种氧化型辅酶I的制备方法，包括如下步骤：破碎酵母细胞和提取NAD+;
[0075] 其中，破碎酵母细胞的具体步骤为：将20g酵母细胞加入浓度为0.lmol/1的 120ml盐酸中浸泡lh后，加热至95°C，保温4min，加冰块以13°C/min的速度冷却至室温， 以5000rpm的速度进行离心lOmin得到清液A;搅拌14h，搅拌过程中加入60g的717#树脂， 搅拌结束后过滤得到清液B;
[0076] 其中，提取NAD+的具体步骤如下：
[0077]S1、酸化：向清液B中加入浓度为6mol/l的盐酸调节PH为2得到溶液C;
[0078]S2、交换：将S1中得到的溶液C以18ml/min的速度上122#柱，上柱结束后，用蒸 馏水以20ml/min的速度洗涤，其中，溶液C与蒸馏水的体积比为1 :2. 5;
[0079]S3、洗脱：调节液面距122#柱上层树脂层4. 5cm，用浓度为0.4mol/l的氨水以6ml/ min的速度洗脱，当洗脱液pH= 7. 5时，开始收集洗脱液D，其中溶液C的体积与氨水的总 体积的比为1 :2. 5 ;
[0080]S4、去盐：向S3中得到的洗脱液D中加入732#树脂，边加边搅拌，至PH为5,过滤 得滤液，用蒸馏水洗涤树脂得洗液，合并滤液和洗液得到溶液E;
[0081]S5、分离：用氨水调节S4中得到溶液E至pH为7,室温放置7天后，以4. 2ml/min 的速度上717#树脂柱，上柱结束后，用50ml蒸馏水以6ml/min的速度洗涤；
[0082]S6、洗脱：取浓度为0.lmol/1氯化钾溶液60ml，以4. 3