ml/min的速度洗脱，收集洗 脱液，洗脱液以4. 2ml/min的速度上769型炭柱，用30ml蒸馏水以6ml/min的速度洗涤后， 用混合溶剂以lml/min的速度洗脱NAD+，其中，混合溶剂由醋酸乙酯、丙酮、水和氨水组成， 混合溶剂中醋酸乙酯、丙酮、水和氨水的体积比为100 :400 :500 :2;
[0083]S7、收集：分步收集洗脱液，用丙酮测试洗脱液有无沉淀，合并有沉淀的洗脱液，用 6mol/l硝酸调节PH至2. 5,立即加入以有沉淀的洗脱液体积份为基准的4倍的冷丙酮静置 30min，去上清液，以3000rpm的速度，离心2min，去上清液，干燥沉淀得到NAD+，其中冷丙酮 的温度为-15°C。
[0084] 实施例6
[0085] -种氧化型辅酶I的制备方法，包括如下步骤：破碎酵母细胞和提取NAD+;
[0086] 其中，破碎酵母细胞的具体步骤为：将20g酵母细胞加入浓度为0.lmol/1的 240ml盐酸中浸泡lh后，加热至95°C，保温4min，加冰块以13°C/min的速度冷却至室温， 以5000rpm的速度进行离心lOmin得到清液A;搅拌14h，搅拌过程中加入60g的717#树脂， 搅拌结束后过滤得到清液B;
[0087] 其中，提取NAD+的具体步骤同实施例5。
[0088] 实施例7
[0089] -种氧化型辅酶I的制备方法，包括如下步骤：破碎酵母细胞和提取NAD+;
[0090] 其中，破碎酵母细胞的具体步骤为：将20g酵母细胞加入浓度为0.lmol/1的 400ml盐酸中浸泡lh后，加热至95°C，保温4min，加冰块以13°C/min的速度冷却至室温， 以5000rpm的速度进行离心lOmin得到清液A;搅拌14h，搅拌过程中加入60g的717#树脂， 搅拌结束后过滤得到清液B;
[0091] 其中，提取NAD+的具体步骤同实施例5。
[0092] 实施例8
[0093] -种氧化型辅酶I的制备方法，包括如下步骤：破碎酵母细胞和提取NAD+;
[0094] 其中，破碎酵母细胞的具体步骤为：将20g酵母细胞加入浓度为0.lmol/1的 240ml盐酸中浸泡2h后，加热至95°C，保温4min，加冰块以13°C/min的速度冷却至室温， 以5000rpm的速度进行离心lOmin得到清液A;搅拌14h，搅拌过程中加入60g的717#树脂， 搅拌结束后过滤得到清液B;
[0095] 其中，提取NAD+的具体步骤同实施例5。
[0096] 试验例1
[0097] 用高效液相色谱，根据外标法测定实施例5-8中，lg酵母细胞所含的辅酶I的重 量，并与用热处理法制备得到的辅酶I作比较。
[0098] 热处理法制备清液a的方法为：将20g酵母细胞加入到20g纯化水中，加热至 95°C，保温5min，加冰块以13°C/min的速度冷却至室温，以5000rpm的速度进行离心lOmin 得到清液a。
[0099] 高效液相色谱检测条件如下：
[0100] 流动相：缓冲盐（25mmol/l三乙胺，磷酸调PH至6. 0):乙腈=95:5(v/v)
[0101]固定相：5C18-MS-II，4.6IDX250mm
[0102] 流速=1.Oml/min，柱温=25°C，检测波长=254nm，进样量=20y1
[0103] 溶液配制如下：
[0104] 标准品溶液：精密称取辅酶I标准品0.lg加1L水制得。
[0105] 供试品溶液5、6、7、8 :依次取实施例5-8的离心清液A各2ml过滤得。
[0106] 供试品溶液9 :用热处理法制备得到清液a，取清液a2ml过滤得。
[0107] 分别精密移取上述标准品溶液、供试品溶液5、6、7、8、9,依次进样，记录色谱图 20min，按峰面积以外标法计算，计算公式如下：
[0108]
[0109] 测试结果如下：
[0110]
[0111] 上述计算公式和表格中"清液A总量"，对于供试品溶液9来说，表示的是"清液a 总量"。
[0112] 由上表可知，本发明得到的辅酶I高于热处理法得到的辅酶I，本发明可以增加酵 母细胞的破碎率。
[0113] 以上所述，仅为本发明较佳的【具体实施方式】，但本发明的保护范围并不局限于此， 任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其 发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种氧化型辅酶I的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：破碎酵母细胞和提取 NAD+; 其中，破碎酵母细胞的具体步骤为：将酵母细胞加入浓度为0. 01-0. 12mol/l的盐酸中 浸泡0. 5-2. 5h后，加热至85-100°C，保温3-8min，加冰块冷却至室温，离心得到清液A ;搅 拌12-16h，搅拌过程中加入717#树脂，搅拌结束后过滤得到清液B，其中酵母细胞和盐酸重 量体积比（g/ml)为15-25 :80-400,酵母细胞和717#树脂的重量比为15-25 :45-90。2. 根据权利要求1所述氧化型辅酶I的制备方法，其特征在于，破碎酵母细胞的具体步 骤为：将酵母细胞加入浓度为〇. 06-0. llmol/1的盐酸中浸泡0. 7-2h后，加热至90-98°C， 保温3-5min，加冰块以10-15°C /min的速度冷却至室温，以4000-6000rpm的速度进行离心 10-20min得到清液A ;搅拌13-15h，搅拌过程中加入717#树脂，搅拌结束后过滤得到清液B， 其中酵母细胞和盐酸重量体积比（g/ml)为18-22 :100-300,酵母细胞和717#树脂的重量比 为 18-22 :55-70。3. 根据权利要求1或2项所述氧化型辅酶I的制备方法，其特征在于，提取NAD +包括 如下步骤：酸化，交换，洗脱，去盐，分离，洗脱和收集。4. 根据权利要求1-3任一项所述氧化型辅酶I的制备方法，其特征在于，提取NAD +的 具体步骤如下： 51、 酸化：向清液B中加入浓度为5-7mol/l的盐酸调节PH为1. 95-2. 05得到溶液C ; 52、 交换：将Sl中得到的溶液C以15-20ml/min的速度上122#柱，上柱结束后，用蒸馏 水以15-25ml/min的速度洗涤，其中，溶液C与蒸馏水的体积比为I :2-3 ; 53、 洗脱：调节液面距122#柱上层树脂层4-5cm，用浓度为0? 3-0. 5mol/l的氨水以 5-7ml/min的速度洗脱，当洗脱液pH = 7-8时，开始收集洗脱液D，其中溶液C的体积与氨 水的总体积的比为I :2-3 ; 54、 去盐：向S3中得到的洗脱液D中加入732#树脂，边加边搅拌，至PH为4. 95-5. 05， 过滤得滤液，用蒸馏水洗涤树脂得洗液，合并滤液和洗液得到溶液E ; 55、 分离：用氨水调节S4中得到溶液E至pH为6. 5-7. 5,室温放置7-8天后，以 3. 5-5ml/min的速度上717#树脂柱，上柱结束后，用40-60ml蒸馏水以5-7ml/min的速度洗 涤； 56、 洗脱：取浓度为0. 08-0. 12mol/l氯化钾溶液50-70ml，以3. 5-5ml/min的速度洗 脱，收集洗脱液，洗脱液以3. 5-5ml/min的速度上769型炭柱，用20-40ml蒸馏水以5-7ml/ min的速度洗涤后，用混合溶剂以0. 5-lml/min的速度洗脱NAD+，其中，混合溶剂由醋酸乙 酯、丙酮、水和氨水组成； 57、 收集：收集洗脱液，用5. 7-6. 3mol/l硝酸调节PH至2-3,立即加入以洗脱液体积份 为基准的1-4倍的冷丙酮静置30-50min，去上清液，以2000-4000rpm的速度，离心2-5min， 去上清液，干燥沉淀得到NAD +，其中冷丙酮的温度为-5至-15°C。5. 根据权利要求3或4项所述氧化型辅酶I的制备方法，其特征在于，S2中，将Sl中 得到的溶液C以18ml/min的速度上122#柱，上柱结束后，用蒸馏水以20ml/min的速度洗 涤，至流出液呈透明淡黄色。6. 根据权利要求3或4项所述氧化型辅酶I的制备方法，其特征在于，S6中，混合溶剂 中醋酸乙酯、丙酮、水和氨水的体积比为100 :400 :500 :2。7.根据权利要求3或4项所述氧化型辅酶I的制备方法，其特征在于，S7中，分步收集 洗脱液，用丙酮测试洗脱液有无沉淀，合并有沉淀的洗脱液，用5. 7-6. 3mol/l硝酸调节PH 至2-3,立即加入以有沉淀的洗脱液体积份为基准的2-3倍的冷丙酮静置35-45min，去上 清液，以2500-3500rpm的速度，离心3-4min，去上清液，干燥得到NAD +，其中冷丙酮的温度 为-10 至-15°C。
【专利摘要】本发明公开了一种氧化型辅酶I的制备方法，包括如下步骤：破碎酵母细胞和提取NAD+；其中，破碎酵母细胞的具体步骤为：将酵母加入盐酸中浸泡后，加热、保温、加冰块冷却至室温，离心得到清液A；搅拌12-16h，搅拌过程中加入717#树脂，搅拌结束后过滤得到清液B；提取NAD+包括如下步骤：酸化，交换，洗脱，去盐，分离，洗脱和收集。本发明能大大增加酵母细胞的破碎率，原料廉价易得，设备简单，操作方便，适合工业化生产。
【IPC分类】C07H1/08, C07H19/207
【公开号】CN105131065
【申请号】CN201510423667
【发明人】王康林, 杨杨, 金永红
【申请人】合肥平光制药有限公司
【公开日】2015年12月9日
【申请日】2015年7月16日