花生Δ9-硬脂酰-ACP脱氢酶AhSAD启动子及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及植物基因工程和生物技术领域，具体涉及一种花生启动子(命 名为及制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 植物启动子在基因的表达调控中起着关键作用。基因表达调控是多种因素综合作 用的结果。一般按照一个事件的先后顺序，基因的调控分为转录水平调控、翻译水平调控以 及蛋白质加工水平调控等。基因编码的蛋白质和RNA及其次级代谢产物对于维持生物体的 整个生命活动极其重要。任何基因表达调控的错误都会对生命造成严重后果。因此，对于 基因表达调控的机理研宄一直是分子生物学研宄的热点。转录水平的调控最为重要。启动 子是转录水平调控的重要元件，也是基因工程表达载体的一个重要组成部分。在某种程度 上，启动子决定了基因表达的时空顺序以及表达强度。所以，研宄启动子的功能序列对于基 因表达调控机制以及日渐成熟的植物基因工程具有非常重要的意义。
[0003] 启动子在构建能够高水平表达异源表达载体的过程中起到关键作用，它决定了外 源基因的转录效率和基因的表达水平。植物转基因育种所用的启动子可分为组成型启动 子、组织特异性启动子和诱导型启动子3类。组成型启动子驱动的外源基因在转基因植株 的所有发育时期和组织中稳定表达。对许多双子叶植物的转化，通常都使用含花椰菜花叶 病毒（CaMV)的35S启动子或胭脂氨酸合成酶nos启动子的质粒载体，而在单子叶植物转化 中最常用的是含有水稻肌动蛋白Act启动子，玉米泛素 Ubi启动子及35S启动子的质粒载 体。但是很多时候外源基因在受体植物中的持续高效表达不仅造成生物体内能源的浪费， 而且在所有组织中的表达有可能对植株本身具有毒害作用，甚至引起转基因安全问题。因 此，组织特异性启动子和诱导型启动子的研宄及应用日益受到育种工作者的重视。
[0004] 在转基因植物中鉴定的诱导型启动子包括热激启动子，来源于菠菜硝酸还原酶的 诱导型启动子等。但是诱导型启动子的应用也具有一定限制，对受体植物进行的外在条件 处理，如热激、激素处理等可能引起生物体内一系列的生理生化反应而不利于植株的正常 生长，而且化学调控系统中用作诱导物的甲基脱氢皮质醇（dex, dexamethasone)、雌二醇 (estradiol)和四环素（tetracycline)都对生态环境有害，不宜用于生产实践。而使用 植物体内本身的组织特异性启动子就可以避免这种问题。显然，外源基因的组织特异性表 达必将有效提高转基因作物的生物安全性。近年来在这方面已经取得很大成就，在不同组 织中特异性表达的各类启动子已不断得到研宄。
[0005] 花生是世界范围内广泛栽培的油料作物，是重要的油脂来源。花生油含有不饱和 脂肪酸以及多种营养保健成份，是许多固定消费人群的主要食用油。近年来我国花生生产 取得了长足发展，已经是世界上最大的花生生产国，但是目前中国花生油市场的供给量不 能满足花生油的需求量，因此加强花生育种研宄，提高花生产量对国家的食用油供给安全 具有重要的现实意义。随着转基因技术的日益成熟，转基因花生研宄必然在花生高产、高 抗、品质改良等方面发挥越来越重要的作用，也是实现花生高产、高抗品质改良的重要手 段。克隆并鉴定高效花生启动子是花生转基因研宄的重要内容。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的：在于提供一种花生启动子，该启动子能够精确定位所调控的 基因，驱动目的基因在转基因植物的特定组织或时期表达，避免造成植物自身能源和物质 的浪费，提高外源基因在转基因植物中的表达效率，限制其表达部位，可应用于植物的基因 工程研宄和花生的安全转基因研宄。
[0007] 本发明的另一个目的：在于提供一种花生Pu启动子的制备方法，该方法通过对 花生基因组进行基因组步移，获得花生启动子序列，方法操作简单，结果稳定可靠。
[0008] 本发明的再一个目的：在于提供一种含有植物高效表达启动子的重组载体，其含 有所述的启动子核苷酸序列。该载体大小适合，在植物中易于转化，所带有的标记基因 表达强度高，容易检测；通过这个载体转化拟南芥可以获得基因在植物中高效表达的 拟南芥转基因植株。
[0009] 本发明还有一个目的：在于提供一种花生启动子产n在根部、茎部、叶片、果针及 种子中的应用。花生启动子的功能能够反映花生因的功能，即在发育过程中 具有重要功能；在该启动子的驱动下，目的基因主要在植株的根部、茎部、叶片、果针及种子 中精细表达。这一启动子在植物抗病、抗倒伏、提高光合作用、含油量、抗逆等基因工程中具 有应用价值。
[0010] 为了完成上述目的，本发明采用如下技术方案： 一种分离的花生启动子Pu，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。
[0011] 花生启动子的制备方法，包括以下步骤： (1) 花生启动子的引物序列： APl :5' - GTAATACGACTCACTATAGGGC - 3' ； GSPl :5' - CCATGCGGAACCTTGGAGATCTGAGG - 3' ； ΑΡ2 :5' - ACTATAGGGCACGCGTGGT - 3' ； GSP2 :5, - GAAGGGTTAGGGTTCAGCCTCAGAGCCAT - 3，； (2) 花生启动子Pakw制备的步骤： 根据基因组步移试剂盒说明，取5 μ L花生的DNA，用Cra I酶切，反应体系如下：DNA 5 yL，价al 1.6yL，10Xbuffer2 yL，用无菌水补齐至20 yL，37°C过夜，用质量体积 比为1 %的琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果； 分别用产生平末端的限制性内切酶jral、feo/tV、A^II、和Aal在100 μ L体 系内酶切2.0-3.0 yg的基因组DNA，反应体系如下：DNA2.5 yg，限制性内切酶8 yL， IOXbuffer 10 yL，无菌水补齐至 100 yL，37°C过夜； 酶切完成后进行纯化，纯化步骤如下：向酶切液中加入10 UL的3M醋酸钠和50 yL 体积比为95%的乙醇溶液，-20°C沉淀3h，然后12000 rpm离心15 min，用体积比70%的乙 醇洗绦两遍，12000 rpm离心5 min，室温下瞭干，用20 μ L无菌水溶解； 纯化完成后加入试剂盒提供的特异性接头Genome Walker Adaptor，反应体系如下： 10 X T4 ligase buffer 2.0 μ L，酶切处理的 DNA 8.0 μ L，T4 Iigase 1 μ L，特异性接头 Genome Walker Adaptor 14.0 μ L，无菌水补至20 μ L，16°C过夜，将连接液用双蒸水稀释 10倍，保存于_20°C ;由此建立五种经限制性内切酶处理并连有特异性接头的DNA库； 以建立的经五种限制性内切酶处理并连有特异性接头的DNA库为模板，进行两轮PCR 反应，第一轮PCR反应以GSPl和APl为引物，体系如下：10Xbuffer 5 yL，10mM的dNTPs mixture 1.0 yL，10 μΜ的 GSPl 2.5 yL，10 μΜ的API 2.5 yL，5单位/yL 的Taq 酶 0.2 yL，稀释的DNA库0.1 yL，无菌水补至50 yL;反应程序如下：94°C预变性lmin; 98°C变性10 s，72°C延伸2 min，共7个循环；98°C变性10 s，68°C延伸2 min，共33个循 环；72°C 10 min ; 第二轮PCR反应，以第一轮PCR反应产物的50倍稀释液作为模板，以GSP2和AP2为引 物进行扩增，反应体系如下：l〇Xbuffer 5 yL，10mM 的 dNTPs mixture LO yL，10 μΜ 的GSP2 2.5 yL，10 μΜ的ΑΡ2 2.5 yL，5单位/yL的Taq酶0.2 yL，稀释模板溶液 1.0 μ L，无菌水补至50 μ L，反应程序同第一轮PCR，完成后回收纯化第二轮PCR产物，并 与T载体连接，经测序获得含/^^全长序列的DNA。
[0012] 所述的花生启动子的重组载体PBI-
[0013] 一种花生/V#重组表达载体的构建方法，包括用命/及_ I双酶切连接有 /V#的PMD18- PBI121质粒，凝胶回收酶切下来的启动子片段和PBI121片段，连接 转化大肠杆菌，构建成植物表达载体
[0014] 所述的花生启动子在根部、茎部、叶片、果针和种子中的应用。
[0015] 本发明的积极有益效果(优点）： 1、本发明提供一种花生启动子，该启动子能够精确定位所调控的基因，驱动目的 基因在转基因植物的特定组织或时期表达，避免造成植物自身能源和物质的浪费，提高外 源基因在转基因植物中的表达效率，限制其表达部位，可应用于植物基因工程研宄和花生 的安全转基因研宄中。
[0016] 2、本发明所提供的启动子克隆方法克隆到的启动子，能够通过对基因的调控 和组化分析，获得具有组织特异性