表达功能的花生启动子。
[0017] 3、本发明克隆到花生来源的从花生食用油安全性和利用转基因提高作物抗 病、抗倒伏、抗逆、提高光合作用、含油量，提高作物品质，人工创建种质资源等方面来考虑， 这种启动子具有应用潜力。花生启动子的功能能够反映花生因的功能，即在 发育过程中具有重要功能；在该启动子的驱动下，目的基因主要在植株的根部、茎部、叶片、 果针及种子中精细表达。这一启动子在植物抗病、抗倒伏、提高光合作用、含油量、抗逆等基 因工程中具有应用价值。
[0018] 4、通过转基因实验证明，本发明的启动子在根部、叶片、茎部、果针、种子中具有高 强度驱动基因的表达特性，可以用此启动子来代替CaMV35S强启动子来启动与抗病、抗 逆、抗倒伏等基因的表达，以改良作物品质，改良食用油营养成份等。如利用该启动子驱动 和根发育相关的基因，使该基因在根中过量表达，改良根的品质，使根部更加强壮，拥有更 强的吸收能力，提高植物的抗旱、抗倒伏、耐盐碱性能力。利用该启动子驱动和茎发育相关 的基因，使得该基因在茎中过量表达，改良茎的品质，提高茎的强度，使得植物具有更强的 抗倒伏、抗病能力。利用该启动子驱动和叶片发育相关的基因，使得该基因在叶片中过量表 达，改良叶片的品质，提高光合效率，提高叶片产量，从而提高作物产量、抗病虫害能力等。 利用该启动子驱动和种子营养成份发育相关的基因，使得该基因在种子中过量表达，人工 创造更适合人类、动物健康或更易于保存的食用油。
[0019] 5、本发明的花生启动子的制备方法，采用特定的引物，对花生基因组进 行基因组步移，获得了花生启动子序列，操作简单，结果稳定可靠。
[0020] 6、本发明的含有植物高效表达启动子的重组载体，含有所述启动子核苷酸序列， 载体大小适合，在植物中易于转化，所带有的标记基因表达强度高，容易检测；通过该 载体转化拟南芥可以获得基因在植物中高效表达的拟南芥转基因植株。
【附图说明】
[0021] 图1为一种基因组步移扩增片段的电泳图。
[0022] 泳道1、2、3、4、5分别代表经价a I、feoW、II、汾? I和5)胳I酶切后形成 的五个基因组DNA "库"中的PCR扩增结果；泳道M代表DL2000的核酸Marker。
[0023] 图2为一种必说遽因的5'RACE电泳图。
[0024] 泳道 1 代表 5'RACE ;泳道 M 代表 500 bp ladder 的核酸 Marker。
[0025] 图3为一种构建的体策略示意图。
[0026] 图4为一种转化载体ρΒΙ-/^^的部分转基因植株PCR鉴定图。
[0027] 泳道M代表DL2000的核酸Marker ;泳道P代表pBI-ZV如阳性质粒的PCR扩增结 果；泳道CK代表野生型拟南芥PCR扩增结果：泳道1-9转基因拟南芥的PCR扩增结果。
[0028] 图5为一种区动的基因的花生组织化学染色结果。
[0029] △:叶片(兰色）；8:茎(兰色）;(：：果针(兰色）;0:根(兰色）出 ：种子(兰色）;？：子叶 (兰色)。
[0030] 图6为一种驱动的基因转基因拟南芥的组织化学染色结果。
[0031] A:1日苗(无色）；B:7日苗(兰色）；C:15日苗(兰色）；D:根(兰色）；E茎(兰色）； F :种子(兰色）；Bar =0· 5 mm〇
【具体实施方式】
[0032] 根据以下实施例，可以更好的理解本发明，但以下实施例并不表示对本发明的任 何限制。
[0033] 实施例1 :一种花生动子的制备方法 本发明所用花生Ajpogeae L.)，供试材料播种于大田，正常田间管理。
[0034] 1.花生启动子的制备： 利用十二烷基硫酸钠（SDS)裂解法提取花生的DNA (J.萨姆布鲁克.D.W.拉塞尔 著，黄培堂等译分子克隆试验指南(第三版）科学出版社)，按照基因组步移试剂盒（Genome Walker? Universal kit，Clontech公司生产，货号：638904)操作程序，进行基因组步移，步 移进行两轮PCR扩增，克隆获得花生/^^启动子（718bp)。步移所用引物如表1。
[0035] 表1基因组步移克隆?所用引物
花生启动子的制备具体步骤如下： 根据基因组步移试剂盒（Genome Walker? Universal kit，CLONTECH公司生产，货号： 638904)说明，略有改动，分别用产生平末端的限制性内切酶II 和I在100 yL体系内酶切大约2.5 yg的基因组DNA，建立四个经限制性内切酶处理 的、连接有特异性接头（Genome Walker Adaptor)(试剂盒内提供）的DNA的"库"，以其为 模板进行两轮PCR反应。取I yL DNA (1 μ g/yL)用酶切，检测其纯度。
[0036] 体系如下：DNA 5 μ L，/?? I (10 单位 / μ L) 1. 6 μ L，10 Xbuffer 2 μ L，无菌水 补齐至20 yL。37°C，过夜，用1%的(质量体积比，以下相同）琼脂糖凝胶电泳检测酶切效 果；之后分别用价a I、feoW、II、I和5)胳I五种内切酶分别酶切DNA，反应体 系如下：DNA (0.1 yg/yL)25 yL，内切酶（10 单位/yL)8 yL，IOXbuffer 10 yL，用 无菌水补齐至100 uL，37°C过夜。
[0037] 向酶切液中加入10 yL的3M醋酸钠和50 yL 95% (体积比，以下相同）的乙 醇，-20°C沉淀3小时以上，然后12000 rpm离心5分钟，去上清，用70%的乙醇洗涤沉淀两 遍，12000 rpm离心5分钟，室温下（20-25°C )晾干，用20 μ L无菌水溶解晾干的DNA。
[0038] 特异性接头连接的反应体系如下：IOX Τ4连接酶buffer 2.0 μ L，酶切处理的 DNA8.0 yL，T4连接酶（1单位/yL)l yL，ADl (接头引物，试剂盒自带）（25 μΜ)4·0 μ L，无菌水补至20 μ L，16°C过夜，完成经限制性内切酶处理并连有特异性接头的DNA库 的构建。将连有特异性接头的DNA库用双蒸水稀释10倍，保存于-20°C。 以基因组步移特异性引物GSPl (表1)进行第一轮PCR反应，体系如下：10Xbuffer (不含 MgCl2)5 yL，dNTPs mixture (IOmM) 1.0 yL，GSPl (10 μΜ) 2.5 yL，API (10 μ M) 2.5 μ L，Taq酶（5单位/μ L) 0.2 μ L，稀释后的连接液0.1 μ L，无菌水补至50 UL。反应程序如下：94°C变性I min;98°C变性10 s，72°C延伸2 min，7个循环；98°C 变性 10 s，68°C延伸 2 min，33 个循环；72°C 10 min。
[0039] 用双蒸水50倍稀释第一轮的PCR反应产物作为第二轮PCR反应的模板，以基因组 步移特异性引物GSP2 (表1)进行第二轮PCR反应，反应体系如下：10 Xbuffer (不含MgCl2) 5 yL，dNTPsmixture (IOmM) 1.0 yL，GSP2 (10 μΜ) 2.5 yL，特异性接头（Genome Walker Adaptor，试剂盒内提供）（10 μ Μ) 2.5 μ L，Taq 聚合酶（5 单位/μ L) 0.2 μ L， 模板溶液1.0 μ L，无菌水补至50 μ L。反应程序同第一轮PCR反应，PCR扩增结果如图1。 回收纯化第二轮PCR产物，并连接到测序T-vector载体(购自TaKaRa公司，以下相同）上， 转化大肠杆菌感受态(购自大连宝生物工程有限公司，以下相同)，并测序。
[0040] 根据 RACE 试剂盒（SMART? RACE cDNA Amplification Kit，购自 Clontech 公司， 货号：634941)操作说明，以花生叶片RNA为模版合成第一链cDNA，步骤如下：1. 0-2. 75 μ L RNA，1.0 yL 5'CDS Primer Α，加 dd H2O 补齐至 3.75 yL，72°C 3 min，42°C 2 min，加 入 I yL SMARTer ΠΑ oligo,加入 5.25 yL 混合液（含 5Xfirst_strand buffer 2.0 yL、I. 0 yL DTT、1.0 yL dNTPs mixture、。· 25 yL RNase Inhibitor 以及 1.0 yL SMARTScribe Reverse Transcriptase)，42°C 90 min，72°C 10 min，加入 100 yL EDTA 稀释。以其为模板进行两轮PCR反应，第一轮PCR反应以GSPl和UPM为引物，体系如下： IOXbuffer 5 μ L，