花生二酰甘油酰基转移酶AhDGAT3启动子及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及一种花生二酰甘油酰基转移酶基因 T1J启动子(命名为、制备方法及其在植物基因工程中的应用。
【背景技术】
[0002] 通过转基因手段进行作物品种的选育，其优势在于转基因不受生物体亲缘关系的 限制，理论上讲，用于转化的基因可以来源于任何物种或是人工合成的基因。2014年全球转 基因植物种植面积达到1. 8亿公顷，年增长率在3%_4%之间，目前转基因技术已经成为植物 品种改良的重要手段。
[0003] 在植物转基因中有两个必需元件，分别是启动子和基因。启动子是生物体内的一 段DNA片段，是位于基因转录起始位点上游的顺式调控序列，与反式作用的识别因子结合， 通过RNA聚合酶同反式作用因子相互作用，启动基因的转录。它是调控基因表达过程中的 重要因子，其决定了动植物在发育过程中基因表达的空间、时间及表达强度的特异性。按照 作用方式和功能，启动子可分为组成型、特异性和诱导性启动子，在某些情况下，一类启动 子也会兼有其它类型启动子的特性。
[0004] 启动子在构建能够高水平表达异源表达载体的过程中起到关键作用，它决定了外 源基因的转录效率和基因的表达水平。组成型启动子驱动的外源基因在转基因植株的所 有发育时期和组织中稳定表达。对许多双子叶植物的转化，通常都使用含花椰菜花叶病毒 (CaMV)的35S启动子或胭脂氨酸合成酶nos启动子的质粒载体，而在单子叶植物转化中最 常用的是含有水稻肌动蛋白Act启动子、玉米泛素 Ubi启动子及35S启动子的质粒载体。 但是很多时候外源基因在受体植物中的持续高效表达不仅造成生物体内能源的浪费，而且 在所有组织中的表达有可能对植株本身具有毒害作用，甚至引起转基因安全问题。因此，组 织特异性启动子和诱导性启动子的研宄和应用日益受到育种工作者的重视。
[0005] 组织特异性启动子是指驱动的基因仅在某一特定组织或器官中表达，或者只是在 植物生长发育过程中的某一个特定阶段表达。如根特异性启动子、拟南芥叶片特异性启动 子、番茄果实特异性启动子、水稻花药特异性启动子、胚乳特异性启动子、棉花纤维特异性 启动子等。特异性启动子不仅可以使得外源基因在受体中发挥作用，而且能有效减少对植 物的不利影响。
[0006] 花生是全世界范围内广泛种植的经济和油料作物，花生果仁中含有丰富的脂肪酸 和蛋白，是重要的油脂和蛋白来源。花生油中脂肪酸主要是由不饱和脂肪酸油酸和亚油酸 构成，两者占花生油总脂肪酸含量的80%左右，是一种较为健康的食用油，在世界食用油消 费和休闲食品供应中占据重要地位。随着人民生活水平的提高，花生的营养保健功能日益 受到重视，食品加工占总产量的比例进一步增加。而随着城市化的推进，耕地面积不断减 少，这要求我们需要进一步提高花生的产量和品质。转基因技术的日益成熟为提高花生产 量和品质提供了新的途径，但是面临着转基因的安全风险。在转基因研宄中使用特异性表 达的启动子是解决这一风险的可行性方法。
[0007] 因此，本发明开发了一个花生内源启动子。通过检测该启动子驱动的报告基因 的表达特征，证明启动子驱动的基因在幼嫩种子的胚中表达，而在其它部位并未发现表达。 我们的结果预示着该启动子在转基因植物中具有相当的应用前景。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的：在于提供一种花生二酰甘油酰基转移酶基因启动子。该 启动子的时空表达模式可用于研宄基因的表达形式，优点在于，来源于植物内源的组织特 异性启动子能够精确定位所调控的基因，驱动目的基因在转基因植物的特定组织或时期表 达，避免造成植物自身能源和物质的浪费，提高外源基因在转基因植物中的表达效率，限制 其表达部位，可应用于植物基因工程研宄和花生的转基因研宄。
[0009] 本发明的另一个目的：提供一种花生二酰甘油酰基转移酶基因启动子的 制备方法，通过对花生基因组进行基因组步移，获得花生二酰甘油酰基转移酶基因 启动子。
[0010] 本发明的再一个目的：提供一种含有植物高效表达启动子4???/?勺重组载体， 含有所述的启动子核苷酸序列。通过这个载体转化拟南芥，可以获得基因在植物中高 效表达的拟南芥转基因植株。
[0011] 本发明还有一个目的在于：提供一种花生启动子在幼嫩种子胚中的应用。
[0012] 为了完成上述目的，本发明采用如下技术方案： 一种分离的花生二酰甘油酰基转移酶启动子/^?"的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所 不O
[0013] 花生二酰甘油酰基转移酶启动子的制备方法，包括以下步骤： (1) 花生/启动子的引物序列为： APl :5' - GTAATACGACTCACTATAGGGC - 3' ； GSPl :5, - GGGCACGTGACATTCCTTAGAACGGC - 3，； ΑΡ2 :5' - ACTATAGGGCACGCGTGGT - 3' ； GSP2 :5' - GCCTGAAACCTCCATCGTTGATGGTGAG - 3' ； (2) 花生启动子的制备步骤： 根据基因组步移试剂盒（Genome Walker? Universal kit，CL0NTECH公司生产， 货号：638904)说明，取5 μL花生的DNA，用价al酶切，反应体系如下：DNA 5 μL， 价a I 1.6 μ 1，10Xbuffer 2 μ 1，用无菌水补齐至20 μ 1，37°C过夜，用质量体积比为1 % 的琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果； 分别用产生平末端的限制性内切酶jral、及^tV、A^II、和在100 μ 1体系 内酶切大约2.5 yg(2.0-3.0 yg)的基因组DNA，反应体系如下：DNA2.5 yg，限制性内 切酶8 yl，10Xbufferl0 μL，无菌水补齐至100 yl，37°C过夜； 酶切完成后进行纯化，纯化步骤如下：向酶切液中加入10 μ 1的3Μ醋酸钠和50 μ 1 体积比为95%的乙醇溶液，-20°C下沉淀3h，然后12000转/分钟（rpm)离心15 min，用体 积比70%的乙醇洗绦两遍，12000 rpm离心5 min，室温下瞭干，用20 μ 1无菌水溶解； 纯化完成后加入特异性接头（Genome Walker Adaptor)(试剂盒内提供)，反应体系如 下：10XT4 ligase buffer 2.0 μ 1，酶切处理的 DNA 8.0 μ 1，T4 ligase 1 μ 1，Genome Walker Adaptor 14.0 μ 1，无菌水补至20 μ 1，16°C过夜，将连接液用双蒸水稀释10倍， 保存于_20°C ;由此建立五种经限制性内切酶处理并连有特异性接头的DNA库； 以建立的经五种限制性内切酶处理并连有特异性接头的DNA库为模板，进行两轮PCR 反应，第一轮PCR反应以GSPl和APl为引物，体系如下：10Xbuffer 5 yl，dNTPs mixture LO μ 1，GSPl 2.5 μ 1，API 2.5 μ 1，Taq 酶 0.2 μ 1，稀释的 DNA 库 0.1 μ 1，无菌水补 至50 μL ;反应程序如下：94°C预变性I min;98°C变性10 s，72°C延伸2 min，共7个循环； 98°C变性 10 s，68°C延伸 2 min，共 33 个循环；72°C 10 min ; 第二轮PCR反应，以第一轮PCR反应产物的50倍稀释液作为模板，以GSP2和AP2为引 物进行扩增，反应体系如下：l〇Xbuffer 5 μ1，10πιΜ 的 dNTPs mixture LO μ1，10 μΜ 的GSP2 2· 5 μ 1，10 μ M的ΑΡ2 2· 5 μ 1，5单位/ μ 1的Taq酶0· 2 μ 1，稀释模板溶液 1.0 μ 1，无菌水补至50 μ 1，反应程序同第一轮PCR，完成后回收纯化第二轮PCR产物，并 与T载体连接，经测序获得含全长序列的DNA。
[0014] 一种表达载体，含有所述的花生二酰甘油酰基转移酶启动子
[0015] 一种花生重组表达载体的构建方法，用命/71 / 双酶切连接有 的PMD18-/^^"和pBI121质粒，凝胶回收酶切下来的启动子片段和pBI121的大片 段，连接转化大肠杆菌，构建成植物表达载体PBI-
[0016] -种宿主菌，含有所述的表达载体pBI-
[0017] 所述的宿主菌为农杆菌ΕΗΑ105。
[0018] 所述的分离的启动子启动下游的目的基因在植物种子幼胚中的应用。
[0019] 本发明的积极有益效果(优点）： 1、本发明开发了一个