6] PCR验证：阳性的Tl代转基因植株种子在MS (前面已述）培养基上播种，4°C放置 3-5天后在植物生长箱中萌发，出苗后分别取1天、5天、10天苗龄幼苗以及根、茎、叶、花、角 果、开花后2天、4天、6天、8天、10天、12天、14天的幼胚进行组织化学染色。
[0057] T2代染色过程如下：将样品浸泡在⑶S染液中真空抽气5分钟，37°C过夜；其中 ⑶S染液的组成为：X-gluc 0. 5 mg/mL，磷酸缓冲液50 mmol/L，铁氰化钾和亚铁氰化钾各 0.5 mmol/T,,EDTA 10 mmol/L,Triton-χ-ΙΟΟ 0. 001%，甲醇20%(体积比）。第二天用酒精-乙 酸溶液(体积比为1:1)进行脱色，直至叶片变白，之后用50%酒精漂洗3-5次，体式显微镜 (OLYMPUS SZX16)拍照。苗期取不同时间段的整个植株；生殖生长期，叶片取嫩叶和成熟叶 片；花取开过的花朵和未开的花蕾的花絮；角果取不同时期的角果，并用解剖针取出种子。 植株被染成蓝色的部位就是基因表达的部位。
[0058] 染色结果发现(表3、图6):在拟南芥的整个生长过程中，只有幼嫩种子的胚(花后 2-4天幼胚）被染成蓝色，在其它组织中未出现蓝色。由此可见，该启动子驱动的基因 主要在幼嫩种子的胚中表达，其它组织中不表达。
[0059] 实验结果表明，花生启动子具有如下生物学功能： 该启动子驱动的基因在拟南芥的幼嫩种子的胚中表达，在其它组织中不表达。 调控下的位《基因具有一定时空表达特性，这说明具有驱动下游报告基因位^ 在受体植物中表达的功能。在该启动子的调控下，基因能够主要在转基因植株的幼嫩 种子的胚中精细表达，而在其它组织中完全不表达(表3、图6)。
[0060] 这一具有组织特异性表达的启动子在植物基因工程和转基因安全(食用、安全性 防控）中具有应用价值。
[0061] 花生动子在幼嫩种子胚中的应用。
[0062] 利用基因组步移法克隆得到花生基因起始密码子ATG 5'上游序列。构 建由该启动子调控的报告基因位《的植物表达载体(前面已述)。采用农杆菌介 导的花期侵染法转化拟南芥，Tl代在加有卡那霉素的MS (前面已述）培养基上初步筛选转 基因植株，当拟南芥长出两片真叶后，移栽到蛭石上继续种植，当植株出现花序后，进行PCR 检测，利用分子手段鉴定阳性株。T2代选择10个转基因拟南芥株系进行⑶S染色。⑶S组 织化学法染色表明，该启动子驱动的基因在拟南芥的幼嫩种子的胚中表达。由此可见， 该启动子驱动的基因具有一定的时空表达特异性，具有驱动下游基因在幼嫩种子的胚 中表达，其它组织中完全不表达（图6)的功能。
[0063] 这一具有组织特异性表达的启动子在植物基因工程和转基因安全(食用）中具有 应用价值，如利用该启动子驱动与改善种子营养或致死相关的目的基因，首先构建/ 驱动目的基因的过表达载体，转化受体植株，则目的基因在启动子的驱动下，在幼嫩 种子的胚中表达，可以提高目的基因在上述组织中的表达量，在其它组织中完全不表达，导 致种子按照设计者的方案增加营养成份或产生种子致死表型，节省了植株的能量，提高了 效率。
[0064] 表3 转基因拟南芥T2代株系的⑶S染色统计表
注：Y表示蓝色，N表示无色。
【主权项】
1. 一种分离的花生二酰甘油酰基转移酶启动子/v*^，其特征是：所述启动子的 核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。2. 权利要求1所述的花生二酰甘油酰基转移酶启动子的制备方法，其特征是： 该方法包括以下步骤： (1) 花生/启动子的引物序列为： APl :5' - GTAATACGACTCACTATAGGGC - 3' ； GSPl :5, - GGGCACGTGACATTCCTTAGAACGGC - 3，； AP2 :5' - ACTATAGGGCACGCGTGGT - 3' ； GSP2 :5' - GCCTGAAACCTCCATCGTTGATGGTGAG - 3' ； (2) 花生启动子的制备步骤： 根据基因组步移试剂盒说明，取5 y 1花生的DNA，用Cra I酶切，反应体系如下：DNA 5 yl，价al 1.6yl，10Xbuffer2 yl，用无菌水补齐至20 yl，37°C过夜，用质量体积 比为1 %的琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果； 分别用产生平末端的限制性内切酶jral、feo/tV、A^II、和Aal在100 y 1体 系内酶切2.0-3.0 yg的基因组DNA，反应体系如下：DNA2.5 yg，限制性内切酶8 yl， IOXbuffer 10 yl，无菌水补齐至 100 yl，37°C过夜； 酶切完成后进行纯化，纯化步骤如下：向酶切液中加入10 Ul的3M醋酸钠和50 yl 体积比为95%的乙醇溶液，-20°C下沉淀3h，然后12000转/分钟（rpm)离心15 min，用体 积比70%的乙醇洗绦两遍，12000 rpm离心5 min，室温下瞭干，用20 y 1无菌水溶解； 纯化完成后加入试剂盒内提供的特异性接头Genome Walker Adaptor，反应体系如 下：IOX T4 ligase buffer 2.0 y 1，酶切处理的 DNA 8.0 y 1，T4 ligase I y 1，Genome Walker Adaptor 14.0 yl，无菌水补至20 yl，16°C过夜，将连接液用双蒸水稀释10倍， 保存于_20°C ;由此建立五种经限制性内切酶处理并连有特异性接头的DNA库； 以建立的经五种限制性内切酶处理并连有特异性接头的DNA库为模板，进行两轮PCR 反应，第一轮PCR反应以GSPl和APl为引物，体系如下：10Xbuffer 5 yl，dNTPs mixture LO yl，GSPl 2.5 yl，API 2.5 yl，Taq 酶 0.2 yl，稀释的 DNA 库 0.1 yl，无菌水补 至50 yl ;反应程序如下：94°C预变性I min;98°C变性10 s，72°C延伸2 min，共7个循环； 98°C变性 10 s，68°C延伸 2 min，共 33 个循环；72°C 10 min ; 第二轮PCR反应，以第一轮PCR反应产物的50倍稀释液作为模板，以GSP2和AP2为引 物进行扩增，反应体系如下：10Xbuffer 5 yl，dNTPs mixture 1.0 yl，GSP2 2.5 yl， AP2 2. 5 yl，Taq酶0. 2 yl，稀释模板溶液1.0 yl，无菌水补至50 yl，反应程序同第 一轮PCR，完成后回收纯化第二轮PCR产物，并与T载体连接，经测序获得含全长序 列的DNA。3. -种表达载体，其特征在于，含有权利要求2所述的分离的花生二酰甘油酰基转移 酶启动子/^?6^73。4. 一种花生重组表达载体的构建方法，其特征在于， 用命/71 /及丽71双酶切连接有的pMD18- 和PBI121质粒，凝胶回收酶 切下来的启动子片段和PBI121的大片段，连接转化大肠杆菌，构建成植物表达载体pBI- PAWGAT3°5. -种宿主菌，其特征在于，含有权利要求3所述的表达载体。6. 根据权利要求5所述的宿主菌，其特征在于，所述的宿主菌为农杆菌EHA105。7. 权利要求书1中所述的分离的启动子启动下游的目的基因在植物种子幼胚 中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种花生二酰甘油酰基转移酶AhDGAT3启动子（PAhDGAT3）的制备方法及其应用。该启动子如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。利用基因组步移方法克隆PAhDGAT3序列，应用SDS裂解法提取基因组DNA，在不同体系中分别用核酸内切酶酶切DNA，和接头片断连接后，以GSP1和AP1为引物进行第一轮PCR扩增，以GSP2和AP2为引物进行第二轮扩增，获得含有PAhDGAT3的DNA序列。该启动子具有驱动外源基因表达的功能，其表达部位在植物幼嫩种子的胚中，是一种组织特异性表达启动子，将其应用于转基因工程中可以驱动目的基因在幼嫩种子胚中表达积累，避免植物代谢过程中造成不必要的浪费，因此该启动子在植物转基因工程中具有良好的应用前景。
【IPC分类】C12N15/84, C12N15/10, C12N15/113, C12N1/21, A01H5/10
【公开号】CN104975026
【申请号】CN201510360374
【发明人】张新友, 石磊, 齐飞艳, 苗利娟, 张忠信, 黄冰艳, 董文召, 汤丰收, 高伟, 藏秀旺, 秦利
【申请人】河南省农业科学院
【公开日】2015年10月14日
【申请日】2015年6月26日