液（含5Xfirst_strand buffer 2.0 μL、1.0 μL DTT、1.0 μL dNTPs mixture、。· 25 μL RNase Inhibitor 以及 1.0 μL SMARTScribe Reverse Transcriptase)，42°C 90 min，72°C 10 min，加入 100 μ I EDTA 稀释。以其为模板进行两轮PCR反应，第一轮PCR反应以GSPl和UPM为引物，体系如下： IOXbuffer 5 μ l，dNTPs mixture 1.0 μ 1，GSPl 2.5 μ 1，UPM 5.0 μ 1，Taq 酶 0.2 μL，稀释的第一链cDNA 2. 5 μL，无菌水补至50 μL。反应程序如下：94°C预变性I min; 98°C变性10 s，72°C延伸2 min，共7个循环；98°C变性10 s，68°C延伸2 min，共33个循 环；72°C 10 min〇
[0045] 第二轮PCR以第一轮PCR反应产物50倍稀释液作为模板，以GSP2和NUP为引物 进行扩增，反应体系如下：10Xbuffer 5 μ 1，dNTPs mixture I. 0 μ 1，GSP2 2. 5 μ 1，NUP 2. 5 μ l，Taq酶0.2 μ 1，稀释模板溶液1.0 μ 1，无菌水补至50 μ 1，反应程序同第一轮 PCR。PCR产物用1.0% (质量体积比，以下相同)琼脂糖凝胶电泳检测，PCR扩增结果如图2。 凝胶回收试剂盒(购自天根生化科技北京有限公司，以下相同)纯化回收后，连接到PMD18-T 载体(购自TaKaRa公司，以下相同)，转化DH5a菌株的感受态细胞(购自大连宝生物工程有 限公司，以下相同)，转化后的感受态均匀涂在氨苄青霉素 LB固体培养基（50 mg/L)上，培 养16小时后挑取阳性菌斑，并在氨苄青霉素 LB液体培养基（50 mg/L)中扩繁，提取质粒并 经酶切验证后测序，获得花生基因起始密码子ATG上游转录区域。经测序后和基 因组步移获得的序列比对，两者完全同源，证明步移获得的序列是J字列。
[0046] 获得/^^"全长序列，命名为，一种分离的启动子，其系列为SEQ ID No. 1 所示的核苷酸序列或与SEQ ID No. 1实质上同源的核苷酸序列。
[0047] 2、重组表达载体的构建和根癌农杆菌菌株EHA105的转化： 构建的重组载体是将质粒ΡΒΙ121 (购自TaKaRa公司）上的35S启动子克隆得到 片段替换而获得。为完成此目的，首先用幻ml /及_71双酶切克隆载体pMD18-/V^ra， 同时用/ 酶切pBI121质粒。
[0048] 酶切反应在37°C培养箱中进行，约4-6个小时之后，用1% (质量体积比)的琼脂糖 胶电泳检测。将克隆载体pMD18-/V^"酶切下的小片段和pBI121 (前面已述）酶切下的大 片段用DNA凝胶回收试剂盒回收。
[0049] 按PMDlS-ZV76^酶切下的小片段和pBI121酶切下的大片段比例（150 ng小片段： 50 ng大片段）=3:1的比例（摩尔浓度比）混合样品，加入T4 DNA连接酶5单位，10X反 应缓冲液2 yL，无菌水补充体积至20 yL，16°C过夜连接。冻融法转化DH5a菌株的感受 态细胞，在含有卡那霉素（50 μ g/mL)的固体LB培养基平板上筛选，挑取正常生长的菌斑 做菌落PCR，挑取阳性菌落提质粒，经酶切验证正确的重组质粒命名为。参见图 4〇
[0050] 利用冻融法将ρΒΙ-Α?^入根癌农杆菌EHA105(购自大连宝生物生物制品有限 公司，以下相同)，用卡那霉素 （50 μ g/mL)和利福平（50 μ g/mL)双抗性平板筛选，挑斑，菌 落PCR检测验证，挑取阳性菌斑，保存菌株，命名为EHA105。
[0051] 其中冻融法步骤如下：（1)取0. 2 ml农杆菌EHA105感受态，于冰水中缓慢融化； (2)加入约2 yg重组质粒DNA，轻轻混匀，冰浴30 min后，投入液氮速冻5 min，然后 37°C水浴5 min,融化细胞；（3)加入800 μ 1不含抗生素 YEP液体培养基，28°C轻摇培养 4-5 h; (4)12000 rpm，30s，去上清，细胞重悬于(λ 2 ml YEP培养基；（5)将培养物均匀涂 布在含利福平（50 mg/L)、庆大霉素（50 mg/L)和卡那霉素（50 mg/L)的琼脂板上，28°C培 养2天，待平板上出现转化子后挑菌进行PCR检测。
[0052] 实施例2 : 植物表达载体ρΒΙ- 在拟南芥中的遗传转化及转基因植 株筛选参照文献中的方法进行拟南芥转化（ZhangX.R, et al. Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method. Nature, 2006，I: 1-6)，操作步骤如下：待野生型拟南芥抽薹后，转化前一天用干净的剪刀剪去已 经发育的角果，并扩增繁殖需要转化的农杆菌200 mL。第二天，室温5000转/分钟离心制备 好的农杆菌，收集菌液，并用5%的蔗糖重新悬浮农杆菌，加入终浓度0. 02%的Silwet L-77。 然后将花序浸入农杆菌菌液15秒，取出后用黑色塑料袋包裹，保湿，第二天后取下塑料袋， 将转化后的拟南芥植株重新放入培养箱，一周后，进行第二次转化，种子成熟后，收集，筛选 阳性苗。制备含有植物表达载体ρΒΙ-Α?,的根癌农杆菌EHA105菌液，在转化拟南芥前一 天，将pBI-ZV^ ΕΗΑ105转入含有卡那霉素50 μ g/ml、利福平50 μ g/ml的LB液体培养 基200 mL中，28°C过夜培养。第二天，用紫外分光光度计（SPEK0L 1300)于276纳米波长下 检测菌液的吸光值，当菌液的吸光值达到1. 6-2. 0之间时取出。室温（20-25 °C，以下相同） 以4000 g离心10 min，弃上清，沉淀悬浮于等体积的5%鹿糖溶液中（质量体积比)。将浑池 的蔗糖溶液倒入培养皿中，转化前加入终浓度为0.02% (体积比）的Silwet L-77 (购自北 京五洲元业科贸中心，以下相同)，混匀。把待转化的拟南芥整个花序轻轻的浸没在蔗糖中， 15秒后取出植株花序，转化后的植株用黑色塑料袋包好，放在植物生长箱中培养，第二天将 塑料袋揭开，隔一周再做一次转化。培养一个月左右收获种子，种子在培养箱或者日光下干 燥3-5天。将转化收获的TO代种子用70% (体积比)酒精和0.01% (质量比）的升汞分别消 毒3分钟和10分钟，然后用蒸馏水洗涤数次（5~7次)，均匀地吹打到含卡那霉素（50 mg/ L) MS固体筛选培养基（MS大量元素母液100 ml ;MS微量元素母液10 ml ;MS有机母液10 ml ;MS铁盐10 ml ;肌醇10 ml ;蔗糖30 g ;用IM氢氧化钠调pH至5. 8,8 g琼脂粉，定容 至I L，高压121°C灭菌后备用。各种母液配方见表2)表面。4°C放置3-5天，放入植物生 长培养箱(光周期16 (白天）/8 (黑暗）小时，温度：白天22°C，暗周期20°C)培养。根据表 达载体上所特有的卡那霉素抗性筛选阳性苗。叶片长到3-4叶时，取少许绿苗叶片，用SDS 方法提取DNA，进行PCR阳性检测。PCR鉴定时，所用引物： AhDGAT3-P-S ：5 ^ -CGGGGTACCATCAATTTGTCTCGATAAATTTTG-3 ;； AhDGAT3-P-A :5 ^ -CGCGGATCCCGTTGATGGTGAGAATTAATTAG-3 ^。
[0053] PCR反应体系如下：基因组DNA模板I yL (约50 ng)、10 X Taq酶反应缓冲液 2 ul、25 HiMMgCL2 1.2 ul、2 mM dNTP 1.5 ul、10 uM 引物各 0.2 ul、0.3 单位 Taq 酶，加 无菌水至20 μ 1。
[0054] 反应程序为：94°C预变性5 min，94°C变性45 s、55°C退火45 s、72°C延伸2 min，32个循环，72°C延伸5 min。用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR反应产物，结果表明 植物表达载体的T-DNA区段已经成功转入拟南芥（图5)。共获得30株阳性苗。
[0055] 表2 MS培养基母液配方
实施例3 :花生启动子的功能分析及其应用 本发明首次克隆得到的序列，并对其进行了功能分析。从实施例2中，拟南芥转 化及PCR检测步骤中筛选得到的阳性苗Tl代，自交收获种子（即Τ2代)。取Τ2代10个株 系的不同时期组织进行⑶S染色。
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