花生内源启动子，通过检测该启动子驱动的报告基因的表达 特征，证明启动子驱动的基因在幼嫩种子的胚中表达，而在其它部位并未发现表达。从改善 种子的营养品质和转基因安全性防控等方面考虑，这种启动子具有应用潜力，预示着该启 动子在转基因植物中具有较好的应用前景。
[0020] 2、本发明所提供的启动子克隆方法克隆到的启动子，能够通过对基因的调控 和组织化学分析，获得具有组织特异性表达功能的花生启动子。
[0021] 3、本发明克隆到花生来源的，用替换PBI121质粒上的CaMV35S启动 子序列，形成重组植物表达载体，其中的基因受的调控。通过转基因 实验证明，该启动子在种子幼嫩胚中高强度驱动基因的表达以及在其它组织中完全不 驱动基因表达的特性，启示申请人可以用此启动子代替CaMV35S强启动子来驱动和种 子发育、改善种子品质或致死相关的基因，使得该基因在种子幼胚中过量表达，人工创造品 质改良品种，丰富种质资源，或提高转基因植物的生物安全性，抑制外源基因的扩散，防止 基因漂流。
[0022] 4、本发明的启动子的制备方法，通过对花生基因组进行基因组步移，获 得花生二酰甘油酰基转移酶基因启动子，该方法操作简单，结果稳定可靠。
[0023] 5、本发明的含有植物高效表达启动子的重组载体，大小适合，在植物中易 于转化，所带有的标记基因表达强度高，容易检测。通过这个载体转化拟南芥，可以获 得基因在植物中高效表达的拟南芥转基因植株。
[0024] 6、本发明的花生启动子可以在幼嫩种子胚中应用。/^^"的功能能够反映 花生基因的功能，即在种子发育过程中具有重要功能；在该启动子的驱动下，目的 基因主要在植株的幼嫩种子胚中表达，而在其它组织中完全不表达。这一具有组织特异性 表达的启动子在植物基因工程和转基因安全(食用，防止外源基因扩散）中具有重要应用价 值。
【附图说明】
[0025] 图1为一种基因组步移扩增片段电泳图。
[0026] 泳道1、2、3、4、5分别为价a I、feoW、II、汾? I和I酶切后形成的5 个基因组DNA "库"中的PCR扩增结果；泳道M代表500 bp ladder的核酸Marker。
[0027] 图2为一种4???B基因的5'RACE电泳图。
[0028] 泳道1代表必5^RACE ;泳道M代表DL2000的核酸Marker。
[0029] 图3为启动子序列顺式作用元件分析。
[0030] 方框代表TATA box (序列为：TATAT)，黑体代表CAAT box (序列为：CAAAT)， 下划线代表ATG上游的转录区域(序列为：AAACCACAGAAGAGAGAAAAGGAGAATTT GGTTCCTAATTAATTCTCACCATCAACG);斜黑体 ATG 代表翻译起始位点。
[0031] 图4为一种构建的ρΒΙ-Α?,载体策略示意图。
[0032] 图5为一种转化载体ρΒΙ-Α?,的部分转基因拟南芥植株PCR鉴定图。
[0033] 泳道M代表500 bp ladder的核酸Marker ;泳道P代表质粒的PCR扩 增结果；泳道CK代表野生型拟南芥的PCR扩增结果；泳道1-13代表部分阳性株的PCR扩增 结果。
[0034] 图6为一种动的基因的组织化学染色结果。
[0035] 图中各小图的含义，A :1日苗(无色）；B :5日苗(无色）；C :10日苗(无色）；D :茎和 茎生叶(无色）；E :花序（无色）；F :开花后2天的幼胚(无色）；G :开花后4天的幼胚(箭头所 示）;H :开花后6天的幼胚(箭头所示）；I :开花后8天的幼胚(无色）;J :开花后10天的幼胚 (无色）;K :开花后12天的幼胚(无色）;L :开花后14天的幼胚(无色）;DPA :表示开花后；Bar =0· 5 mm〇
【具体实施方式】
[0036] 根据以下实施例，可以更好的理解本发明，但以下实施例并不表示对本发明的任 何限制。
[0037] 实施例1 :一种花生Α?,启动子的制备方法，该方法包括以下步骤： 1.花生启动子的制备： 利用十二烷基硫酸钠（SDS)裂解法提取花生的DNA (J.萨姆布鲁克.D.W.拉塞尔 著，黄培堂等译分子克隆试验指南(第三版）科学出版社)，按照基因组步移试剂盒（Genome Walker? Universal kit，Clontech公司生产，货号：638904)操作程序，进行基因组步移，步 移进行两轮PCR扩增，克隆获得花生启动子（2181 bp )。
[0038] 步移所用引物如表1。
[0039] 表1基因组步移克隆用引物
花生制备的具体步骤如下： 根据基因组步移试剂盒（Genome Walker? Universal kit，CLONTECH公司生产，货号： 638904)说明，略有改动，分别用产生平末端的限制性内切酶II 和I在100 μL体系内酶切大约2.5 yg的基因组DNA，建立四个经限制性内切酶处理 的、连接有特异性接头（Genome Walker Adaptor)(试剂盒内提供）的DNA的"库"，以其为 模板进行两轮PCR反应。取1 μL DNA (1 μ g/μ L)用酶切，检测其纯度。
[0040] 体系如下：DNA 5 μ 1，价a I (10 单位/μ 1) 1.6 μ 1，IOXbuffer 2 μ 1，无菌水 补齐至20 μ 1。37°C，过夜，用1%(质量体积比，以下相同)琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果。 之后分别用价a IJra II、I和5)胳I五种内切酶分别酶切DNA，反应体系如 下：DNA (0.1 yg /μ 1)25 μ 1，内切酶（10 单位/μ 1)8 μ 1，IOXbuffer 10 μ 1，无菌水 补齐至100 yl，37°C过夜。
[0041] 向酶切液中加入10 μ 1的3Μ醋酸钠和50 μ 1 95% (体积比，以下相同）的乙 醇，-20°C放置3小时以上，然后12000 rpm离心5分钟，去上清，用70%的乙醇洗涤沉淀两 遍，12000 rpm离心5分钟，室温下（20-25°C )晾干，用20 μ 1无菌水溶解晾干的DNA。
[0042] 特异性接头连接的反应体系如下：10ΧΤ4连接酶buffer 2.0 μ 1，酶切处理的 DNA8.0 μ1，Τ4连接酶（1单位/μ1)1 yl，ADl (接头引物，试剂盒自带）（25 μΜ)4·0 μL，无菌水补至20 yl，16°C过夜。将连接液用双蒸水稀释10倍，保存于-20°C。 以基因组步移特异性引物GSPl (表1)进行第一轮PCR反应，体系如下：10Xbuffer (不含 MgCl2)5 yl，dNTPs mixture (IOmM) 1.0 yl，GSPl (10 μΜ) 2.5 μ1，ΑΡ1 (10 μΜ) 2.5 μL，Taq酶（5单位/μL) 0.2 μL，稀释后的连接液0.1 μL，无菌水补至50 μL。反应程序如下：94°C变性I min;98°C变性10 s，72°C延伸2 min，7个循环；98°C 变性 10 s，68°C延伸 2 min，33 个循环；72°C 10 min。
[0043] 用双蒸水50倍稀释第一轮的PCR反应产物作为第二轮PCR反应的模板，以基因组 步移特异性引物GSP2 (表1)进行第二轮PCR反应，反应体系如下：10 Xbuffer (不含MgCl2) 5 yl，dNTPsmixture (IOmM) 1.0 yl，GSP2 (10 μΜ) 2.5 μL，特异性接头（Genome Walker Adaptor，试剂盒内提供）（10 μΜ) 2.5 yl，Taq 聚合酶（5 单位/μL) 0.2 μL， 模板溶液1.0 μ 1，无菌水补至50 μ 1。反应程序同第一轮PCR反应，PCR扩增结果如图1。 回收纯化第二轮PCR产物，并连接到测序T-vector载体(购自TaKaRa公司，以下相同）上， 转化大肠杆菌感受态(购自大连宝生物工程有限公司，以下相同)，并测序。
[0044] 根据 RACE 试剂盒（SMART? RACE cDNA Amplification Kit，购自 Clontech 公司， 货号：634941)操作说明，以花生幼嫩果仁RNA为模版合成第一链cDNA，步骤如下：1. 0-2. 75 μL RNA，1.0 μL 5ZCDS Primer A，加 dd H2O 补齐至3.75 μ1，72? 3 min，42°C 2 min， 加入 I yl SMARTer IIA oligo,加入 5.25 μL 混合