专利名称：分离的二酰甘油酰基转移酶基因，其表达载体及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于植物基因工程领域，具体涉及转移酶基因、含有该基因的酵母表达载体和植物表达载体，以及这些表达载体的转化体。本发明还涉及上述基因在植物性状改良上的应用。
背景技术：
传统化石能源紧缺，将使生物柴油和燃料乙醇逐步替代石油，发展成为新的基础产业和新的能源产业，以满足人类在后石油时代对液体能源的大量需求。生物柴油是指以 油料作物、野生油料植物和工程微藻等水生植物油脂以及动物油脂、餐饮垃圾油等为原料油通过酯交换工艺制成的可代替石化柴油的再生性柴油燃料，与传统的柴油相比，具有能量密度高、润滑性能好、储运安全、抗爆性好、燃烧充分等优良性能，是最具发展潜力的大宗生物基液体燃料。植物油含有丰富的还原态碳链，是同体积淀粉所含能量的8倍多。植物油不仅是人类营养需求的重要食用油，而且已经成为许多化工产品的重要环保原料，广泛应用于肥皂、清洁剂、润滑剂以及油漆等的生产。更重要的是植物脂肪酸还可作为生物柴油的原料。因此，利用基因工程技术，提高植物或油料作物中油脂含量，不仅对于应对日益严峻的能源形势，舒缓能源消费结构矛盾；同时，对于改善人类使用油的质量，调整农业产业结构和增加农民收入，都具有重大的意义。植物种子中的贮藏物质主要有淀粉、蛋白质和脂类。植物种子中储存的脂肪酸常以三酰甘油酯(TAGs)，即在甘油骨架上附连三个脂肪酸的形式存在。而脂肪酸成分主要是16至18碳或含一至三个双键的脂肪酸，如硬脂酸、油酸、亚油酸和亚麻酸等。脂肪酸代谢主要是在质体和内质网中进行的，首先，合成脂肪酸的碳源主要是蔗糖，在种子中通过糖酵解途径将其转变成己糖，并氧化成乙酰CoA(乙酰辅酶A)。而TAG合成的骨架成分甘油3-磷酸也是通过糖酵解的中间产物合成的。随后，在质体中经乙酰CoA羧化酶(ACC)将乙酰CoA合成为丙二酰单酰CoA。然后脂肪酸合成酶复合物(FAS)以丙二酸单酰CoA为底物进行连续的聚合反应，经过数次循环聚合反应后，脂肪酸的合成可在酰基-ACP硫酯酶或酰基转移酶的作用下终止。而终止聚合后的不同碳链长度的酰基ACP，在酰基CoA合成酶的作用下合成酰基CoA，并从质体转运到内质网或胞质中。最后利用贮存在胞质中的酰基CoA池，在内质网上通过三种不同的酰基转移酶，即甘油3-磷酸酰基转移酶(G3P-AT)、溶磷脂酸酰基转移酶(LPA-AT)和二酸甘油酸基转移酶(acyl CoA diacylglycerol acy I transferase,DGAT),分别在甘油上连接脂肪酸以合成三酰甘油酯和结构磷脂(Cahoon等，Curr OpinPlant Biol. 2007，10 :236_44)。目前的研究证明，要提高种子中的油脂含量，不仅需要增加游离酰基CoA的含量，更重要的是需要增加贮藏型的三酰甘油酯(TAGs)在种子中的含量。前人的研究(Shockey等，Plant Cell 2006，18 =2294-2313 ;Kroon 等，Phytochemistry2006,67 :1166_1176)发现，在发育的种子中，DGAT催化酰基CoA和二酰甘油酯合成TGA的最后一步，虽然对于多种酰基转移酶之间的相互作用不清楚，但DGAT在油脂的合成中为关键限速步骤，直接影响种子中TAG的含量和成分已经明确。已经从蓖麻、拟南芥和花生等植物中克隆了编码DGAT的基因，包括 DGATl 和 DGAT2 以及可溶性的 DGAT3。Jako 等(Plant Physiol 2001，126 861-874)在拟南芥种子中特异超表达DGAT基因，不仅增加了种子重量，而且增加了种子含油量，表明在植物种子特异表达DGAT基因是能够提高油脂含量的。但是，并不是所有在植物中表达的DGAT基因都能提高油脂含量(Oakes等，PlantPhysiology 2011，155 :1146-1157)，这主要取决于DGAT基因的来源与类型。我们从微生物中克隆了几种不同的DGAT基因，来源酵母中克隆脂肪酸合成相关的DGAT基因，并将其导入酿酒酵母和烟草中，在种子中特异超表达以增加种子贮藏TGA的合成，最终达到提高植物种子种含油量的目的，从而在农业生产中创造更大的经济效益和社会效益。
发明内容
本发明的目的在于提供一种分离的二酰甘油酰基转移酶基因，其具有SEQID NO. I所示的核苷酸序列(1563bp，其中第1561-1563位bp为终止密码子)，将所述二酰甘油酰基转移酶基因构建成表达载体，应用于植物的性状改良中，能有效地提高植物种子的油脂含量。本发明的所述的分离的二酰甘油酰基转移酶基因编码具有SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列(520aa)。本发明的另一个目的在于提供一种含有权利要求I所述基因的表达载体，所述表达载体选自酵母表达载体或植物表达载体中的一种。具体地，所述表达载体为具有图2所示结构的酵母表达载体，或具有图6所示结构的植物表达载体。本发明的另一个目的在于提供一种包含权利要求I所述基因的转化体。本发明的另一个目的在于提供一种含有权利要求I所述基因的转基因植物的制备方法，包括以下步骤I)将权利要求I所述基因可操作地插入表达载体中，构建植物表达载体；2)用步骤I获得的植物表达载体转化宿主，获得转化体；3)将步骤2获得的转体转化植物，获得转基因植物。本发明还提供了提高植物种子含油量的方法，所述方法通过在植物种子中特异表达一种具有SEQ ID NO. I所示核苷酸序列的二酰甘油酰基转移酶基因，以增加植物种子中TAG的量，最终达到提高植物种子含油量的目的。本发明也提供二酰甘油酰基转移酶基因在植物性状改良上的应用。试验结果证明，将解脂酵母二酰甘油酰基转移酶基因(YlDGAT)在酵母中表达后，酵母油脂含量比野生型酵母增加了 2. 5倍。同时，在烟草的种子中特异表达该二酰甘油酰基转移酶基因(YlDGAT)后，转基因烟草种子的含油量最高可提高25%。本发明方法简便易行，效果显著，不仅能提高油料作物的食用价值，而且能为生物能源提供原料，产生巨大的经济效益。
图I :解脂酵母二酰甘油酰基转移酶基因(YlDGAT)酵母表达载体的构建流程图。
其中，pUCm-T为上海生工生物技术公司产品，pENTR和pYES-DEST52为Invitrogen公司产品。图2 :解脂酵母二酰甘油酰基转移酶基因(YlDGAT)酿酒酵母表达载体的结构图。其中，Ampicillin，氨苄青霉素抗性基因；pUC ori，在大肠杆菌中高拷贝复制位点；2 μ origin,在酵母中高拷贝复制位点；V5 epitope, V5抗体检测位点；6x His,多聚组氨酸位点；CYCl TT，CYC1终止子；P GALl，GALl诱导型启动子；f I origin，单链DNA复制位点；URA3，乳清酸脱羧酶基因。图3 :黄曲霉二酰甘油酰基转移酶基因(AflDGAT)酵母表达载体的构建流程图。其中，pUCm-T为上海生工生物技术公司产品，pENTR和pYES-DEST52为Invitrogen公司产品。图4 :烟曲霉二酰甘油酰基转移酶基因(AfuDGAT)酵母表达载体的构建流程图。pUCm-T为上海生工生物技术公司产品，pENTR和pYES_DEST52为Invitrogen公司
女口
广叩ο图5 :解脂酵母二酰甘油酰基转移酶基因(YlDGAT)植物种子特异表达载体的构建流程图。其中，Km，卡那霉素抗性基因；Amp，氨苄青霉素抗性基因；35S，来源于花椰菜花叶病毒的植物组成性启动子；gus: :npt, β -葡萄糖酸苷酶与新霉素磷酸转移酶的融合基因；poly A，35S终止子；Napin，Napin种子特异启动子；LB，T-DNA左边界；RB，T-DNA右边界。P3载体，以pBI121为骨架改造的植物表达载体，具有35S启动子调控下的⑶S和NPT II基因，便于在植物遗传转化的过程中对转化子进行GUS染色的筛选。图6 :解脂酵母二酰甘油酰基转移酶基因(YlDGAT)植物种子特异表达载体结构图。其中，Km，卡那霉素抗性基因；35S，来源于花椰菜花叶病毒的植物组成性启动子；gus::npt, β -葡萄糖酸苷酶与新霉素磷酸转移酶的融合基因；poly A,35S终止子；Napin,Napin种子特异启动子；LB，T-DNA左边界；RB，T-DNA右边界。图7 :转基因酵母中YlDGAT、AfuDGAT和AflDGAT表达蛋白的检测结果图。其中，从左到右依次为转入YlDGAT基因未诱导的酿酒酵母总蛋白、诱导48h后的酵母总蛋白；转入AflDGAT基因未诱导的酿酒酵母总蛋白、诱导48h后的酵母总蛋白；转入AfuDGAT基因未诱导的酿酒酵母总蛋白、诱导48h后的酵母总蛋白。其电泳结果证实，在诱导表达48h后，3组转基因酵母分别表达出相应的目的蛋白。红色箭头标注出了目的蛋白。图8 :转化三种微生物DGAT基因后酵母的脂质含量测定结果图。其中，将解脂酵母、黄曲霉、烟曲霉DGAT基因转化至酿酒酵母INVScl。应用诱导培养基诱导转基因酵母表达相应的目的蛋白，利用索氏抽提器提取酵母菌体的脂质。实验结果显示转化YlDGAT基因的转基因酵母脂质含量是野生型酵母脂质含量的3. 5倍。转化了 AflDGA及AfuDGAT基因的转基因酵母脂质含量高分别是野生型酵母脂质含量的2. O倍和I. 9倍。转化几种微生物源DGAT基因后，酵母的脂质含量均有大幅提高，方差分析显示，脂质含量的增加均达到极显著(P < O. 01)水平。图9 :转化几种不同来源的DGAT基因后酵母脂质中脂肪酸成分测定图。其中，应用气相色谱串联质谱(GC-MS)分别分析野生型㈧酿酒酵母、转化YlDGAT、基因酵母(B)、转化AflDGAT酵母(C)和AfuDGAT酵母(D)脂质成分的检测峰图。图10:Real time RT-PCR分析TO代不同转基因株系烟草种子中YlDGAT基因的表达图。其中，YlDGAT基因在野生型烟草中无表达；在19个转基因株系中表达程度不同，0_13#中的表达量高(A) ;0-8#中的表达最低，其余株系中该基因的表达在这两个株系之间。WT，野生型对照。图11 T0代不同转基因烟草株系种子千粒重和油脂含量比较图。 其中，通过测定野生型和22个转基因株系种子中的油脂含量，结果发现所有转基因株系种子的油脂含量均高于野生型。野生型烟草种子的脂质含量为38. 32%，转化YlDGAT基因的转基因TO代烟草种子的脂质含量均在40%以上，其中最低为40. 49%，最高为47. 89 %。相比与野生型脂质含量，转基因植株绝对提高量达2. 2 % 9. 6 %，相对提高量在5. 7% 25. 0%之间。转基因烟草其千粒重呈现波动变化，但是总体略低于野生型种子千粒重。图12 Τ0代转基因烟草种子脂肪酸成分分析图。其中，选择部分具有代表性的TO代转基因烟草，测定其种子脂肪酸成分Α E :依次为野生型、0-13#、0-14#、0-19#烟草植株种子脂肪酸成分及含量GC-MS检测峰图。
具体实施例方式以下结合附图对本发明进行进一步的详细说明，但以下说明并不对本发明进行限定，任何对本发明的变形和改变，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求所定义的范围。本发明实例中的试剂药品未做具体说明的均为普通市售，材料方法未做具体说明的均参考《分子克隆实验指南》(Sambrook和Russell, 2001)。实施例II. DNA 的提取提取真菌DNA方法首先用液体培养基培养真菌；待培养好真菌后，抽滤菌丝，用液氮速冻研磨；收集研磨后的粉末加入配制好的真菌DNA提取缓冲液3ml (O. 2mol/LTris -HCl (pH7. 5), O. 5mol/L NaCl，0. Olmol/L EDTA, 1% (ff/V) SDS)和 β -巯基乙醇 0. lml，摇匀 8000rpm 5min 常温离心，离心后取上清液；用氯仿抽提2次(每次加入3ml氯仿，8000rpm 5min常温离心，离心后取上清液);加入上清液2/3体积的异丙醇和1/10的NaAc (pH5. 2)于_20°C冷冻过夜；过夜后IOOOOrpm 5min常温离心，去掉上清液；用300 μ L TE溶解沉淀；用碱酚氯仿异戍醇(25 24 I)混合液与上述TE溶解的混合液等体积混合抽提一次(13000rpm Imin常温离心，取上清液)；加入等体积的氯仿异戊醇涡旋后13000rpm Imin常温离心，取上清液；继续13000rpm 9min常温离心，取上清液；加入3倍体积的冷冻乙醇将DNA沉淀；冷冻20-30min后弃上清液，将沉淀在离心管中干燥；将干燥的DNA溶于100 μ L TE中待用。提取植物DNA方法选取烟草、油菜等植物幼叶O. 5-lg,在液氮中迅速研磨成粉,加入3mL 65°C预热的 CTAB 提取液(100mmol/L Tris-HCl (pH8. 0), 20mmol/L EDTA(ρΗ8· 0)，I. 5mol/L NaCl,2% CTAB (ff/V), 4 % PVP40 (ff/V)和2%巯基乙醇(V/V)，PVP和巯基乙醇使用前加入)，快速振荡混勻。65°C水浴30min,然后加入ImL 5mol/LKAc,冰浴20min后,用等体积的氯仿异戊醇(24 I)抽提I次(10，000r/min，4°C离心5min)，取上清，加入2/3倍体积的-20°C预冷异丙醇，混匀，静置约30min，用玻棒挑出絮状沉淀，用75%的乙醇反复漂洗数次，再用无水乙醇漂洗I次，吹干，重悬于500 μ L TE中。加入IyL RNaseA(10mg/mL)，37°C处理Ih0再用酚(pH8. O)氯仿异戊醇(25 24 I)和氯仿异戊醇(24 I)各抽提I次(10，000r/min，4°C离心5min)，取上清，乙醇沉淀。沉淀用75 %的乙醇漂洗，风干，溶于200 μ L TE中，-20°C保存备用。
2. RNA 的提取选取约Ig新鲜烟草材料，在液氮中迅速磨成精细粉末，装入IOmL离心管，加入3mL65°C预热的 RNA提取液(2% CTAB (W/V) ,2% PVP (ff/V)，lOOmmol/LTris-HCl (ρΗ8· O)，O. 5g/LSpermidine, 2, Omol/L NaCl，2%巯基乙醇(V/V，使用前加入))，颠倒混匀。65°C水浴3 lOmin，期间混匀2 3次。氯仿异戊醇(24 I)抽提2次(10，000r/min，室温，5min)。取上清，加入1/4体积lOmol/L LiCl溶液，4°C放置6h，以氯仿异戊醇(24 I)抽提I次(10，000r/min,室温，5min)。加2倍体积的无水乙醇，在_70°C冰箱沉淀30min以上。12，000r/min，4°C离心20min，弃上清。沉淀用100 μ L的DEPC处理水溶解。酚(ρΗ4· 5)氯仿异戊醇(25 24 I)、氯仿异戊醇(24 I)各抽提I次(10，000r/min，室温，5min)。加1/10体积3mol/L NaAc溶液和2. 5倍体积的无水乙醇，在_70°C冰箱沉淀30min以上。12，000r/min,4°C离心20min,弃上清。沉淀用70%的酒精漂洗一次,风干。加50 μ L的DEPC处理水溶解、备用。3.基因组序列的PCR扩增
IOxEx PCR buffer (Mg2+ free) 2.5 μΕ2.5 mmol/L dNTPs2 μ ^25 mmol/L· MgCl22 μ ^「 ^上游引物(5 μπιοΙ/L)I μL
下游引物(5 μπιοΙ/L) I pL Ex Taq DNA 聚合酶 I U 基因组 DNA_^_60 ng
25 μL的扩增体系扩增程序为94°C，5min;94°C，30sec，56°C，30sec，72°C，I. 5min，35 个循环；72°C延伸IOrnin04.DNA片段回收，连接，转化大肠杆菌DH5a紫外灯下用洁净的刀片切下含目的片段的琼脂糖凝胶块，然后按DNA片段回收试剂盒说明书(Roche公司)中的步骤，回收目的DNA片段，最后用适量的TE溶解即得到目的片段。回收的片段与pUCm-T (上海生工)载体建立如下连接体系10xT4 DNA连接缓冲液 I pL 载体DNA片段I pL外源连接产物DNA片段I pL
T4 DNA连接酶I pL
用效蒸豕pL的连接体系载体DNA片段与外源连接产物DNA片段摩尔比为I : 3，16°C连接12h。之后将连接产物转化大肠杆菌DH5 α。实施例2I.解脂酵母DGAT基因克隆根据解脂酵母DGAT基因序列(GenBank登录号ΧΜ_504700)，设计引物(序列3，4)，从解脂酵母的基因组中PCR扩增获得一个I. 5kbp左右的片段。将扩增DNA片段克隆后测序分析表明为解脂酵母DGAT基因。然后，再设计特异引物(序列5)对获得的解脂酵母DGAT基因进彳丁改造，最后得到序列I所不的YlDGAT基因序列。2.黄曲霉DGAT基因克隆根据黄曲霉DGAT基因序列(GenBank登录号XM_002378082)，设计引物(序列8，9)，从黄曲霉cDNA中体外扩增获得一个I. 4kbp左右的片段。将扩增DNA片段克隆后测序，结果得到序列12分析表明为黄曲霉DGAT基因(AflDGAT)。3.烟曲霉DGAT基因克隆根据烟曲霉DGAT基因序列(GenBank登录号XM_750079)设计引物(见序列10和11)，从烟曲霉cDNA中扩增获得一个I. 5kbp左右的片段。将扩增DNA片段克隆后测序，结果得到序列13分析表明为烟曲霉DGAT基因(AfuDGAT)。4. Napin种子特异启动子的克隆根据甘蓝型油菜的napin基因的启动子序列(GenBank登录号J02798. I)，设计napin特异引物(序列16，17)，从油菜基因组中扩增获得一个I. Ikb左右的片段。将扩增DNA片段克隆后测序分析表明为油菜napin启动子，见序列18。5.酿酒酵母诱导表达载体的构建载体构建流程见图I。所有限制性内切酶购自Roche公司，按照使用说明书操作。实施例3I.大量诱导转基因酵母(I)接种含有PYES-DEST52的单克隆菌落至15ml SC-U酵母缺陷筛选培养基(O. 67% YNB, I X氨基酸、腺嘌呤，2%葡萄糖)，28°C 200rpm摇菌过夜；(2)测定0D600，并根据该OD值计算出最终接种到IOOml酵母半乳糖诱导表达培养基(0.67% YNB，1X氨基酸、腺嘌呤，2%半乳糖糖，10%棉籽糖)中的菌液量。接种原则是使酵母诱导培养基的初始OD值为O. 4 ;(3)将第二步计算好的数量的原始菌液接菌至IOOml酵母诱导培养基；共接菌10组，总体积IL。(4) 280C 200rpm摇菌20h后抽滤菌液，收集菌体；2.酵母菌体蛋白提取
(I)重悬新 鲜或冷冻的细胞于 500 μ L breaking buffer,离心(4°C 1500g 5min),
弃上清液，收集细胞；(2)将细胞重悬于 breaking buffer 中，使 OD6OO 达到 5O 100 ；(3)加入等体积的酸洗玻璃珠；(4)涡旋混合30s，然后置于冰上30s，4min中内反复4次，溶解细胞，细胞被剪力溶解，可以在显微镜下检测细胞碎片；(5)将包含玻璃珠的样品离心(常温13200rpm IOmin)，取上清液；(6)将上清液转移至一个新的离心管，上清液即为酵母菌体的蛋白质。3. DGAT基因在酵母中表达的蛋白质电泳鉴定参照汪家政(2000)的方法，采用不连续垂直板电泳系统。按照下表的比例配制SDS-PAGE凝胶，其中，浓缩胶浓度为5. 6%，分离胶浓度为12. 0%，凝胶厚度为O. 75mm。将蛋白样品与1/3体积的4 X SDS样品缓冲液混合，100 V加热IOmin进行样品的前处理。SDS-PAGE电泳结束后，凝胶在染色液中染色30min，然后室温下脱色过夜，观察照相。
权利要求
1.一种分离的二酰甘油酰基转移酶基因，其具有SEQ ID NO. I所示的核苷酸序列。
2.含有权利要求I所述二酰甘油酰基转移酶基因的表达载体。
3.权利要求2所述的表达载体，其中所述载体为酵母表达载体或植物表达载体。
4.如权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为具有图2所示结构的酵母表达载体。
5.如权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为具有图6所示结构的植物表达载体。
6.含有权利要求2所述的表达载体的转化体。
7.一种含有权利要求I所述基因的转基因植物的制备方法，包括以下步骤 1)将权利要求I所述的基因可操作地插入表达载体中，构建植物表达载体； 2)用步骤I获得的植物表达载体转化宿主，获得转化体； 3)将步骤2获得的转化体转化植物，获得转基因植物。
8.权利要求I所述的分离的二酰甘油酰基转移酶基因在制备转基因植物中的应用。
9.一种提高植物种子含油量的方法，包括将权利要求I所述的二酰甘油酰基转移酶基因整合进入植物构建转基因植物，并使得所述二酰甘油酰基转移酶基因在植物种子中表达的步骤。
10.权利要求I所述的基因在改良植物品种中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种分离的二酰甘油酰基转移酶基因及其表达载体，该基因可用于提高植物种子含油量。
文档编号A01H5/10GK102634528SQ201210059920
公开日2012年8月15日 申请日期2012年3月8日 优先权日2012年3月8日
发明者侯磊, 周庆璋, 宋水清, 张丹丹, 张瑞芝, 李先碧, 李德谋, 梁爱敏, 罗小英, 罗明, 肖月华, 裴炎, 金丹 申请人:西南大学