一种固定化磷脂酶d催化制备磷脂酰丝氨酸的方法
【专利摘要】本发明公开了一种固定化磷脂酶D催化制备磷脂酰丝氨酸的方法，该方法包括如下步骤：(1)以甲壳素为载体，以戊二醛为交联试剂，固定游离磷脂酶D得到磷脂酶D的固定化酶；(2)以步骤(1)制备得到的磷脂酶D的固定化酶为催化剂，以醋酸丁酯为有机相溶剂，以pH5.5、50mM的醋酸钠缓冲液为水相溶剂，在温度20～60℃条件下，L-丝氨酸与大豆磷脂按摩尔比10～100:1反应制备磷脂酰丝氨酸，反应结束后过滤回收磷脂酶D重复使用。本发明方法在双相催化体系中转酯率达到78％，固定化酶可以重复利用。方法简单，易于操作，制备成本低廉。
【专利说明】一种固定化磷脂酶D催化制备磷脂酰丝氨酸的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，涉及一种固定化磷脂酶D催化制备磷脂酰丝氨酸的方法。
【背景技术】
[0002]磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine, PS)是一种重要的磷脂物质,具有突出的脑保健功能。虽然天然存在的PS分布广泛，但含量都非常低。目前，PS的制备主要为提取法与酶转化法，提取法主要从动物大脑组织中提取PS，近年来，由于疯牛病的原因，提取法制备的PS面临着食品安全性的问题。与此相比，酶转化法利用磷脂酶D催化卵磷脂的转酯反应制备PS，反应条件温和、过程简单、绿色环保，是制备PS的理想方法。
[0003]酶法制备PS以卵磷脂为原料，L-丝氨酸为醇供体,在磷脂酶D(phospholipaseD, PLD)的作用下发生转磷脂酰反应生成PS，同时也会伴随卵磷脂的水解反应，如图1所示。
[0004]PLD是一种磷脂水解酶(EC3.1.4.4)，能够催化磷脂的水解，释放磷脂酸(PA)和醇残基。除了水解活性，PLD还能够催化转磷脂酰反应。磷脂酶D催化的磷脂酞转移反应是一个油-水两相之间的界面反应，磷脂酶D溶解在水相中，通过搅拌与油相中的反应底物在两相界面之间接触促 使反应发生。酶在两相界面之间分布的越多，越能够提高反应速率，但磷脂酶D是水溶性的酶，与有机溶剂接触容易聚集结块，甚至失活，造成反应速率的下降。因此，能够促使磷脂酶D向有机相靠拢而又不会造成酶活力损失的方法能够提高转磷脂酰反应速率。目前，酶的固定化技术是用来解决这一问题的方法之一。将酶与合适的载体结合，可以增大与底物接触的面积，并且在酶周围形成一个具有保护作用的微环境，提高酶的有机溶剂耐受性和热力学稳定性。同时，磷脂酶D本身比较昂贵，将其固定化后容易从产物中分离回收，可重复利用，降低成本。
[0005]酶固定化方法根据载体，操作方法的不同，以及固定化的机理，主要可分为吸附法、共价偶联法、交联法、包埋法和微囊法等。吸附法是指通过载体表面和酶表面间的次级键相互作用而达到酶固定化的方法，操作简单，条件温和，对酶活保持较好，但是由于物理吸附作用力较弱，固定的酶易流失；交联法是利用双功能或多功能基团试剂在酶分子之间交联架桥固定化酶的方法，虽然固定的酶很牢固但是由于交联条件苛刻，酶分子易失活。现在越来越多的固定方法并不局限于单一方法的使用，而是根据需要来复合使用两种及两种以上的固定法以达到制备有两固定化材料的目的。
[0006]甲壳素(chitin)又称甲壳质、几丁质、壳多糖，是N-乙酰氨基葡萄糖单位通过β -1, 4-糖苷键连接而成的直链多糖，为白色片状固体，无毒，无味，耐酸碱，耐腐蚀，耐高温，耐日光，性能十分稳定，是迄今为止发现的唯一天然碱性多糖。它大量存在于低等动物特别是节肢动物的甲壳中，是自然界中储备量仅次于纤维素的第二大天然可再生资源。甲壳素所具有的氨基被戊二醛活化后，可作为固定化磷脂酶D的载体。同时由于戊二醛对物质有很强的穿透力，利用它对甲壳素进行处理后，甲壳素的表面形成有机多孔结构，有利于酶的吸附。而且戊二醛为活泼的双功能试剂，它不仅与酶蛋白的氨基、羧基反应，还能活化甲壳素所具有的氨基。
【发明内容】
[0007] 本发明所要解决的技术问题是提供一种固定化磷脂酶D催化制备磷脂酰丝氨酸的方法。
[0008]为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下:
[0009]一种固定化磷脂酶D催化制备磷脂酰丝氨酸的方法，该方法包括如下步骤:
[0010](1)以甲壳素为载体，以戊二醛为交联试剂，固定游离磷脂酶D得到磷脂酶D的固定化酶；
[0011](2)以步骤(1)制备得到的磷脂酶D的固定化酶为催化剂，以醋酸丁酯为有机相溶剂(用于溶解大豆磷脂)，以PH5.5、50mM的醋酸钠缓冲液为水相溶剂(用于溶解L-丝氨酸)，在温度20~60°C、CaCl2存在条件下，L-丝氨酸与大豆磷脂按摩尔比10~100:1反应制备磷脂酰丝氨酸，反应结束后过滤回收磷脂酶D重复使用。
[0012]步骤(1)中，以甲壳素为载体，以戊二醛为交联试剂，固定游离磷脂酶D得到磷脂酶D的固定化酶的方法包括如下步骤:
[0013](Ia)游离憐脂酶D 的制备:Streptomyces racemochromogenes ATCC23954 甘油菌经种子培养和发酵培养后得到含有磷脂酶D的发酵液，发酵液过滤除去菌体，收集清液，再经超滤处理得游离磷脂酶D酶液；
[0014](Ib)甲壳素的交联:以甲壳素为载体，加入交联试剂戊二醛溶液，室温下浸泡并搅拌l-5h，静置过夜，离心去除上清液，离心后的载体用蒸馏水反复冲洗以除去残余的戊二醛，抽滤，即得交联甲壳素载体；
[0015](Ic)游离磷脂酶D的固定化:在交联甲壳素载体中，加入游离磷脂酶D酶液和醋酸钠缓冲溶液，30°C下搅拌或者震荡吸附2~6h，取出过滤，并用醋酸钠缓冲液冲洗，置于4°C下保存。
[0016]步骤(Ia)中，所述的超滤，其超滤膜的截留分子量为lOkDa。
[0017]步骤(Ib)中，所述的戊二醛溶液为用50mM、pH5.5的醋酸钠缓冲液稀释的戊二醛，戊二醛溶液中溶质戊二醛的体积百分含量为I~5%，优选3%;每Ig甲壳素加入戊二醛溶液的体积为5ml。
[0018]步骤(Ic)中，交联甲壳素载体与游离磷脂酶D的比为Ig:10~50U，优选Ig:26.5U。
[0019]步骤(Ic)中，所述的醋酸钠缓冲溶液为50mM，pH5.5的醋酸钠缓冲溶液，游离磷脂酶D酶液和醋酸钠缓冲溶液的体积比为1:1。
[0020]步骤⑵中，磷脂酶D的固定化酶的用量为0.2~0.6U/ml反应体系，优选0.24U/mL。
[0021]步骤(2)中，CaCl2的加入量为5mmol/L反应体系。
[0022]步骤⑵中，大豆磷脂与醋酸丁酯的用量比为40 μ mol:2~10ml，优选40 μ mol:2mL ；L-丝氨酸与醋酸钠缓冲液的用量比为2mmol:2~IOml,优选2mmol:2ml。
[0023]步骤(2)中，反应时间为2~8h，优选2~6h。
[0024]步骤(2)中，温度优选30 V。[0025]步骤⑵中，L-丝氨酸与大豆磷脂按摩尔比优选50:1。
[0026]本发明磷脂酶D的酶活定义为:单位时间内Imin生成Iumol的ps为一个酶活单位U。
[0027]有益效果:本发明与现有技术相比，具有如下优势:
[0028]1.本发明以甲壳素为磷脂酶D固定的载体，戊二醛为交联试剂固定游离磷脂酶D，酶的固定化率较高。
[0029]2.经固定化后的磷脂酶D较游离酶相比展现出了更好的温度和pH稳定性及有机溶剂耐受性。
[0030]3.经固定化后的脂肪酶在双相和微水相催化过程中的反应速率相比游离脂肪酶得到了很大提高，并且重复使用性能好。
[0031]4.本发明方法简单，易于操作，制备成本低廉，具有极大的应用价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0032]图1为磷脂酶D催化的转磷脂酰反应与水解反应。
【具体实施方式】 [0033]根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
[0034]实施例1:游离磷脂酶D的制备。
[0035](I)种子培养:取一支-80 °C 保存的 Streptomyces racemochromogenesATCC23954甘油菌，无菌状态下，按lv/v%接种量接入250mL三角摇瓶中(含IOOmL种子培养基)，放入摇床后，30°C、200rpm培养48h。
[0036](2)发酵培养:将上述种子培养液按2v/v%接种量接入发酵罐中，起始发酵培养基为5L发酵培养基，以25wt%氨水控制发酵液的pH为7.0，调节氧通气量1VVM，控制温度为 30°C，500rpm 培养 24h。
[0037](3)粗酶液的处理:将发酵液滤纸真空抽滤去除发酵液中结团的菌体，收集上清液，上清液即为发酵粗酶液，检测酶活为0.69U/mL。在超滤装置安装截留分子量为IOkDa的超滤膜，加入经过滤纸粗滤的发酵液，收集截留液，检测酶活为5.3U/ml。
[0038]种子培养基(g/L):葡萄糖5，酵母提取物5，蛋白胨5，K2HP042，MgSO40.25。
[0039]发酵培养基(g/L):葡萄糖5，酵母提取物5，蛋白胨5，K2HP042，MgSO40.25,大豆磷脂2.5
[0040]实施例2:固定化磷脂酶D的制备。
[0041](I)称取Ig的甲壳素为载体，加入3V/V%浓度的交联试剂戊二醛溶液5ml (戊二醛溶液中溶剂为50mM、pH5.5的醋酸钠缓冲液)，室温下浸泡并搅拌4hr，静置过夜，离心去上清液；将载体用蒸馏水反复冲洗以除去残余的戊二醛，抽滤，即得交联甲壳素载体，置于4°C下保存；
[0042](2)取出Ig交联甲壳素载体，加入含有5ml的游离磷脂酶D酶液(总酶活为26.5U)，然后加入5mL的50mM、pH5.5醋酸钠缓冲溶液，放在摇床中，在恒温30°C，摇床转速200rpm的条件下，吸附交联6h后，取出过滤，并用醋酸钠缓冲液(50mM、pH5.5)进行冲洗，同时取其滤液测定蛋白含量，直至蛋白含量小于3%时即可，置于4°C下保存。
[0043]固定化磷脂酶D活力15.43U/g，固定化过程中活力回收率为58.23%。
[0044]实施例3:固定化磷脂酶D在双相体系中催化大豆磷脂制备磷脂酰丝氨酸的应用。
[0045]取50mL离心管I只，加入2.0mL醋酸丁酯(包含40 μ mol大豆磷脂PC)，2.0mLpH5.550mM醋酸钠缓冲液(包含IOmM CaCl2, IM L-丝氨酸和0.96U实施例2制得的固定化磷脂酶D)，置于恒温摇床中30°C 200rpm反应。反应时间5h，取样HPLC检测底物和产物浓度，转酯率为92%。
[0046]将反应体系中的固定化磷脂酶D过滤出来，清洗，加入新的微量缓冲，L-丝氨酸，含20mM PC的醋酸丁酯进行催化，检测发现其可以在双相中循环使用五次仍能保持83%(mo I/mol)左右的转酯率。 [0047]产物的检测方法:
[0048]采用高效液相色谱法检测，取反应体系中一定量有机相作为样品。
[0049]样品预处理:
[0050]1.将含10 μ L样品的ImL离心管置于60°C烘箱或使用吹风机吹干；
[0051]2.在步骤I中离心管中加入400 μ L流动相；
[0052]3.将步骤2中离心管上下颠倒混匀3min ；
[0053]4.吸取步骤3中液体，有机滤头过滤，进样分析。
[0054]色谱条件:
[0055]流动相:正己烷/ 异丙醇 /H20/H3P04(45: 48: 7.5:1.5, V/V)
[0056]柱子:汉邦S1-1OO正相硅胶柱
[0057]柱温:25°C
[0058]紫外检测波长:206nm
[0059]流速:lmL/min
[0060]PS的出峰时间为3.71min, PC的出峰时间为15.07min。
[0061]实施例4:固定化磷脂酶D在微水相体系中催化大豆磷脂制备磷脂酰丝氨酸的应用。
[0062]在水含量6.25%、酶量0.21U/mL，L-丝氨酸与大豆磷脂(PC)摩尔浓度比20:1的条件下，催化20mM PC,4h转酯率可达到68% (mol/mol),且未发现水解反应的发生。
[0063]将反应体系中的固定化磷脂酶D过滤出来，清洗，加入新的微量缓冲，L-丝氨酸，含20mM PC的醋酸丁酯进行催化，检测发现其可以在微水相中循环使用五次仍能保持65%(mol/mol)左右的转酯率。
【权利要求】
1.一种固定化磷脂酶D催化制备磷脂酰丝氨酸的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤: (1)以甲壳素为载体，以戊二醛为交联试剂，固定游离磷脂酶D得到磷脂酶D的固定化酶； (2)以步骤(1)制备得到的磷脂酶D的固定化酶为催化剂，以醋酸丁酯为有机相溶剂，以pH5.5、50mM的醋酸钠缓冲液为水相溶剂，在温度20~60°C、CaCl2存在条件下，L-丝氨酸与大豆磷脂按摩尔比10~100:1反应制备磷脂酰丝氨酸，反应结束后过滤回收磷脂酶D重复使用。
2.根据权利要求1所述的固定化磷脂酶D催化制备磷脂酰丝氨酸的方法，其特征在于，步骤(1)中，以甲壳素为载体，以戊二醛为交联试剂，固定游离磷脂酶D得到磷脂酶D的固定化酶的方法包括如下步骤: (Ia)游离憐脂酶 D 的制备:Streptomyces racemochromogenes ATCC23954 甘油菌经种子培养和发酵培养后得到含有磷脂酶D的发酵液，发酵液过滤除去菌体，收集清液，再经超滤处理得游离磷脂酶D酶液； (Ib)甲壳素的交联 :以甲壳素为载体，加入交联试剂戊二醛溶液，室温下浸泡并搅拌l_5h，静置过夜，离心去除上清液，离心后的载体用蒸馏水反复冲洗以除去残余的戊二醛，抽滤，即得交联甲壳素载体； (Ic)游离磷脂酶D的固定化:在交联甲壳素载体中，加入游离磷脂酶D酶液和醋酸钠缓冲溶液，30°C下搅拌或者震荡吸附2~6h，取出过滤，并用醋酸钠缓冲液冲洗，置于4°C下保存。
3.根据权利要求2所述的固定化磷脂酶D催化制备磷脂酰丝氨酸的方法，其特征在于，步骤(Ia)中，所述的超滤，其超滤膜的截留分子量为lOkDa。
4.根据权利要求2所述的固定化磷脂酶D催化制备磷脂酰丝氨酸的方法，其特征在于，步骤(Ib)中，所述的戊二醛溶液为用50mM、pH5.5的醋酸钠缓冲稀释的戊二醛，戊二醛溶液中溶质戊二醛的体积百分含量为I~5% ;每Ig甲壳素加入戊二醛溶液的体积为5ml。
5.根据权利要求2所述的固定化磷脂酶D催化制备磷脂酰丝氨酸的方法，其特征在于，步骤(Ic)中，交联甲壳素载体与游离磷脂酶D的比为Ig: 10~50U。
6.根据权利要求2所述的固定化磷脂酶D催化制备磷脂酰丝氨酸的方法，其特征在于，步骤(Ic)中，所述的醋酸钠缓冲溶液为50mM，pH5.5的醋酸钠缓冲溶液，游离磷脂酶D酶液和醋酸钠缓冲溶液的体积比为1:1。
7.根据权利要求1所述的固定化磷脂酶D催化制备磷脂酰丝氨酸的方法，其特征在于，步骤(2)中，磷脂酶D的固定化酶的用量为0.2~0.6U/ml反应体系。
8.根据权利要求1所述的固定化磷脂酶D催化制备磷脂酰丝氨酸的方法，其特征在于，步骤(2)中，CaCl2的加入量为5mmol/L反应体系。
9.根据权利要求1所述的固定化磷脂酶D催化制备磷脂酰丝氨酸的方法，其特征在于，步骤⑵中，大豆磷脂与醋酸丁酯的用量比为40umol:2~IOml ;L_丝氨酸与醋酸钠缓冲液的用量比为2mmol: 2~IOml0
10.根据权利要求1所述的固定化磷脂酶D催化制备磷脂酰丝氨酸的方法，其特征在于，步骤(2)中，反应时间为2~8h。
【文档编号】C12P13/06GK103966277SQ201410218551
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2014年5月22日 优先权日:2014年5月22日
【发明者】严明, 高璐, 魏淼, 许琳, 郝宁, 李艳 申请人:南京工业大学