一种花生溶血磷脂酸酰基转移酶基因及其用途
【专利摘要】本发明涉及一种花生溶血磷脂酸酰基转移酶基因AhLPAAT1及其用途，属于分子生物学和生物【技术领域】。本发明的AhLPAAT1具有SEQIDNO：1所示的基因cDNA核苷酸序列，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。本发明的花生溶血磷脂酸酰基转移酶基因具有改变植物组织尤其是种子中脂肪酸含量，并提高多聚不饱和脂肪酸比例的作用，在植物品种选育和农业生产领域具有广泛的应用前景。本发明还涉及转化有AhLPAAT1基因的转基因植物。本发明还涉及所述AhLPAAT1基因用于改变植物种子脂肪酸含量及成分比例的方法。
【专利说明】一种花生溶血磷脂酸酰基转移酶基因及其用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及分子生物学和生物【技术领域】，更具体地，涉及一种花生溶血磷脂酸酰基转移酶基因及其用途。
【背景技术】
[0002]油脂是油料作物籽粒的主要贮藏物质之一，种子油分含量的高低及其组成决定了油料作物的经济价值。植物脂肪酸是植物油脂的主要成分，同时也是生物膜的重要组成部分，脂肪酸的组成对植物油的营养价值、食品加工用途及工业用途有重要影响，生物膜的脂肪酸组成还影响到植物膜系统有关的抗逆特性(黄冰艳等，河南农业科学，2009，9:75-78)。在植物种子中,脂肪酸主要以三酰甘油酯的形式存在(Somerville C and BrowseJj Science, 1991，252:80 - 87; Voelker T and Kinney AJj Annu Rev Plant PhysiolPlant Mol Biol, 2001, 52:335-361 )，其品质及用途也大多取决于其脂肪酸成分及含量。现在大多植物油用于人类食用，但是脂肪酸在工业生产上也具有重要用途，如润滑剂、表面活性剂、包埋剂、聚烯类产品、医疗及理疗产品和生物能源原料等。
[0003]通过鉴定已知植物产生的脂肪酸种类有200多种，这些脂肪酸在碳链的长度、双键的位置及数目、生理功能作用等方面存在着差异。根据烃链的饱和程度，可将脂肪酸分为饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸和多聚不饱和脂肪酸。其中单不饱和脂肪酸和多聚不饱和脂肪酸又统称为不饱和脂肪酸。根据烃链的长短，可将脂肪酸分为链长为4-7个碳的短链脂肪酸、链长为8-18个碳的中长链脂肪酸，以及链长为含有20或20个碳以上的超长链脂肪酸(卢善发，植物学通报，2000，17?):481-491)。不饱和脂肪酸比饱和脂肪酸在植物界中，特别是高等植物中含量丰富，植物脂肪酸除含烯键外，可含炔键、羟基、酮基、环氧基和环戊基等。大部分用于食用的油料作物主要含有油酸(oleic acid，C18:l，A9)、亚油酸(linoleic acid, C18: 2，Λ 9，12)、亚麻酸(a-1inolenic acid, C18: 3，Λ 9，12，15)、硬月旨酸(stearic acid, C18:0)和棕榈酸(palmitic acid, C16:0)等5种脂肪酸,而其他植物则含有在种类及含量上变化各异的脂肪酸。亚油酸和亚麻酸等多聚不饱和脂肪酸的营养价值和保健作用日益受到人们的关注。
[0004]高等植物中脂肪酸的生物合成是一个相当复杂的生化过程，其合成途径首先发生在质体中，蔗糖一般作为种子中脂肪酸合成的主要碳源，经过糖酵解途径转变成丙酮酸，丙酮酸在丙酮酸脱氢酶复合体的催化下被氧化成肪酸合成的前体乙酰CoA，在乙酰CoA羧化酶的作用下合成丙二酰CoA。然后脂肪酸合成酶以丙二酰CoA为底物进行连续的聚合反应，以每个循环增加两个碳的方式合成碳链，进一步合成16至18碳的饱和脂肪酸。这些不断增长的酰基碳链与酰基载体蛋白ACP结合，经过数次循环聚合，酰基-ACP硫脂酶或酰基转移酶终止脂肪酸的合成。不同碳链长度的酰基-ACP于终止反应后在酰基CoA合成酶作用下合成酰基CoA，并从质体转运到内质网或胞质中，再经多种酶的作用下进一步合成和修饰，其中有脂肪酸的去饱和超长链脂肪酸的合成及环氧化、羟化等。
[0005] 在油料作物种子中，从脂肪酸到甘油三酯TAG的合成是通过Kennedy途径(Stymne S，et al., Biochim Biophys Acta, 752:198-208)进行，主要包括四大酶促反应。首先3-磷酸甘油(G-3-P)经3-磷酸甘油酰基转移酶(G3PAT)作用合成溶血性磷脂酸(LAP)，随后在溶血磷脂酸酰基转移酶(LPAAT)作用下形成磷脂酸(PA)，磷脂酸磷酸化酶(PAP)将磷脂酸(PA)脱磷酸化形成甘油二酯(DAG)，再被二酰甘油酰基转移酶(DAGAT)催化合成甘油三酯(TAG)。甘油三酯的Sn-1和Sn-3的位置上通常被饱和脂肪酸占据，而不饱和脂肪酸通常占据Sn-2的位置。
[0006]大量的研究表明不同来源的G3PAT和DAGAT对酰基CoA的选择性较小，而LPAAT则具有很强的底物选择性，TAG的Sn-2位受LPAAT对酰基CoA的选择特异性高度限制。例如从油菜和拟南芥中分离出来的质体LPAAT对16:0-CoA的偏好性远远高过18:1-CoA(Bourgis F，et al., Plant Physiol, 1999, 120: 913 - 921; Kim HU and Huang AHC,Plant Physiol, 2004，134:1206-1216; Yu B, et al., Plant Cell Physiol, 2004，45:503-510),而对从几类不同植物中分离出来的胞质LPAAT进行研究表明对18:1-CoA的偏好性超过 16:0-CoA (Ohlrogge J and Browse J, Plant Cell, 1995; 7:957-970)。在油脂型种子的植物类型中Sn-2位置上有一些比较特殊的酰基CoA，表明这些植物当中含有另外一些对特殊的酰基CoA有活性的种子特异性的LPAAT (Cao YZ, et al.，PlantPhysiol, 1990, 94: 1199-1206; Laurant P and Huang AHC, Plant Physiol.1992,99:1711-1715; Brown A P, et al., Plant Mol Biol, 1994, 26:211-223; FrentzenM, Fett Lipid.1998; 100:161-166)。一些植物成熟种子或其他组织来源的LPAAT基因也已经被分离克隆出来，包括椰子(Knutzon D S，et al., Plant Physiol, 1995,109:999-1006)、玉米(Brown A P, et al., Plant Mol Biol, 1994，26:211-223)、池花属{Limnanthes) (Brown A P, et al., Plant Mol.Biol.29 (1995), 267 - 278)等。
[0007]不同来源的植物LPAAT由于其底物偏好性和功能的差别，使植物脂肪酸的合成呈多样化，因此可通过生物工程途径利用不同来源的基因有目地对植物进行有针对性的改良，从而改变植物脂肪酸的含量和成分，获得稳定高产、满足人类需求的优良新品种。鉴于植物油的提取工艺非常成熟，许多研究者已经将目光转向油料作物的代谢工程，研究如何利用转基因植物作“绿色细胞工厂”生产各种有用脂肪酸产品，具有重要的经济价值和应用前景。
【发明内容】
[0008]发明人在已构建花生种子发育中期cDNA文库的基础上，通过设计简并引物克隆得到花生溶血磷脂酸酰基转移酶基因，该cDNA含有一个大小为1131bp的开放阅读框(0RF)。开放阅读框编码376个氨基酸残基的蛋白，AhLPAATl基因编码的蛋白与GenBank中蓖麻、葡萄、拟南芥、玉米、水稻、北美云杉等物种的LPAAT相似性分别高达90 %、90%、85%、88%、83%、80%。
[0009]通过转基因验证花生溶血磷脂酸酰基转移酶基因功能，与对照组比较，发现转化了 基因的转基因植株所产生的种子脂肪酸总含量下降，同时多聚不饱和脂肪酸的比例有不同程度的增加。由此验证了基因可改变种子中脂肪酸的含量与成分比例。
[0010]本发明首先提供一种花生溶血磷脂酸酰基转移酶基因的核苷酸序列，所述的核苷酸序列含有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列或与其互补的核苷酸序列。所述基因的序列如下:
【权利要求】
1.一种花生溶血磷脂酸酰基转移酶基因的核苷酸序列，其特征在于，所述的核苷酸序列含有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列或与其互补的核苷酸序列。
2.一种蛋白，其特征在于，所述的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3.一种载体，其特征在于，所述的载体含有权利要求1所述的核苷酸序列。
4.一种含根据权利要求3所述的载体的重组细胞。
5.一种转基因植物，其特征在于，所述转基因植物转化有根据权利要求1所述的核苷酸序列，或根据权利要求2所述的氨基酸序列，或根据权利要求3所述的载体，或感染有根据权利要求4所述的重组细胞。
6.一种根据权利要求1所述的核苷酸序列、根据权利要求2所述的氨基酸序列、根据权利要求3所述的载体或根据权利要求4的重组细胞在改变植物组织中的应用。
7.一种根据权利要求1所述的核苷酸序列、根据权利要求2所述的氨基酸序列、根据权利要求3所述的载体或根据权利要求4的重组细胞在制备转基因植物或用于植物育种中的应用。
8.一种改变植物种子脂肪酸含量及成分，并提高种子多聚不饱和脂肪酸比例的方法，其特征在于，所述方法包括将权利要求1的核苷酸序列或权利要求3的载体转化入植物，或包括用权利要求4的重组细胞感染植物。
9.一种改变植物组织或培养细胞的脂肪酸含量及成分，产生具有较高多聚不饱和脂肪酸比例的转基因植物，或转基因愈伤组织组织，或转基因细胞的方法，所述方法包括以下步骤: S1.将权利要求1的核苷酸序列和/或权利要求3的载体转化入植物组织或细胞，或用感染有权利要求4的重组细胞感染植物组织或细胞； S2.利用所述植物组织或细胞再生转基因植物； 所述植物包括双子叶植物、单子叶植物及藻类植物，特别是拟南芥、花生、大豆、油菜、油茶、麻疯树、芝麻、向日葵、橄榄、玉米、水稻、小麦、油藻。
【文档编号】C12N9/10GK103725700SQ201310725260
【公开日】2014年4月16日 申请日期:2013年12月25日 优先权日:2013年12月25日
【发明者】黎茵, 黄上志, 刘琛, 颜瑞卿 申请人:中山大学