使用L－α－溶血磷脂酰胆碱获得单核细胞体外分化成成熟树突细胞的制作方法

专利名称：使用L－α－溶血磷脂酰胆碱获得单核细胞体外分化成成熟树突细胞的制作方法
技术领域：
本发明涉及单核细胞分化成成熟树突细胞的方法，据此单核细胞在适合其分化的培养基中提供，L-α-溶血磷脂酰胆碱加入所述培养基。本发明也涉及使用至少1种L-α-溶血磷脂酰胆碱的抑制剂以生产药物产品，用于防止炎症和/或抗炎症疾病和/或自身免疫疾病。树突细胞参与免疫反应的发展和通过识别、摄取及抗原呈递来起始特异T-淋巴细胞反应，特别是感染剂(Steinman等.，1997，Immuno.Rev.，15625-37；Cella等.，1997，Curr.Opin.Immunol.，910-16)。尽管未成熟树突细胞吸收和消化传染剂的抗原很有效，一些信号如细菌剂或炎症细胞因子能通过诱导成熟过程来激活它们，这是触发适应性免疫反应中的初始步骤。事实上，在此激活中，树突细胞获得移至发现T-淋巴细胞的淋巴器官的能力和传送共刺激信号的能力，信号对于激活原初T-淋巴细胞是必需的。在此成熟中，树突细胞经历功能和表型修饰如·参与激活T-淋巴细胞的表面分子增加(如CD40、CD80、CD83、CD86和主要组织相容性复合体(MHC)I型及II型的分子，·生成促炎细胞因子(如白介素IL-12、IL-1β、TNFα和IL-6)，·它们吸收和加工抗原的能力减小。
由于成熟树突细胞发展免疫反应和起始特异T-淋巴细胞反应的能力，它们有特定的治疗兴趣，特别在抗感染、抗肿瘤免疫和免疫治疗的领域(Austin.1998，Curr.Opin.Hematol.53-15；Reisa Sousa等.，1999，Curr.Opin.Immunol.11392-399)。由于树突细胞诱导免疫耐受的能力，当需要抑制病人的免疫反应时，这些树突细胞也是有利的靶，尤其用于抗自身免疫或炎症疾病。
成熟树突细胞能体外获得自培养中的单核细胞。这些单核细胞是体内循环细胞，当穿过特定血管内皮细胞壁时接触周围影响它们出现的因子，其影响方式仍不太了解。然后3种可能性简明地用于这些单核细胞·离开组织并返回淋巴结，·分化成巨噬细胞，
·分化成未成熟树突细胞。
从单核细胞培养中获得成熟树突细胞的第1个步骤由诱导单核细胞分化成未成熟树突细胞组成，尤其用白介素IL-4和因子GM-CSF(粒细胞巨噬细胞-刺激因子)。6天后，95％培养细胞是未成熟树突细胞。
然后第2个步骤由诱导未成熟树突细胞成熟为成熟树突细胞组成，用外源试剂如细菌或病毒剂。因此，来自肺炎克氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)的Kp OmpA蛋白能诱导这些未成熟树突细胞成熟为成熟树突细胞(P.Jeannin等.，NatureImmunology，2000，1502-509)。也提到通过其它外源分子如细菌膜脂多糖使未成熟树突细胞成熟为成熟树突细胞(Dichman等.，Journal of Cellular Physiology，2000，185394-400)。然而，使用来自感染剂的外源分子引起安全性和成本问题(直接或间接体内副作用；需要根据很严格的法定和规范要求纯化很重要等)，在疫苗学和免疫治疗方面难以使用此类型的分子。
最近Perrin-Cocon等在2001年(The Journal of Immunolgy，1673785-3791)描述了从进行分化的单核细胞中产生成熟树突细胞可用内源分子诱导，如一些氧化血浆脂蛋白和更具体的氧化低密度脂蛋白(LDLs)。然而，氧化LDLs是复合颗粒，由蛋白质、三酰甘油、磷脂、游离和酯化胆固醇组成，结果难以人工合成。
同样重要的是注意到，刺激单核细胞分化成树突细胞在一些治疗应用(免疫期间、刺激免疫反应期间)中是必需的，在其它治疗应用如自身免疫或炎症疾病中也必需抑制单核细胞分化成树突细胞或更一般地抑制未成熟树突细胞的成熟。目前存在抗炎症，如服用肾上腺皮质激素或服用阿斯匹林的治疗。问题是当炎症是慢性时，这种治疗有对病人有很有害的副作用。延长服用肾上腺皮质激素可特定产生库兴氏综合症，期间观察到脱矿质、自发断裂和糖尿病。延长服用阿斯匹林部分能产生胃溃疡。本发明提出解决现有技术水平的缺点，也提出抗炎症分子，此分子容易合成且相对便宜、抑制单核细胞分化成成熟树突细胞。
因此本发明提出解决现有技术水平的缺点，通过提供促炎分子、内源分子，分子容易合成且相对便宜并刺激单核细胞分化成成熟树突细胞。本发明也涉及使用脂质乳剂，包括甘油三酯、磷脂和甘油如特定的Intralipid，用于抑制单核细胞分化成成熟树突细胞，通过直接作用或经抑制L-α-溶血磷脂酰胆碱作用的间接作用。
令人惊讶的是，本发明涉及使用L-α-溶血磷脂酰胆碱以使单核细胞体外分化成成熟树突细胞。
术语“L-α-溶血磷脂酰胆碱”用于指有如下公式的分子 其中， 代表饱和脂肪酸的长链，脂肪酸含12到20个碳原子，优选从16到18。
事实上，LDL氧化中产生的活性分子之一是L-α-溶血磷脂酰胆碱，下文中称为LPC。然而，已显示LPC结合G2A受体，G2A受体是LPC的高亲和性受体，尤其抑制T-淋巴细胞的增殖和活化，这提示LPC在抑制免疫反应触发中的作用(Carson&Lo，2001，Science，293618-619)。此外，也显示高浓度LPC(50μM)抑制转录因子NF-κB(核因子κB)的活性，而NF-κB已知在树突细胞成熟期间活化。另外，LPC以高浓度存在于血浆中，提示它在血浆中不活化，使它不倾向于被治疗用途领域中的技术人员选择。
发明涉及单核细胞体外分化成成熟树突细胞的方法，据此A.单核细胞在合适培养基中提供，B.分化因子存在时，诱导单核细胞分化成树突细胞，C.L-α-溶血磷脂酰胆碱加入所述培养基并获得成熟树突细胞。
表达“合适培养基”是指包括细胞存活所需的所有元素的培养基。通过例子提到RPMI 1640培养基和其衍生物以及本领域技术人员熟知的任何培养基。此培养基特定包括至少1个使单核细胞分化成树突细胞的因子。使单核细胞分化成树突细胞的因子对本领域技术人员熟知，尤其无任何含蓄的限制提到细胞因子，如白介素IL-4、因子GM-CSF(粒细胞巨噬细胞-刺激因子)、IL-13或TNF(肿瘤坏死因子)。
在步骤C)中，L-α-溶血磷脂酰胆碱特定加入所述培养基，培养基中终浓度在10和80μM间，优选在约20和60μM间，30和50μM间有利。仍在步骤C中，L-α-溶血磷脂酰胆碱在单核细胞分化的第3和第6天间加入所述培养基，优选单核细胞分化的第4和第5天间。
根据发明的特定实施方案，至少1种生物试剂也在步骤C中加入培养基。术语“生物试剂”指一种分子(或一组分子)，是免疫反应的靶或可合成此靶。因此，此生物试剂可选自细菌、病毒、酵母、寄生虫或真菌抗原、肿瘤抗原、自体和/或异源肿瘤细胞的裂解物。术语“自体肿瘤细胞”是指属于个体的肿瘤细胞，个体接受特定医药产品。肿瘤细胞能通过取癌性组织样本来获得，特别是活组织检查或手术切除。术语“异源肿瘤细胞”是指获得自肿瘤的细胞，肿瘤源自与接受特定医药产品不同的个体。使用异源细胞有可能特定获得医药产品用于治疗癌症患者，不大可能从病人获得肿瘤细胞样本。这也有可能使用标准肿瘤抗原的来源。术语“细胞裂解物”是指胞内和/或膜抗原的混合物，根据本领域技术人员已知方案通过裂解细胞获得，如机械、化学或酶裂解。此生物试剂也可以是核酸，编码至少1种抗原，抗原选自细菌、病毒、酵母、寄生虫或真菌抗原和肿瘤抗原。术语“肿瘤抗原”是指获得自肿瘤细胞的抗原，如肿瘤相关肽，特定是与I型分子相互作用并呈递给CD8 T淋巴细胞的肽。以已知的非限制方式提到下列肿瘤抗原MAGE-2、MAGE-3、MART、MUC-1、MUC-2、HER-2、GD2、癌胚抗原(CEA)、TAG-72、卵巢相关抗原OV-TL3和MOV18、TUAN、α-胎蛋白(AFP)、OFP、CA-125、CA-50、CA-19-9、肾肿瘤相关抗原G250、EGP-40(或EpCAM)、S100(恶性黑素瘤相关抗原)、p53、前列腺肿瘤相关抗原(如PSA和PSMA)以及p21ras。
因此，培养基中加入此生物试剂能获得成熟树突细胞，然后它们可活化定向抗特定抗原的T淋巴细胞。然后这些体外获得的成熟树突细胞可体内再注射。
在发明的另一个实施方案中，也能在步骤C中使用相等于L-α-溶血磷脂酰胆碱的化合物，根据与L-α-溶血磷脂酰胆碱相同的细胞作用机制，即通过相同膜受体，特定是G蛋白偶联膜受体如受体G2A、GRP4或PAF(血小板活化因子)受体，和/或经相同核受体如PPAR受体(过氧化物酶体增殖子-活化受体)它是一种作用如L-α-溶血磷脂酰胆碱的分子。因而，此等价化合物能特定作为上述受体的激动剂(如特定的O-甲基-PAF、氨甲酰基-PAF或2-O-甲基-PAF)，也可以是PAF本身。此化合物也可是PPARδ剂，如特定的L165041(Merck Research)、GW-5015616(Glaxo)或卡波前列环素(Cayman)或PPARγ拮抗剂，例如特定的双酚a乙基二环氧丙酯(Sigma)或Diclofenac。此化合物相等于L-α-溶血磷脂酰胆碱，可单独或与L-α-溶血磷脂酰胆碱协同使用。根据发明的一个较佳实施方案，L-α-溶血磷脂酰胆碱与血小板活化因子(PAF)协同使用。
发明也涉及体外活化T淋巴细胞的方法，据此A.单核细胞在合适培养基中提供，B.分化因子存在时，诱导单核细胞分化成树突细胞，
C.L-α-溶血磷脂酰胆碱加入所述培养基并获得成熟树突细胞，D.如上定义的生物试剂加入所述培养基且步骤B中所得成熟树突细胞定向抗所述生物试剂，E.根据步骤C定向抗生物试剂的成熟树突细胞接触T淋巴细胞，获得定向抗生物试剂的T淋巴细胞。
如上所述完成步骤C。因此，这种方法能体外获得定向抗特定生物试剂的T淋巴细胞，然后细胞可体内再注射到病人中，特别是免疫抑制的病人。
发明也涉及体外使树突细胞成熟的方法，据此A.未成熟树突细胞在合适培养基中提供，B.L-α-溶血磷脂酰胆碱加入所述培养基并获得成熟树突细胞。
本领域技术人员熟知树突细胞和它们不同的成熟阶段。
在步骤B中，L-α-溶血磷脂酰胆碱特定加入所述培养基，培养基中终浓度在约10和80μM间，优选在约20和60μM间，30和50μM间有利。根据发明的特定实施方案，至少1种上面定义的生物试剂也在步骤B中加入培养基。
发明也涉及一种培养基，其特征是包括L-α-溶血磷脂酰胆碱和至少1种上面定义的分化因子。
在发明的一个较佳实施方案中，培养基中L-α-溶血磷脂酰胆碱的终浓度在约10和80μM间，优选在约20和60μM间，30和50μM间有利。根据发明的特定实施方案，培养基也包括上面定义的生物试剂，试剂特定是细菌、病毒、酵母、寄生虫或真菌抗原、自体和/或异源肿瘤细胞裂解物抗原、肿瘤抗原、编码细菌、病毒、酵母、寄生虫或真菌抗原的核酸或编码肿瘤抗原的核酸。
发明也涉及使用L-α-溶血磷脂酰胆碱作为免疫系统的活化剂。术语“活化剂”是指一种分子，在药物组合物中引起药物效果或加强或完善主要药物的效果。在疫苗组合物的情况中，L-α-溶血磷脂酰胆碱然后发挥佐剂作用，刺激宿主生物体抗特定抗原的免疫反应。因此，发明涉及疫苗组合物，其特征是包括L-α-溶血磷脂酰胆碱作为免疫系统的活化剂，它然后发挥佐剂的作用，抗上面定义的生物试剂需要刺激病人的免疫反应。
根据发明的较佳实施方案，L-α-溶血磷脂酰胆碱用作免疫系统的活化剂，用于产生医药产品以治疗和/或预防细菌、病毒、真菌或寄生虫源感染或酵母引起的感染和/或产生医药产品以治疗和/或预防癌症。
对于细菌感染，特定提到葡萄球菌、分枝杆菌、奈瑟氏球菌属细菌、军团菌、沙门氏菌等引起的感染。
对于病毒感染，特定提到HIV(人免疫缺陷病毒)、肝炎病毒、麻疹病毒、风疹病毒、脊髓灰质炎病毒、黄病毒等引起的感染。
对于真菌感染，特定提到曲霉病、念球菌病等。
对于寄生虫感染，特定提到疟疾、利什曼病等。
术语“癌症”是指细胞异常增殖引起的所有疾病，尤其以非限制的方式是黑素瘤、淋巴瘤、白血病，肾、脑、结肠、前列腺、直肠、胰腺、卵巢、肺、肝和乳癌，选自角质瘤(keratinomas)、癌和黑素瘤的皮肤癌。
根据发明的医药产品可以药物组合物形式提供，联合至少1种本领域技术人员熟知的药学上可接受赋形剂。在根据发明的药物组合物中，对于口、舌下、皮下、肌肉内、静脉内、局部、气管内、直肠或经皮施用，L-α-溶血磷脂酰胆碱可以单位施用形式或作为与常规药物支持物的混合物施用，例如片剂、凝胶胶囊、口服溶液等形式，或者对于直肠施用以栓剂形式，对于肠胃外施用特定以可注射溶液形式，特别是静脉内、皮肤内或皮下注射等，根据本领域技术人员熟知的常规操作。对于局部应用，L-α-溶血磷脂酰胆碱能用于乳膏、油膏、洗剂或洗眼液(eyelotion)。
当固体组合物以片剂形式制备时，L-α-溶血磷脂酰胆碱混合药学上可接受赋形剂，赋形剂也称为药物载体如明胶、淀粉、乳糖、硬脂酸镁、滑石、阿拉伯树胶等。片剂可用蔗糖、纤维素衍生物或其它合适物质包衣。也能处理它们使其活性延长或延迟并连续释放预定量的L-α-溶血磷脂酰胆碱。也可能获得凝胶胶囊制品，通过混合L-α-溶血磷脂酰胆碱和稀释剂并将混合物注入软和硬凝胶胶囊。同样可能获得糖浆形式的制品或以滴剂形式施用，其中L-α-溶血磷脂酰胆碱与甜味剂、防腐剂如特定的对羟基苯甲酸甲酯(methylparaben)和羟苯丙酯、以及合适的香料增强剂或染料一起存在。可分散于水的粉末或颗粒可包含L-α-溶血磷脂酰胆碱作为与分散剂或润湿剂或悬浮剂的混合物，这些对本领域技术人员熟知。对于肠胃外施用，使用水悬浮液、等渗盐水溶液或无菌且可注射溶液，溶液包含药理学上相容的分散剂或润湿剂，例如特定的丙二醇或丁二醇。
发明也涉及使用至少1种L-α-溶血磷脂酰胆碱的抑制剂以生产医药产品，用于预防炎症和/或抗炎症疾病和/或自身免疫疾病。术语“L-α-溶血磷脂酰胆碱的抑制剂”用于指一种分子(或一组分子)，它阻断L-α-溶血磷脂酰胆碱的发炎和/或免疫刺激剂活性，特别是通过L-α-溶血磷脂酰胆碱阻断成熟树突细胞分化。它也指效果与L-α-溶血磷脂酰胆碱相反的模件，通过特定调节PPARδ/PPARγ比例。通过指示提到脂质乳剂，包括甘油三酯、磷脂和甘油如特定的Intralipid、类脂E-80、PPARγ激动剂。PPARγ激动剂对本领域技术人员熟知，可以非限制的方式提到噻唑烷二酮类分子，如特定的环格列酮、托利他唑、吡格列酮、罗西格列酮等。因此这种抑制剂能体内使用以生产医药产品，用于减小炎症反应，特定是关节的炎症反应或尤其在移植期间。根据发明的较佳实施方案，L-α-溶血磷脂酰胆碱的抑制剂是脂质乳剂，包括甘油三酯、磷脂和甘油。甘油三酸酯优选从植物油中提取，如特定的大豆油。甚至更优选脂质乳剂包括15到25％的大豆油，优选20％大豆油、0.5到1.5％的卵磷脂，优选1.2％、1.8到2.6％的甘油，优选2.2％甘油。根据发明的另一个较佳实施方案，抑制剂是上面定义的PPARγ激动剂。
对于炎症疾病，特定提到肉瘤病、狼疮、类风湿性关节炎、脊椎关节炎、葡萄膜炎等。
对于自身免疫疾病，特定提到1型糖尿病、多发性硬化、牛皮癣、接触性超敏感性、类风湿性关节炎、脊椎关节炎等。


图1显示滴定曲线，吸光度作为一批小鼠的血清稀释对数的函数，给予小鼠具有鸡蛋溶菌酶(HEL，1mg/ml)的LPC或单独HEL。
下列实施例通过例子方式给出，实质上没有任何限制。它们有可能对发明的理解更透彻。
实施例1-培养的单核细胞在L-α-溶血磷脂酰胆碱(LPC)存在或缺乏时分化成树突细胞单核细胞的分离、培养和起始分化-单核细胞从人外周血中分离，首先通过在Ficoll-Hypaque中密度梯度离心(620g；20分钟)，接着在50％Percoll溶液中二次离心(770g；20分钟)。然后单核细胞通过免疫磁性分离(Dynal，Oslo，Norway)来纯化，使用抗CD 19(hydridoma 4G7)(Becton Dickinson，Francklin Lakes，NJ，USA)、抗CD3(OKT3，美国模式培养物保藏所，Rockville，MD)和抗CD56(NKH1，BeckmanCoulter，Fullerton，CA，USA)单克隆抗体的混合物。由此获得的单核细胞然后纯化到至少90％，如缺乏CD1a标记且存在CDl4标记所示。用40ng/ml重组人GM-CSF(粒细胞巨噬细胞-刺激因子)和250U/ml重组人白介素IL-4起始单核细胞分化成树突细胞。
单核细胞培养于RPMI 1640培养基(Life Technologies，Rockville，MD，USA)，培养基添加2mM谷氨酰胺(Life Technologies)、10mM Hepes(Life Technologies)、40ng/ml庆大霉素(Life Technologies)和10％脂蛋白耗尽的胎牛血清(LPDS，Sigma，St Quentin-Fallavier，France)。
应注意此例子中所示培养基是LPDS培养基。比较结果可用其它培养基获得，如FCS培养基即含10％非脂蛋白耗尽的胎牛血清，或可用本领域技术人员已知的任何合成培养基获得。
用LPC处理单核细胞—单核细胞分化开始后5天，40μM LPC(L-α-溶血磷脂酰胆碱；Sigma，St Quentin Fallavier，France)加入培养基24小时。对照细胞也在培养基中缺乏LPC时获得。
然后获得“对照”细胞和“LPC”细胞。
实施例2-根据实施例1得到的细胞的表型此分析中所用细胞是根据实施例1所述操作在分化的第6天获得。
“对照”和“LPC”细胞的表型通过FACSCalibur(Becton Dickinson，FrancklinLakes，NJ，USA)上的流式细胞仪分析，使用FITC(异硫氰酸荧光素)-缀合的抗CD14、抗HLA-DR和抗CD80以及PE(藻红蛋白)-缀合的抗CD1a、抗CD83、抗CD86和抗CD40(Beckman Coulter)。根据现有技术水平，单核细胞优选具有CD14+CD1a-表型，未成熟树突细胞优选具有CD14-CD1a+CD86-表型，成熟树突细胞优选具有CD14-CD1a中间-CD86+表型。
所得结果在表1中给出。
表1-LPC缺乏(对照)或存在时CD83、HLA-DR和CD86标记的表达
LPC存在时，单核细胞分化开始后获得的“LPC”细胞表现的表型可与成熟树突细胞相比，尤其通过与“对照”细胞的表型相比如CD86标记的诱导和HLA-DR增加所证明。
实施例3-根据实施例1得到的细胞的内化能力此分析中所用“对照”和“LPC”细胞是根据实施例1所述操作在分化的第6天获得。这些细胞在37℃培养·使用1mg/ml FITC-T70-葡聚糖(Sigma)30分钟以通过内吞估计这些细胞内化的能力，·使用1mg/ml荧光黄(参考L0259，Sigma，St Quentin-Fallavier，France)以通过胞饮估计这些细胞内化的能力，·使用羰酸盐修饰的黄绿FluoSpheres(商品名，0.45μm，Molecular Probes，Leiden，The Netherlands)3小时以通过大胞饮估计这些细胞内化的能力。
内化用冷PBS缓冲液在冰上终止，缓冲液含0.1％BSA(牛血清白蛋白)和0.05％NaN3。“对照”和“LPC”细胞在4℃用此相同缓冲液洗且通过FACSCalibur(商品名，Becton Dickinson)定量荧光。
如表2所示，与缺乏LPC时分化的对照细胞相比，通过内吞、胞饮和大胞饮的内化能力由LPC在单核细胞分化的第5天加入培养基而大大减少。
表2-LPC缺乏(对照)或存在时分化的单核细胞通过内吞、胞饮和大胞饮的内化能力
内化能力减小是成熟树突细胞的特征之一。这些结果显示存在LPC时，单核细胞分化成成熟树突细胞的倾向强。
实施例4-根据实施例1得到的细胞刺激T淋巴细胞的能力此分析中所用“对照”和“LPC”细胞是根据实施例1所述操作在分化第6天后获得。
原初同种异型T淋巴细胞从人外周血中分离。外周血单核细胞在Ficoll-Hypaque存在时通过密度梯度离心(600g；20分钟)分离。在Percoll梯度上去除单核细胞后，外周血淋巴细胞在致密部分中发现。T淋巴细胞通过免疫磁性分离来纯化，使用抗CD19(抗体4G7)(Becton Dickinson，Francklin Lakes，NJ，USA)、抗CD16(抗体3G8)、抗CD56(抗体NKH1)、抗血型糖蛋白A(抗体11E4B7.6)和抗CD14(抗体RMPO52)的混合物，单克隆抗体由Beckman Coulter出售。
纯化的T淋巴细胞培养于有“对照”或“LPC”细胞的平底96孔培养板。
2×105个T细胞培养于200μ1培养基中，根据1∶5、1∶10或1∶20的LPC/T细胞比例(DC/LT比例)存在或缺乏时分化的单核细胞。4天后，50μl培养物上清用于确定IL-2(白介素2)和γIFN(γ干扰素)的分泌，使用ELISA试剂盒(Endogen，Woburn，MA，USA)。
如表3所示，与对照结果(“对照”细胞)相比，通过根据树突细胞/T淋巴细胞比例(DC/LT比例)常规表达的T淋巴细胞分泌的IL-2和γIFN被源自单核细胞分化的细胞大幅刺激，单核细胞分化开始后5天存在加入的LPC(“LPC”细胞)。
表3-LPC缺乏(对照)或存在时通过分化的单核细胞诱导T淋巴细胞对IL-2和γIFN分泌的刺激
这些结果显示存在LPC时分化的单核细胞刺激同种异型T淋巴细胞的能力增加，这是成熟树突细胞的一个特征。通过指示获得可比较的结果，其中LPC溶于乙醇或以脂质乳剂形式。
实施例5-根据实施例1得到的细胞的性质与氧化LDLs存在时分化的单核细胞得到的成熟树突细胞比较此例子的目的是证明LPC存在时参与单核细胞分化成成熟树突细胞的作用机制可能不同于氧化LDLs存在时参与单核细胞分化成成熟树突细胞的作用机制(Perrin-Cocon等，The Journal of Immunology，1673785-3891，2001)。
在此例子中，所用细胞是实施例1获得的“对照”和“LPC”细胞以及如科学出版物中所述获得的“LDLox”细胞(Perrin-Cocon等，The Journal ofImmunology，1673785-3891，2001)，即分化开始后5天存在氧化LDLs加入培养基时，培养的单核细胞分化之后。
发明者研究氧化LDLs对单核细胞分化成成熟树突细胞作用的抑制剂是否也抑制LPC对单核细胞分化成成熟树突细胞的作用。
因此，Intralipid溶液(50μg/ml磷脂，Fresenius Kabi，Sevres，France)或实质上是脂质的合成分子的溶液(类脂E-80，类脂Ag，Ludwigshafen，Germany，50μg/ml磷脂)在分化的第5天加入培养基。这些抑制剂存在时通过“LPC”和“LDLox”细胞表达的CD86根据实施例2所述操作分析，结果在表4中列出。
表4-通过LPC和LDLox细胞、Intralipid和类脂E-80对CD86表达的抑制(以％)
加入Intralipid抑制单核细胞分化成成熟树突细胞，以类似的方式通过氧化LDLs和LPC方法(改为80％抑制作用)。
另一方面，令人惊讶的是，当单核细胞在氧化LDLs存在时培养，加入类脂E-80诱导81％抑制CD86的表达，尽管当单核细胞在LPC存在时培养，此抑制仅为24％。
这些结果提示，LPC对单核细胞分化成成熟树突细胞的作用机制不同于氧化LDLs的作用机制。
实施例6-LPC存在时参与单核细胞分化成成熟树突细胞的细胞机制为进一步探索LPC在单核细胞分化成成熟树突细胞中的细胞作用机制，发明者研究了可能参与的受体。
开始，为确定参与LPC在单核细胞分化成成熟树突细胞中作用的受体是否属于G蛋白偶联受体的家族，已知阻断Gi蛋白的PTX(百日咳毒素；100ng/ml)加入培养基3小时。然后改变培养基且如实施例1所述加入LPC。
表5所列结果显示，用PTX预培养的单核细胞阻断LPC诱导的CD86增加，提示LPC的作用包括Gi蛋白偶联受体。
(例16)在1L玻璃制烧杯中，放入228.4g的FMA、30.9g的StA、18.5g的35DPBI、9.6g的PEO-25、2.8g的PEPP-33、2.8g的STMAC、447.5g的离子交换水、123.5g的DPG、2.2g的nDSH，与例1同样制得混合液。
用制得的混合液，与例9同样制得乳化液。将695.7g的制得的乳化液放入不锈钢制1L高压釜中，冷却至30℃以下。添加聚合引发剂的VA061的2.4g和乙酸的1.9g后，氮置换气相。然后，压入氯乙烯(无Tm、Tg98℃，以下记为VCM)24.0g，一边搅拌，一边在55℃下进行聚合反应12小时，制得固体成分浓度35.9％的乳浊液。
(例17-20)以表3所示的量(单位g)来使用表3所示的单体以外，与例16同样进行聚合反应，制得例17-19的乳浊液。与例16同样制得例20的乳浊液。
表3
(试验布的制成)用例1-29制得的乳浊液，以下述方法制造试验布A，对防水性、防油性和洗涤耐久性进行评价。对于例20同样进行评价。结果如表6所示。
用离子交换水进行稀释以使制得的乳浊液的固体成分浓度为1.0质量％，形成试验液A。将试验液A浸渍涂布在完成染色的聚酯布或者未染色的棉横罗纹布上，挤干使其湿涂层量分别为90质量％、70质量％。将其在110℃下干燥90秒钟后，将170℃干燥60秒钟的试验布作为试验布A。
用例9、例16制得的乳浊液，用下述方法制得试验布B，进行摩擦耐久性评价。对于例10-15、例17-20制得的乳浊液，用下述方法制得试验布B，同样激PPARδ的活性。
然后发明者使用PPARγ激动剂环格列酮。环格列酮(Sigma，50μM)溶液在单核细胞分化第5天加入培养基，如实施例1所述，在LPC(40μM，2小时)溶液加入前15分钟。所得细胞是“LPC+环格列酮”细胞。但在缺乏LPC时，“环格列酮”细胞根据相同操作获得，且在缺乏环格列酮时，如实施例1所述获得“LPC”细胞。
PPARγ和PPARδ转录因子的活性通过上述凝胶移位技术在这些细胞中测量。
表7-环格列酮阻断PPARγ的失活并减少LPC诱导的PPARδ增加
这些结果表明，活化PPARγ的环格列酮抑制LPC对PPARγ和PPARδ的作用，结果阻断LPC诱导的树突细胞成熟。
然后分析这些细胞(“对照”、“环格列酮”和“LPC+环格列酮”细胞)刺激T淋巴细胞(LT)的功能性能力。这些细胞如实施例4所述在纯化的同种异型T淋巴细胞存在时培养。γIFN的分泌如实施例4所述测量。
表8-混合的白细胞反应通过T淋巴细胞测量树突细胞诱导的γIFN的分泌
这些结果都强调PPARs在LPC诱导的树突细胞成熟中的重要作用以及PPARγ/PPARδ比例在生成功能上成熟的树突细胞中的重要性。此比例由LPC和环格列酮调节。
实施例7-等同于LPC的化合物存在时单核细胞分化成成熟树突细胞发明者确定等同于LPC的化合物即参与经相同膜或胞内受体的相同细胞作用机制，是否也能诱导单核细胞分化成成熟树突细胞。
为此，发明者研究了PAF加入培养基是否能增加LPC对单核细胞分化成成熟树突细胞的作用。
因此，PAF(Sigma，5μM)溶液在单核细胞分化的第5天加入培养基。PAF存在或缺乏时所得“对照”细胞和“LPC”细胞的CD86表达根据实施例2所述操作分析，结果在表9中列出。
表9-PAF存在或缺乏时“对照”和“LPC”细胞的CD86标记的表达(意指荧光强度)
这些结果提示PAF单独诱导CD86的轻微超表达，不像LPC，LPC诱导CD86的表达增加47％另一方面，重要的是指出PAT与LPC协同作用，因为2种化合物的作用诱导CD86的表达增加1200％。
为加强PAF受体参与的想法，发明者研究了此受体拮抗剂对单核细胞通过LPC方法分化成成熟树突细胞的作用。
因此，PAF拮抗剂BN52021(Biomol，Plymouth Meeting，USA，100μM)溶液在单核细胞分化的第5天加入培养基。BN52021存在或缺乏时所得“对照”和“LPC”细胞的CD86表达根据实施例2所述操作分析，结果在表10中列出。
表10-拮抗剂BN52021存在或缺乏时“LPC”细胞的CD86表达
这些结果提示，LPC作用显然包括PAF受体，也暗示LPC的作用可能包括其它受体。
通过指示，发明者也证明在由氧化LDLs诱导的单核细胞分化成成熟树突细胞的第5天培养基中加入拮抗剂BN52021诱导100％抑制氧化LDLs的作用，这里再次提示LPC和氧化LDLs的作用机制不同。
实施例8-通过LPC体内刺激抗抗原的免疫反应此实施例的目的是显示LPC是一种分子，它是免疫系统的佐剂且可用于免疫方面以增加抗抗原的特异T反应。
LPC是炎症产物—在此例子中，100到500nmol LPC溶液溶于50μl PBS，在第0天注入BALB/c小鼠(Charles River Laboratories)的跖爪垫。跖爪垫在注射前和后用测微计测量，直到第10天，并与注射PBS(50μl)所得“对照”小鼠的跖爪垫相比较。炎症强度通过足增厚反映。最大增厚在第1天注射后24小时观察到。
表11-24小时后由LPC-增厚足诱导的跖爪垫炎症(以mm)
这些结果显示LPC诱导炎症取决于注射的剂量。
为显示LPC诱导成熟和树突细胞体内移至引流的淋巴结，在应用1∶1邻苯二甲酸二丁酯/丙酮中1.5％FITC(Sigma)溶液前10分钟，LPC溶液(0.1M于邻苯二甲酸二丁酯中)应用到BALB/c小鼠(Charles River Laboratories)的耳皮肤。此荧光标记被皮肤的树突细胞皮肤吸收。24小时后，取出耳廓和上颚淋巴结且细胞置于悬浮液中。细胞悬浮液通过甲泛葡胺(Sigma)梯度离心在树突细胞中富集。细胞用识别主要组织相容性复合体(MHC)I型分子的抗体(Pharmingen)标记并通过流式细胞仪分析以能定量表达MHC II型分子且含FITC的大细胞(树突细胞)的百分比。这些细胞是呈递细胞，在外周中吸收FITC并移至淋巴结。
表12-通过LPC刺激树突细胞迁移
这些结果显示应用LPC刺激皮肤的树突细胞移至引流的淋巴结。
LPC刺激特异于共注射可溶性抗原的T反应。溶于PBS的LPC(250或500nmol在50μl中)混合鸡蛋溶菌酶(HEL，50μg)且此混合物注入BALB/c小鼠的跖爪垫。7天后，取出淋巴结且它们的细胞体外再刺激三次，在含30μM HEL抗原的培养基中或没有HEL。3天后，T淋巴细胞增殖通过16小时掺入磨碎的胸苷来测量。
表13-HEL特异T细胞的增殖(CPM中掺入磨碎的胸苷；三次的平均值)
这些结果显示LPC与抗原共注射促进体内活化特异于此抗原的T淋巴细胞。
LPC刺激生成抗共注射可溶性抗原的特异抗体。溶于PBS的LPC(350nmol在50μl中)混合鸡蛋溶菌酶(HEL，1mg/ml)且此混合物注入BALB/c小鼠的跖爪垫。“HEL+LPC”的一批小鼠在2只后足的爪垫接受50μl此混合物。“HEL”的一批小鼠在2只足中接受50μl HEL溶液(PBS中1mg/ml)。15天后，在两胁腹给予皮下强化注射。“HEL+LPC”的一批在各胁腹接受100μl LPC(5mM)溶液和PBS中的HEL(1mg/ml)溶液。“HEL”的一批在各胁腹接受100μl PBS中的HEL(1mg/ml)溶液。2周后，从小鼠中取血，通过相对于标准IgG溶液范围的ELISA测定特异于HEL抗原的IgGs。图1所示滴定曲线中吸光率(Abs)作为血清稀释对数的函数。
这些结果提示，LPC与抗原共注射促进免疫系统的活化且诱导特异于抗原的抗体合成，而单独注射抗原不诱导反应。LPC诱导抗抗原的体液反应，证明其佐剂能力。
LPC可诱导体内CD8+T淋巴细胞反应。在此例子中，使用的测试用于对半抗原的延迟接触超敏性。在此模型中，BALB/c小鼠通过应用半抗原DNFB(1-氟-2，4-二硝基苯，1∶1橄榄油/丙酮中的0.5％溶液)到背部来致敏。5天后，DNFB的非刺激剂量(1∶1橄榄油/丙酮中的0.2％溶液)应用到左耳，而右耳接受溶剂。在此诱发阶段，募集了特异于半抗原蛋白的CD8+T淋巴细胞并渗透耳，分泌γIFN和生成水肿。
“对照”批的小鼠单独用DNFB致敏且另一批(“LPC”小鼠)接受500nmol LPC，这是通过在应用DNFB 10分钟前应用20μl LPC的乙醇溶液到背部皮肤。5天后，2批以用于诱发阶段的相同方法处理，此应用后48小时用测微计测量耳增厚。
表14-测量耳水肿
这些结果显示，致敏期间在半抗原前10分钟应用LPC增加第2次应用半抗原(诱发)期间诱导的水肿。这意味着LPC刺激CD8+T淋巴细胞延迟的反应。
实施例9-脂质乳剂如Intralipid对单核细胞分化成成熟树突细胞的作用由于实施例5显示脂质乳剂如Intralipid阻断LPC诱导的成熟树突细胞的生成，发明者也研究了此阻断是否来自此脂质乳剂通过抑制LPC作用的间接作用和/或来自此脂质乳剂的直接作用。
Intralipid体外调节PPARs。开始，Intralipid溶液(50μg/ml磷脂)在单核细胞分化的第5天加入培养基，根据可与实施例6所述相比的操作。细胞在与Intralipid培养后1小时、2小时或8小时收集，提取核蛋白且PPARγ和PPARδ的活性如实施例6所述确定。
表15-通过Intralipid调节进行分化的单核细胞的PPARγ和PPARδ的活性
这些结果显示Intralipid单独活化PPARγ并抑制PPARδ的活性。此Intralipid的作用与LPC的作用相反。
第二，Intralipid溶液(50μg/ml磷脂)在单核细胞分化的第5天加入培养基，在LPC溶液(40μM)加入前15分钟(“LPC+Intralipid”细胞)。“Intralipid”细胞也在LPC缺乏时获得。“LPC”细胞在Intralipid缺乏时获得。细胞在培养2小时后收集，提取核蛋白且PPARγ和PPARδ的活性如实施例6所述确定。
表16-Intralipid通过调节PPARγ和PPARδ的活性来阻断LPC诱导的成熟树突细胞的产生
Intralipid也通过调节PPARγ和PPARδ的活性来阻断LPC的作用。
Intralipid体内阻断LPC诱导的炎症和免疫反应。在此例子中，3批BALB/c小鼠抗鸡蛋溶菌酶(HEL)抗原免疫，免疫是通过注射50μl溶液到跖爪垫。“HEL”对照批接受50μg HEL，“HEL+Intralipid”批接受Intralipid(45μl)和50μg HEL(5μl 10mg/ml的溶液)的混合物。“HEL+LPC”批接受50μg HEL与溶于PBS的350nmol LPC。“HEL+LPC+Intralipid”批接受50μg HEL，HEL混合溶于45μl Intralipid的350nmol LPC。24小时后，爪垫厚度用测微计测量，并与注射前进行的测量相比。厚度差异与炎症强度成比例。
表17-Intralipid减少LPC体内诱导的炎症
这些结果显示与LPC同时注射的Intralipid减少70％LPC诱导的跖爪垫炎症。
注射后7天，取出淋巴结且它们的细胞体外再刺激三次，在含10μM HEL的培养基中或没有HEL。3天后，HEL特异的T淋巴细胞增殖通过16小时掺入磨碎的胸苷来测量。
表18-HEL特异T细胞的增殖(小鼠平均值)
这些结果显示与LPC同时注射的Intralipid阻断LPC诱导的T反应刺激。
这些结果都显示Intralipid阻断LPC诱导的成熟树突细胞产生，通过Intralipid经抑制LPC作用的间接作用，也通过Intralipid对LPC拮抗剂PPARs的直接作用。这些结果显示Intralipid单独有抗炎症作用。
这些结果都显示PPARγ/PPARδ比例在产生功能上成熟的树突细胞中的重要性。此比例由LPC调节，也由脂质乳剂如Intralipid或环格列酮反向调节。
权利要求
1.一种体外使单核细胞分化成成熟树突细胞的方法，其特征在于，A.单核细胞在合适培养基中提供，B.分化因子存在时诱导单核细胞分化成树突细胞，C.L-α-溶血磷脂酰胆碱加入所述培养基并获得成熟树突细胞。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤b中L-α-溶血磷脂酰胆碱加入所述培养基，培养基中终浓度在约10和80μM间。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤b中L-α-溶血磷脂酰胆碱在单核细胞分化的第3和第6天间加入所述培养基。
4.如权利要求1到3中任一项所述的方法，其特征在于，步骤C中至少一种生物试剂也加入培养基。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，生物试剂是细菌、病毒、酵母、寄生虫或真菌抗原、自体和/或异源肿瘤细胞裂解物抗原、肿瘤抗原、编码细菌、病毒、酵母、寄生虫或真菌抗原的核酸或编码肿瘤抗原的核酸。
6.如权利要求1到5中任一项所述的方法，其特征在于，步骤C中血小板活化因子(PAF)也加入培养基。
7.如权利要求1到6中任一项所述的方法，其特征在于，分化因子选自白介素4、GM-CSF、白介素13和TNF。
8.一种体外活化T淋巴细胞的方法，其特征在于，A.单核细胞在合适培养基中提供，B.分化因子存在时诱导单核细胞分化成树突细胞，C.L-α-溶血磷脂酰胆碱加入所述培养基并获得成熟树突细胞，D.生物试剂加入所述培养基且步骤C中所得成熟树突细胞定向抗所述生物试剂，E.根据步骤D定向抗生物试剂的成熟树突细胞接触T淋巴细胞，获得定向抗生物试剂的T淋巴细胞。
9.一种体外使树突细胞成熟的方法，其特征在于，A.未成熟树突细胞在合适培养基中提供，B.L-α-溶血磷脂酰胆碱加入所述培养基并获得成熟树突细胞。
10.一种培养基，其特征在于，所述培养基包括L-α-溶血磷脂酰胆碱和至少一种使单核细胞分化成树突细胞的因子。
11.如权利要求10所述的培养基，其特征在于，L-α-溶血磷脂酰胆碱在培养基中终浓度为约10和80μM间。
12.如权利要求10或11中任一项所述的培养基，其特征在于，它也包括生物试剂。
13.如权利要求12所述的培养基，其特征在于，生物试剂是细菌、病毒、酵母、寄生虫或真菌抗原、自体和/或异源肿瘤细胞裂解物抗原、肿瘤抗原、编码细菌、病毒、酵母、寄生虫或真菌抗原的核酸或编码肿瘤抗原的核酸。
14.如权利要求10到13中任一项所述的培养基，其特征在于，分化因子选自白介素4、GM-CSF、白介素13和TNF。
15.使用L-α-溶血磷脂酰胆碱作为免疫系统活化剂，其特征在于，用于生产医药产品以治疗和/或预防细菌、病毒、真菌或寄生虫源感染或酵母引起的感染。
16.使用L-α-溶血磷脂酰胆碱作为免疫系统活化剂，其特征在于，用于生产医药产品以治疗和/或预防癌症。
17.一种疫苗组合物，其特征在于，所述组合物包括作为免疫系统活化剂的L-α-溶血磷脂酰胆碱和一种生物试剂。
18.使用至少一种L-α-溶血磷脂酰胆碱的抑制剂，其特征在于，所述抑制剂用于生产医药产品以预防炎症和/或抗炎症疾病和/或自身免疫疾病，其中抑制剂是脂质乳剂，包括甘油三酯、磷脂和甘油。
19.如权利要求18所述的使用，其特征在于，脂质乳剂包括15到25％的甘油三酯、0.5到1.5％的磷脂和1.8到2.6％的甘油。
20.使用至少一种L-α-溶血磷脂酰胆碱的抑制剂，其特征在于，所述抑制剂用于生产医药产品以预防炎症和/或抗炎症疾病和/或自身免疫疾病，其中抑制剂是PPARγ激动剂。
全文摘要
发明涉及单核细胞体内分化成成熟树突细胞的方法，其中a)单核细胞在适当培养基中提供，b)存在分化因子时，单核细胞分化成树突细胞，c)L－α－溶血磷脂酰胆碱加入培养基并获得成熟树突细胞。发明也涉及在药物生产中使用至少1种L－α－溶血磷脂酰胆碱的抑制剂，药物用于预防炎症和/或抗炎症疾病和/或自身免疫疾病。
文档编号A61P31/00GK1703504SQ03805396
公开日2005年11月30日 申请日期2003年3月7日 优先权日2002年3月11日
发明者V·洛特奥, P·安德里 申请人:比奥麦利尤股份有限公司, 国家健康及医学研究院