专利名称：高效液相色谱法检测蛋黄卵磷脂中磷脂酰胆碱的制作方法
技术领域：
本方法属于功能因子检测方法领域，涉及采用高效液相色谱法检测蛋黄卵磷脂中磷脂酰胆碱的方法。
背景技术：
卵磷脂是一种含磷的极性脂类物质，通常指含磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇等不同磷脂组分的混合物。卵磷脂具有重要的营养保健功能。它是生物膜的重要成分， 具有延缓衰老，调节脂肪代谢，预防心脑血管疾病，提高大脑活力，提高免疫力等作用，广泛的应用于食品、医药、化妆品、饲料、涂料、农业生产等领域。磷脂酰胆碱是卵磷脂中最重要的功能成分。目前对于大豆卵磷脂的研究较多，蛋黄来源的卵磷脂近年来才由于其含量高、 氧化稳定性较好而逐渐引起人们的重视。蛋黄卵磷脂的检测方法主要有丙酮不溶物法，测磷法，紫外分光光度法，但都不能准确的检测出其主要功能成分磷脂酰胆碱的含量。高效液相色谱法是目前分离磷脂各组分，检测磷脂酰胆碱含量最为广泛研究和应用的方法，分为正相色谱法和反相色谱法。常用流动相主要有氯仿/甲醇/氨水、正己烷 /异丙醇/水、乙腈/甲醇/水、乙腈/甲醇/磷酸等三元体系。但由于磷脂是一种脂类物质，由不同种类的脂肪酸以及双键结构构成，即使同是磷脂酰胆碱分子也包括不同的分子种类，在液相分析时常会出现峰的延展、拖尾现象，甚至会将磷脂酰胆碱组分分出好几个峰，给定量带来了困难。而且目前常用的流动相体系也比较复杂。流速大多为lml/min。从磷脂酰胆碱标准曲线的线性范围来看，使用紫外检测器时其最低限浓度大多为几百微克每毫升，所需标准品量较大。
发明内容
本发明要解决的技术问题是弥补现有磷脂酰胆碱的液相分析方法中流动相体系组成复杂，流速较大，使用紫外检测器时所需标准品量较大的不足，本发明提供一种高效液相色谱与紫外检测器联用的方法对蛋黄卵磷脂中的磷脂酰胆碱进行定性和定量。该方法流动相采用甲醇/乙酸二元体系，组成更加简单，加入的乙酸溶液改善了磷脂酰胆碱的峰形， 有效抑制了严重的拖尾现象。且流速较低，为0.5ml/min，在保证出峰时间较快的前提下 (14min以内)减少了流动相溶剂的使用量，降低了成本。在高效液相-紫外检测器系统环境中确定了磷脂酰胆碱的最大吸收波长为200nm。磷脂酰胆碱标准曲线线性范围是10 μ g/ ml 160μ g/ml。经方法学验证性试验，证明本方法精密度、稳定性良好，准确度较高。本发明所采用的技术方案是(1)、分析柱与流动相的选择C18色谱柱作为应用最为广泛的液相分析柱之一，也曾作为本发明的考察对象， 以甲醇/乙腈/水体系作为流动相分离检测磷脂酰胆碱，结果磷脂酰胆碱标准品被分离出好几个峰，不利于定量。后考察安捷伦ZORBAX RX-SIL硅胶柱作为分析柱，首先考察正己烷-异丙醇体系作为流动相，标准品不出峰，后改为甲醇作为流动相，标准品出峰，但由于其具有许多不同的分子种类，因此出现严重的拖尾现象。向甲醇中尝试加入一定量的 0. 2mol/L的乙酸溶液后，可改善峰形。而乙酸的量太小时，峰形改善不明显，乙酸的量太大时，虽峰形明显改善，但发生基线向上漂移现象，因此最后选择加入3. 75%的乙酸水溶液， 即甲醇与乙酸溶液的体积比为96. 25 3. 75，此时峰形与基线的效果最理想。如
图1所示。(2)检测波长的确定根据文献记录，磷脂酰胆碱在不同溶液中的紫外最大吸收波长在210nm以内。尤其集中在204nm 206nm。为避免高效液相与紫外检测器系统与独立的紫外检测器效果不同，本发明摒弃预先用独立的紫外检测器扫描磷脂酰胆碱的最大吸收波长的做法，而直接在高效液相与紫外检测器系统中根据磷脂酰胆碱标准品响应值的大小来筛选其最大吸收波长。从198nm到206nm范围内，在每个纳米波长下测定其峰面积和峰高响应值，结果显示在200nm下磷脂酰胆碱峰面积和峰高响应值都达到最大。如图2、图3所示，因此确定磷脂酰胆碱的检测波长为200nm。(3)流动相流速的选择考察了流速从0. 4ml/min到1. Oml/min范围内磷脂酰胆碱出峰情况的变化。结果表明流速的大小对峰形无影响，只对出峰快慢有影响，流速大则出峰快，流速小则出峰慢。 选择较小的流速0. 5ml/min作为技术参数，既节省了溶剂使用的成本，且保证了出峰时间较快(14min以内)。(4)标准曲线的制作以峰面积为指标，采用外标法测定卵磷脂样品中磷脂酰胆碱含量。准确吸取 400 μ g/ml的磷脂酰胆碱标准溶液0. 25、1、2、3、細1，分别置于五个IOml的容量瓶中，并用色谱纯甲醇定容，得到浓度分别为10、40、80、120、160μ g/ml的磷脂酰胆碱标准系列溶液。 分别将其在已确定的色谱条件下进样，测定峰面积。以磷脂酰胆碱标准系列溶液浓度为横坐标，以响应的峰面积值为纵坐标，绘制峰面积-浓度曲线，如图4所示，得到的线性回归方程为y = 17996x-53820，相关系数R值为0. 9986。(5)方法学验证性试验及检出限和定量限的计算精密度的考察，将120μ g/ml的磷脂酰胆碱标准溶液重复进样6次，统计分析，RSD 值为1. 1269%,如表1所示。稳定性的考察，将120 μ g/ml的磷脂酰胆碱标准溶液分别在O、 2、4、8、1 进样，统计分析，RSD值为3. 0261%，如表2所示。准确度的考察，进行加标回收率试验，精确吸取3份各0. 2ml已测得磷脂酰胆碱浓度的卵磷脂样品液，置于6个IOml的容量瓶中，向其中分别加入80、120、160 μ g/ml磷脂酰胆碱标准液各6ml，用色谱纯甲醇定容， 进样检测，回收率为93. 5701% 104. 12 %，平均回收率为97. 5989%，如表3所示。检出限和定量限的计算，检出限为3倍信噪比，定量限为10倍信噪比。选取一段时间计算噪音峰面积平均值，测定10 μ g/ml磷脂酰胆碱标品的峰面积，通过此时的信噪比，换算成3倍和10 倍信噪比时的磷脂酰胆碱标品浓度，即分别为检出限和定量限。测得检出限为0. 5904 μ g/ ml，定量限为1.9680 μ g/ml，如表4所示。表1方法精密度结果
权利要求
1.一种磷脂酰胆碱的检测方法，采用高效液相色谱法与紫外检测器联用的方法对蛋黄卵磷脂中的磷脂酰胆碱进行定性和定量，其特征是以甲醇/乙酸二元体系为流动相进行等度洗脱，流速为0. 5ml/min，紫外检测波长为200nm，磷脂酰胆碱标准曲线的线性范围为 10 μ g/ml 160 μ g/ml。
2.根据权利要求1所述的磷脂酰胆碱的检测方法，其特征是采用ZORBAXRX-SIL纯硅胶色谱柱作为分析柱时，流动相为甲醇和0. 2mol/L的乙酸水溶液，二者的体积比例为 96. 25 3. 75。
3.根据权利要求1所述的磷脂酰胆碱的检测方法，其特征是流动相的流速为0.5ml/min。
4.根据权利要求1所述的磷脂酰胆碱的检测方法，其特征是在高效液相_紫外检测器系统中，磷脂酰胆碱的最大吸收波长为200nm。
5.根据权利要求1所述的磷脂酰胆碱的检测方法，其特征是本方法采用外标法定量， 磷脂酰胆碱标准曲线的线性范围是10 μ g/ml 160 μ g/ml。
全文摘要
一种磷脂酰胆碱的检测方法，采用高效液相色谱与紫外检测器联用的方法对蛋黄卵磷脂中的磷脂酰胆碱进行定性和定量，其特征是采用安捷伦公司ZORBAX RX-SIL(4.6mm×250mm，5μm)硅胶柱为分析柱，以甲醇/乙酸为流动相进行等度洗脱，其他洗脱条件为紫外检测波长为200nm，柱温30℃，进样量15μl，流速为0.5ml/min。该方法流动相采用二元体系，组成更加简单，加入的3.75％的乙酸溶液改善了磷脂酰胆碱的峰形，有效抑制了严重的拖尾现象。且流速较低，为0.5ml/min，节约了溶剂的使用成本。出峰时间较快，在14分钟以内。磷脂酰胆碱标准曲线的线性范围是10μg/ml～160μg/ml。经方法学验证性试验，证明本方法精密度、稳定性良好，准确度较高。
文档编号G01N30/36GK102156174SQ20111011614
公开日2011年8月17日 申请日期2011年5月6日 优先权日2011年5月6日
发明者刘静波, 宫新统, 常皓 申请人:吉林大学