专利名称：基于酶循环的α－甲基酰基辅酶A消旋酶的检定法的制作方法
技术领域：
本发明一般涉及α-甲基酰基-辅酶A消旋酶检测。特别是，本发明提供用于检定样品中的α-甲基酰基-辅酶A消旋酶的方法和试剂盒。
背景技术：
α-甲基酰基-辅酶A消旋酶(AMACR)是一种充分表征的酶，其在膳食的支链脂肪酸和C27-胆汁酸中间体的过氧化物酶体β-氧化中起关键作用。Ferdinandusse等，J.Lipid Res.411890-1896(2000)。AMACR催化(R)-α-甲基-支链脂肪酰基-辅酶A酯到它们的(S)-立体异构体的转化。Cuebas等，Biochem.J.363801-807(2002)；Schmitz等，Eur.J.Biochem.231815-822(1995)。将AMACR从人的肝脏作为47-kDa单体分离出并且主要位于过氧化物酶体中，在线粒体中检测到少量。Schmitz等，Eur.J.Biochem.231815-822(1995)；Schmitz等，Eur.J.Biochem.222313-23(1994)。从人的肝脏分离出的AMACR的等电点是pH6.1，并且所述酶在pH7和pH8之间是最佳活性的。已经证明AMACR的升高表达是几种类型癌症的生物标志物，所述癌症诸如前列腺的、结肠直肠的、卵巢的、乳房的、膀胱的、肺的、肾细胞癌、淋巴瘤、和黑素瘤。Rubin等，JAMA 2871662-1670(2002)；Luo等，Cancer Res.622220-2226(2002)；Sreekumar等，J Natl.Cancer Inst.96834-843(2004)。研究也显示α-甲基酰基-辅酶A消旋酶的酶活性在前列腺的癌症组织样品中升高。Kumar-Sinha等，Am.J.Pathol.164787-93(2004)。PCT WO 02/27324和美国专利公布2002/0123081描述了，通过测量AMACR的表达或活性，用于识别患有发展中的前列腺癌症或处于所述癌症危险中的患者和患有由于前列腺癌症转移至另一个组织而产生的发展中的癌症或处于所述癌症危险中的患者的方法。已经报道了用于检定AMACR的酶活性的数种方法。Schmitz等(Eur.J.Biochem.222313-23(1994))描述了用于AMACR酶活性的辐射测量的检定，其中将2-甲基[2-(3)H]酰基-辅酶A用作底物。Veldhoven等(Biochem.Biophys.Acta 134762-68(1997))描述了用于AMACR的备选酶检定法，其中将AMACR与2R-甲基-十五烷酰-辅酶A结合。将反应产物，2S-异构体，用过量加入的氧化酶(姥鲛烷酰基辅酶A氧化酶)去饱和，导致过氧化氢的产生，在适合的氢供体的存在下通过过氧化物酶监控。然而，还需要可靠的和灵敏的用于检定样品中AMACR酶活性的方法(例如，用于诊断癌症)。
发明简述本发明提供用于检定样品中α-甲基酰基-辅酶A消旋酶的方法，所述方法包含a)将推测含有α-甲基酰基-辅酶A消旋酶的样品与(2R)-2-甲基酰基-辅酶A接触而产生(2S)-2-甲基酰基-CoA；b)在(2S)-2-甲基酰基-辅酶A转化酶和氧化形式的第一电子受体存在下，将来自步骤a)的如果产生的(2S)-2-甲基酰基-辅酶A转化成反式-2，3-脱氢酰基-辅酶A，由此产生第一电子受体的还原形式；在反式-2，3-脱氢-辅酶A转化酶和还原形式的第二电子受体存在下，将所述反式-2，3-脱氢-辅酶A转化回(2S)-2-甲基酰基-辅酶A而形成循环反应体系，由此产生第二电子受体的氧化形式；其中所述第一电子受体和第二是不同的；和c)评定所述循环反应体系中第一电子受体还原或氧化形式或第二电子受体还原或氧化形式的浓度变化，由此确定样品中α-甲基酰基-辅酶A消旋酶的存在、不存在和/或数量。在一些实施方案中，(2R)-2-甲基酰基-辅酶A是(2R)-2-甲基-支链的酰基-辅酶A，酰基的链长从C(4)至C(30)，从C((8))至C(25)，或从C(10)至C(25)。在一些实施方案中，(2R)-2-甲基酰基-辅酶A是(2R)-姥鲛烷酰-辅酶A。在一些实施方案中，(2R)-2-甲基酰基辅酶A是(25R)-3α，7α，12α-三羟基-5β-胆甾烷酰-辅酶A。在一些实施方案中，首先将(2S)-2-甲基酰基-辅酶A转化酶和氧化形式的第一电子受体加入样品中，并然后将所述样品与(2R)-2-甲基酰基-辅酶A、反式-2，3-脱氢酰基-辅酶A转化酶、和还原形式的第二电子受体接触。在一些实施方案中，将推测含有α-甲基酰基-辅酶A消旋酶的样品与(2R)-2-甲基酰基-辅酶A、(2S)-2-甲基酰基-辅酶A转化酶、和氧化形式的第一电子受体接触。在其它实施方案中，将推测含有α-甲基酰基-辅酶A消旋酶的样品与(2R)-2-甲基酰基-辅酶A、(2S)-2-甲基酰基-辅酶A转化酶、氧化形式的第一电子受体、反式-2，3-脱氢酰基-辅酶A转化酶、和氧化形式的第二电子受体接触。在一些实施方案中，(2S)-2-甲基酰基-辅酶A转化酶和反式-2，3-脱氢酰基-辅酶A转化酶是不同的。在一些实施方案中，(2S)-2-甲基酰基-辅酶A转化酶是酰基-辅酶A脱氢酶，并且第一电子受体选自由NAD+、NADP+、硫代-NAD+、硫代-NADP+、乙酰基-NAD+、和乙酰基-NADP+组成的组。在一些实施方案中，(2S)-2-甲基酰基-辅酶A转化酶是酰基-辅酶A氧化酶，并且第一电子受体是O2。在一些实施方案中，反式-2，3-脱氢酰基-辅酶A转化酶是反式-2-烯酰基-辅酶A还原酶，并且第二电子受体选自由NADH、NADPH、硫代-NADH、硫代-NADPH、乙酰基-NADH、和乙酰基-NADPH组成的组。在一些实施方案中，(2S)-2-甲基酰基-辅酶A转化酶和反式-2，3-脱氢酰基-辅酶A转化酶是相同的。在一些实施方案中，(2S)-2-甲基酰基-辅酶A转化酶和反式-2，3-脱氢酰基-辅酶A转化酶都是酰基-辅酶A脱氢酶。在一些实施方案中，(2S)-2-甲基酰基-辅酶A转化酶和反式-2，3-脱氢酰基-辅酶A转化酶都是反式-2-烯酰基-辅酶A还原酶。第一电子受体的氧化形式可以选自由NAD+、NADP+、硫代-NAD+、硫代-NADP+、乙酰基-NAD+、和乙酰基-NADP+组成的组，并且第二电子受体的还原形式可以选自由NADH、NADPH、硫代-NADH、硫代-NADPH、乙酰基-NADH、和乙酰基-NADPH组成的组。第一电子受体的还原或氧化形式或者第二电子受体的还原或氧化形式在所述循环反应体系中的浓度变化可以通过光度测量法评定。本发明的方法还可以包含将第一电子受体的氧化或还原形式或者第二电子受体的还原或氧化形式偶联到产生颜色的试剂的步骤用于评定所述第一电子受体还原或氧化形式或者第二电子受体还原或氧化形式的浓度变化，其中通过比色法评定第一电子受体的氧化或还原形式或者第二电子受体的还原或氧化形式的浓度变化。可以通过本发明的方法检定的样品包括生物样品。在一些实施方案中，所述生物样品是生物流体，诸如血液、血清、血浆、和尿。在一些实施方案中，所述生物样品选自由前列腺、结肠、胎盘、乳房、膀胱、肺、肾、淋巴细胞组成的组。本发明的可以用于个体癌症的预后和/或诊断。在一些实施方案中，所述癌症选自由前列腺癌、结肠直肠癌、卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌、肺癌、肾癌、淋巴瘤、和黑素瘤组成的组。在一些实施方案中，通过检定血样(诸如全血、血浆、和血清)中的α-甲基酰基-辅酶A消旋酶活性，本发明的方法用于个体中前列腺癌的预后和/或诊断。在一些实施方案中，所述方法还包含将来自所述个体的样品中的α-甲基酰基-辅酶A消旋酶的量与预定值比较的步骤，由此α-甲基酰基-辅酶A消旋酶量的增加显示所述个体有癌症或者处于癌症形成的危险中。在一些实施方案中，所述癌症选自由前列腺癌、结肠直肠癌、卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌、肺癌、肾癌、淋巴瘤、和黑素瘤组成的组。本发明也提供用于检定样品中α-甲基酰基-辅酶A消旋酶的试剂盒，所述试剂盒包含(2R)-2-甲基酰基-辅酶A、氧化形式的第一电子受体、在氧化形式的第一电子受体存在下催化(2S)-2-甲基酰基-辅酶A至反式-2，3-脱氢酰基-辅酶A的转化的(2S)-2-甲基酰基-辅酶A转化酶、还原形式的第二电子受体、和在还原形式的第二电子受体存在下催化反式-2，3-脱氢酰基-辅酶A至(2S)-2-甲基酰基-辅酶A的转化的反式-2，3-脱氢酰基-辅酶A转化酶，其中所述第一电子受体和第二电子受体是不同的。在一些实施方案中，(2R)-2-甲基酰基-辅酶A是(2R)-2-甲基-支链的酰基-辅酶A，其具有酰基链长从C(4)至C(30)，从C(8)至C(25)，或从C(10)至C(25)。在一些实施方案中，(2R)-2-甲基酰基-辅酶A是(2R)-姥鲛烷酰(pristanoyl)-辅酶A。在一些实施方案中，(2R)-2-甲基酰基辅酶A是(25R)-3α，7α，12α-三羟基-5β-胆甾烷酰(cholestanoyl)-辅酶A。在一些实施方案中，(2S)-2-甲基酰基-辅酶A转化酶和反式-2，3-脱氢酰基-辅酶A转化酶是不同的。在一些实施方案中，(2S)-2-甲基酰基-辅酶A转化酶是酰基-辅酶A脱氢酶，并且第一电子受体选自由NAD+、NADP+、硫代-NAD+、硫代-NADP+、乙酰基-NAD+、和乙酰基-NADP+组成的组。在一些实施方案中，(2S)-2-甲基酰基-辅酶A转化酶是酰基-辅酶A氧化酶，并且第一电子受体是O2。在一些实施方案中，反式-2，3-脱氢酰基-辅酶A转化酶是反式-2-烯酰基-辅酶A还原酶，并且第二电子受体选自由NADH、NADPH、硫代-NADH、硫代-NADPH、乙酰基-NADH、和乙酰基-NADPH组成的组。在一些实施方案中，(2S)-2-甲基酰基-辅酶A转化酶和反式-2，3-去氢酰基-辅酶A转化酶是相同的。在一些实施方案中，(2S)-2-甲基酰基-辅酶A转化酶和反式-2，3-脱氢酰基-辅酶A转化酶都是酰基-辅酶A脱氢酶或反式-2-烯酰基-辅酶A还原酶，并且第一电子受体的氧化形式选自由NAD、NADP+、硫代-NAD+、硫代-NADP+、乙酰基-NAD+、和乙酰基-NADP+组成的组，并且第二电子受体的还原形式选自由NADH、NADPH、硫代-NADH、硫代-NADPH、乙酰基-NADH、和乙酰基-NADPH组成的组。所述试剂盒还可以包含指示用于癌症的预后和/或诊断的说明书，所述癌症包括，而不是限于，前列腺癌、结肠直肠癌、卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌、肺癌、肾癌、淋巴瘤、和黑素瘤。
发明详述本发明提供用于检定α-甲基酰基-辅酶A消旋酶活性的方法。在所述检定中，将含有α-甲基酰基-辅酶A消旋酶或推测含有α-甲基酰基-辅酶A消旋酶的样品与(2R)-2-甲基酰基-辅酶A接触。如果样品中存在酶活性的α-甲基酰基-辅酶A消旋酶，则(2R)-2-甲基酰基-辅酶A转化成(2S)-2-甲基酰基-辅酶A。所述方法然后利用(2S)-2-甲基酰基-辅酶A和反式-2，3-脱氢酰基-辅酶A之间的循环反应体系而产生对应于α-甲基酰基-辅酶A消旋酶酶活性的可检测信号。描述于此的方法可以用于诊断癌症。例如，所述方法可以在不用活组织检查的情况下利用血样用于诊断前列腺癌。为了公开清楚，而不是作为限制，将发明详述分成下面的分部。
A.定义除非另外限定，在这里使用的全部技术的和科学的术语具有如本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同含义。将这里提到的全部专利、申请、公开的申请及其它公布通过参考全部结合。如果本节中陈述的定义与通过参考结合于此的专利、申请、公开的申请及其它公布中陈述的定义相反或以其它方式不一致，则本节中陈述的定义胜过通过参考结合于此的定义。如这里所用，“一种(a)”或“一种(an)”是指“至少一种”或“一种或多种”。如这里所用，“α-甲基酰基-辅酶A消旋酶”或“AMACR”(EC5.1.99.4)指催化(2S)-2-甲基酰基-辅酶A和(2R)-2-甲基酰基-辅酶A之间转化的酶。它意欲包括基本上不改变它的活性的α-甲基酰基-辅酶A消旋酶的衍生物、变体、和类似物。α-甲基酰基-辅酶A消旋酶可以从任何来源获得，诸如人、小鼠、牛、大鼠、果蝇等。如这里所用，“(2S)-2-甲基酰基-辅酶A转化酶”是指在氧化形式的电子受体存在下从(2S)-2-甲基酰基-辅酶A催化反式-2，3-脱氢酰基-辅酶A形成的酶。它意欲包括基本上不改变它的活性的(2S)-2-甲基酰基-辅酶A转化酶的衍生物、变体、和类似物。如这里所用，“(2S)-2-甲基酰基-辅酶A转化酶”是指在还原形式的电子受体存在下从(2S)-2-甲基酰基-辅酶A催化反式-2，3-脱氢酰基-辅酶A形成的酶。它意欲包括基本上不改变它的活性的反式-2，3-脱氢酰基-辅酶A转化酶的衍生物、变体、和类似物。如这里所用的术语“评定”意欲包括在获得反应体系中存在的分析物的量或浓度绝对值的意义上，以及在获得所述反应体系中指示分析物水平的指标、比例、百分比、可见的或其它值的意义上的定量和定性测定。评定可以是直接或间接的并且实际检出的化学物种当然不必是所述分析物本身然而例如可以是其衍生物或某些进一步的物质。如这里所用，“样品”指可以含有分析物检定所需分析物的任何东西。样品可以是生物样品，诸如生物流体或生物组织。生物流体的实例包括尿、血液、血浆、血清、唾液、精液、大便、痰液、脑脊液、泪液、粘液、羊水等。生物组织是细胞的团聚体，通常为特别的种类和它们的胞间物质，其形成人、动物、植物、细菌、真菌或病毒结构的一种结构材料，包括连接物、上皮、肌肉和神经组织。生物组织的实例也包括器官、肿瘤、淋巴结、动脉和个体细胞(s)。如这里所用，“血样”包括全血、血清、和血浆。如这里所用，“血清”指在除去血纤蛋白凝块和血细胞以后获得的血液的流体部分，与循环血液中的血浆不同。如这里所用，“血浆”指血液的流体、非细胞的部分，与凝固后获得的血清不同。如这里所用，“流体”指可以流动的任何组合物。因而流体包括以半固体、糊剂、溶液、水混合物、凝胶、洗剂、乳膏及其它这样组合物形式的组合物。如这里所用，“疾病或病症”指生物中的病理性病症，从例如感染或遗传缺陷而产生，并且其特征在于可识别的症状。如这里所用，“接触”是指使两种或更多组分在一起。可以通过将全部所述组分混合在流体或半流体混合物中实现“接触”。当在固体表面诸如固体组织截面或底物上使一种或多种组分接触到一种或多种其它组分时，也可以实现“接触”。如这里所用，“循环反应体系”指将(2S)-2-甲基酰基-辅酶A转化成反式-2，3-脱氢酰基-辅酶A并且从反式-2，3-脱氢酰基-辅酶A转化回(2S)-2-甲基酰基-辅酶A的过程。
B.检定α-甲基酰基-辅酶A消旋酶的方法本发明提供用于检定样品中α-甲基酰基-辅酶A消旋酶的方法，所述方法包含a)将推测含有α-甲基酰基-辅酶A消旋酶的样品与(2R)-2-甲基酰基-辅酶A接触而产生(2S)-2-甲基酰基-辅酶A；b)在(2S)-2-甲基酰基-辅酶A转化酶和氧化形式的第一电子受体存在下，将如果产生的来自步骤a)的所述(2S)-2-甲基酰基-辅酶A转化成反式-2，3-脱氢酰基-辅酶A，由此产生第一电子受体的还原形式；在反式-2，3-脱氢酰基-辅酶A转化酶和还原形式的第二电子受体存在下，将所述反式-2，3-脱氢酰基-辅酶A转化回(2S)-2-甲基酰基-辅酶A而形成循环反应体系，由此产生第二电子受体的氧化形式；其中第一电子受体和第二电子受体是不同的；和c)评定所述循环反应体系中第一电子受体的还原或氧化形式或者第二电子受体的还原或氧化形式的浓度变化，由此确定样品中α-甲基酰基-辅酶A消旋酶的存在、不存在和/或量。在一些实施方案中，步骤c)中产生的可检测信号是所述循环反应体系中第一电子受体的还原或氧化形式或者第二电子受体的还原或氧化形式的浓度变化。在一些实施方案中，所述样品是血样(诸如全血、血清、和血浆)。
步骤a)通过α-甲基酰基辅酶A消旋酶将(2R)-2-甲基酰基-辅酶A转化成(2S)-2-甲基酰基-辅酶A本发明中用于检定α-甲基酰基-辅酶A消旋酶的方法基于通过α-甲基酰基-辅酶A消旋酶催化的酶活性。α-甲基酰基-辅酶A外消旋酶催化将(2R)-2-甲基酰基-辅酶A转化成(2S)-2-甲基酰基-辅酶A的反应。因此，可以通过测定这些反应中产生的(2S)-2-甲基酰基-辅酶A确定样品中α-甲基酰基-辅酶A消旋酶的存在或不存在和数量。因而，本发明的步骤a)的例举性反应流程是(2R)-2-甲基酰基-辅酶A→(2S)-2-甲基酰基-辅酶A(1)可以使用任何(2R)-2-甲基酰基-辅酶A，它是要检定的α-甲基酰基辅酶A消旋酶的底物。所述酰基可以衍生自任何脂肪酸。所述酰基可以是支链的酰基(例如，脂肪酰基)，链长为至少C(4)，至少C(6)，至少C(8)，至少C(10)或更多。例如，所述链长可以是C(4)至C(30)，C(4)至C(16)，C(8)至C(25)，C(8)至C(18)，C(10)至C(25)，或C(12)至C(25)。所述酰基可以包括芳族化合物(例如，布洛芬)和胆汁酸中间体，诸如三羟基粪甾烷酰-辅酶A。在一些实施方案中，(2R)-2-甲基酰基-辅酶A是(2R)-姥鲛烷酰-辅酶A。在一些实施方案中，(2R)-2-甲基酰基-辅酶A是(2R，6R，10)-三甲基十一烷酰-辅酶A。在一些实施方案中，(2R)-2-甲基酰基-辅酶A是(2R，6)-二甲基庚酰-辅酶A。在一些实施方案中，(2R)-2-甲基酰基-辅酶A是(2R)-甲基-十五烷酰-辅酶A。在一些实施方案中，(2R)-2-甲基酰基-辅酶A是(25R)-3α，7α，12α-三羟基-5β-胆固烷酰-辅酶A。步骤a)中的(2R)-2-甲基酰基-辅酶A可以是适于α-甲基酰基-辅酶A消旋酶反应的任何浓度并且取决于样品中α-甲基酰基-辅酶A消旋酶的活性。例如，(2R)-2-甲基酰基-辅酶A的浓度是约0.01mM至约100mM；约0.05mM至约50mM，约0.5mM至约10mM，或约1mM至约5mM。所述酶反应一般在适于所述酶反应完成的条件(诸如缓冲液和温度)中进行。可以使用适于α-甲基酰基-辅酶A消旋酶酶反应的本领域已知的任何缓冲液。例如，所述缓冲液可以是pH为约6至约8的磷酸盐缓冲液；pH为约7至约9的Tris-HCl缓冲液，或pH为约6至约9的Good’s缓冲液。例如，所述反应可以在约30℃至37℃的温度进行5、10、15、30、或60min。可以在下一步骤前终止所述反应。可以利用本发明检定含有或推测含有α-甲基酰基-辅酶A消旋酶的任何样品，在一些实施方案中，所述样品是血液(包括全血、血清和血浆)或尿，在一些实施方案中，所述样品是组织样品(例如，前列腺、结肠、胎盘、乳房、膀胱、肺、肾、和淋巴细胞)。在一些实施方案中，在所述检定进行前，将所述组织样品进行匀浆化而获得粗组织匀浆。在一些实施方案中，在所述检定进行前预加工所述样品。例举性的加工步骤包括离心、萃取/洗涤、细胞溶解作用、冻/融、和声波降解法。也可以在所述检定前稀释所述样品。
步骤b)(2S)-2-甲基酰基-辅酶A/反式-2，3-脱氢酰基-辅酶A循环反应体系本发明的步骤b)在第一电子受体(它的氧化形式)存在下通过(2S)-2-甲基酰基-辅酶A转化酶的作用将(2S)-2-甲基酰基-辅酶A转化成反式-2，3-脱氢酰基-辅酶A，然后在第二电子受体(它的还原形式)存在下通过反式-2，3-脱氢酰基-辅酶A转化酶的作用从反式-2，3-脱氢酰基-辅酶A回到(2S)-2-甲基酰基-辅酶A。第一电子受体和第二电子受体是不同的电子受体。因而步骤b)形成循环反应体系，产生还原形式的第一电子受体的增加和氧化形式的第一电子受体的减少，和氧化形式的第二电子受体的增加和还原形式的第二电子受体的减少。可以测量特定形式的电子受体的增加或特定形式的电子受体的减少。在一些实施方案中，积累特定形式的电子受体并评定所述积累。在一些实施方案中，(2S)-2-甲基酰基-辅酶A转化酶和反式-2，3-去氢酰基-辅酶A转化酶是不同的。在一些实施方案中，(2S)-2-甲基酰基-辅酶A转化酶不与第二电子受体交叉反应或者以比结合到第一电子受体更低的亲合性结合到第二电子受体，和/或反式-2，3-脱氢酰基-辅酶A转化酶不与第一电子受体交叉反应或者以比结合到第一电子受体更低的亲合性结合到第一电子受体。可以使用任何(2S)-2-甲基酰基-辅酶A转化酶，所述酶在氧化形式的电子受体存在下催化来自(2S)-2-甲基酰基-辅酶A的反式-2，3-脱氢酰基-辅酶A的形成。在一些实施方案中，(2S)-2-甲基酰基-辅酶A转化酶是酰基-辅酶A脱氢酶(EC 1.3.1.8)。例如，可以使用任何酰基-辅酶A脱氢酶(EC1.3.1.8)，所述酶具有下列GenBank检索号B70719(结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis))的氨基酸序列，或者由下列所描述Cvetanovic等(Biochemical J.22749-56(1985))，Dommes等(Eur.J.Biochem.125335-341(1982))，和Seubert等(Biochim.Biophys.Acta164498-517(1968))。在其它实施方案中，(2s)-2-甲基酰基-辅酶a转化酶是酰基-辅酶A氧化酶(EC 1.3.3.6)。例如，可以使用具有下列GenBank检索号的氨基酸序列的酰基-辅酶A氧化酶(EC 1.3.3.6)，T52121(拟南芥(Arabidopsisthaliana))、T52120(拟南芥(Arabidopsis thaliana))、I38095(智人(Homosapiens))、S64224(啤酒酵母(Saccaromyces cerevisiae))、A54942(智人(Homosapiens))、OXRTA2(褐家鼠(Rattus norveqicus))、OXRTA1(褐家鼠(Rattusnorveqicus))、OXCKX5(热带假丝酵母(candida tropicalis))。在另一个实施方案中，(2S)-2-甲基酰基-辅酶A转化酶是反式-2-烯酰基-辅酶A还原酶(EC 1.3.1.38)。例如，可以使用任何反式-2-烯酰基-还原酶(EC 1.3.1.38)，所述酶具有下列GenBank检索号S72400(Streptomyces collinus)的氨基酸序列，或者由Mizugaki等(J.Biochem.921649-1654(1982))和Prasad等(Arch.Biochem.Biophys.237535-544(1985))所描述。可以使用任何(2S)-2-甲基酰基-辅酶A转化酶，所述酶在还原形式的电子受体存在下催化来自反式-2，3-脱氢酰基-辅酶A的(2s)-2-甲基酰基-辅酶A的形成。在一些实施方案中，反式-2，3-脱氢酰基-辅酶A转化酶是反式-2-烯酰基-辅酶A还原酶(EC 1.3.1.38)。可以使用本领域已知的和描述于此的任何反式-2-烯酰基-辅酶A还原酶。在其它实施方案中，反式-2，3-脱氢酰基-辅酶A转化酶是酰基-辅酶A脱氢酶(EC 1.3.1.8)。可以使用本领域已知的和描述于此的任何酰基-辅酶A脱氢酶。在一些实施方案中，(2S)-2-甲基酰基-辅酶A转化酶和反式-2，3-去氢酰基-辅酶A转化酶是相同的。在一个实施方案中，(2S)-2-甲基酰基-辅酶A转化酶和反式-2，3-脱氢酰基-辅酶A转化酶都是酰基-辅酶A脱氢酶。在其它实施方案中，(2S)-2-甲基酰基-辅酶A转化酶和反式-2，3-脱氢酰基-辅酶A转化酶都是反式-2-烯酰基-辅酶A脱氢酶。可以使用本领域已知的和描述于此的任何酰基-辅酶A脱氢酶和反式-2，3-脱氢酰基-辅酶A转化酶。第一和第二电子受体可以是与选择用于所述反应的酶类相容的任何电子受体，条件是第一电子受体和第二电子受体是不同的。在一些实施方案中，(2S)-2-甲基酰基-辅酶A转化酶是酰基-辅酶A脱氢酶，并且第一电子受体选自由NAD+、NADP+、硫代-NAD+、硫代-NADP+、乙酰基-NAD+、和乙酰基-NADP+组成的组。在一些实施方案中，(2S)-2-甲基酰基-辅酶A转化酶是酰基-辅酶A氧化酶并且第一电子受体是O2。在一些实施方案中，(2S)-2-甲基酰基-辅酶A转化酶是反式-2-烯酰基-辅酶A还原酶，并且第一电子受体选自由NAD+、NADP+、硫代-NAD+、硫代-NADP+、乙酰基-NAD+、和乙酰基-NADP+组成的组。在一些实施方案中，反式-2，3-脱氢酰基-辅酶A转化酶是反式-2-烯酰基-辅酶A还原酶，并且第二电子受体选自由NADH、NADPH、硫代-NADH、硫代-NADPH、乙酰基-NADH、和乙酰基-NADPH组成的组。在一些实施方案中，反式-2，3-脱氢酰基-辅酶A转化酶是酰基-辅酶A脱氢酶，并且第二电子受体选自由NADH、NADPH、硫代-NADH、硫代-NADPH、乙酰基-NADH、和乙酰基-NADPH组成的组。在一些实施方案中，(2S)-2-甲基酰基-辅酶A转化酶和反式-2，3-脱氢酰基-辅酶A转化酶可以一起催化(2S)-2-甲基酰基-辅酶A转化酶和反式-2，3-脱氢酰基-辅酶A之间的循环反应，所述反应在所述检定中产生放大的信号。(2S)-2-甲基酰基-辅酶A转化酶和反式-2，3-脱氢酰基-辅酶A转化酶可以利用不同的电子受体并且不与由另一个酶使用的电子受体交叉反应或者以低亲合性反应。备选地，可以认为所述两种酶是相同的电子受体。可以将足够量的第一电子受体的氧化形式和第二电子受体的还原形式加入到所述循环反应以驱动两个反应并且容许所述循环进行直到产生充分的信号。在下列两个例举性的步骤b)反应流程中，(2S)-2-甲基酰基-辅酶A转化酶和反式-2，3-脱氢酰基-辅酶A转化酶是不同的。例如，(2S)-2-甲基酰基-辅酶A转化酶是酰基-辅酶A脱氢酶(EC 1.3.1.8)并且反式-2，3-脱氢酰基-辅酶A转化酶是反式-2-烯酰基-辅酶A还原酶(EC 1.3.1.38)。由此，步骤b)的例举性反应流程是(2S)-2-甲基酰基-辅酶A+硫代-NADP++H2O→反式-2，3-脱氢酰基-辅酶A+硫代-NADPH+H+(2a)反式-2，3-脱氢酰基-辅酶A+NADH+H+→(2S)-2-甲基酰基-辅酶A+NAD++H2O(2b)反应(2a)表示由酰基-辅酶A脱氢酶催化的反应，并且反应(2b)表示由反式-2-烯酰基-辅酶A还原酶催化的反应。作为实施例，(2S)-2-甲基酰基-辅酶A是(2S)-姥鲛烷酰-辅酶A并且反式-2，3-脱氢酰基-辅酶A是反式-2，3-脱氢姥鲛烷酰-辅酶A。可以将充分的硫代-NADP+和NADH加入到所述反应以产生循环反应，所述循环反应导致硫代-NADPH的积累。在另一个实施例中，在所述循环反应中，将酰基-辅酶A氧化酶(EC 1.3.3.6)用作(2S)-2-甲基酰基-辅酶A转化酶，并且将反式-2-烯酰基-辅酶A还原酶(EC 1.3.1.38)用作反式-2，3-脱氢酰基-辅酶A转化酶。例举性反应流程是(2S)-2-甲基酰基-辅酶A+O2→反式-2，3-脱氢酰基-辅酶A+H2O2(3a)反式-2，3-脱氢酰基-CoA+NADPH+H+→(2S)-2-甲基酰基-辅酶A+NADP++H2O(3b)反应(3a)表示由酰基-辅酶A氧化酶催化的反应，并且反应(3b)表示由反式-2-烯酰基-辅酶A还原酶催化的反应。作为实施例，(2S)-2-甲基酰基-辅酶A是(2S)-姥鲛烷酰-辅酶A并且反式-2，3-脱氢酰基-辅酶A是反式-2，3-脱氢姥鲛烷酰-辅酶A。将充分量的O2和NADPH加入到所述反应以产生循环反应，其导致NADP和H2O2的积累。下列是例举性反应流程，其中(2S)-2-甲基酰基-辅酶A转化酶和反式-2，3-脱氢酰基-辅酶A转化酶是相同的。一种这样的例举性反应流程是(2S)-2-甲基酰基-辅酶A+硫代-NADP++H2O→反式-2，3-脱氢酰基-辅酶A+硫代-NADPH+H+(4a)反式-2，3-脱氢酰基-辅酶A+NADH+H+→(2S)-2-甲基酰基-辅酶A+NAD++H2O(4b)反应(4a)和(4b)都是由相同酶催化的，所述酶是酰基-辅酶A脱氢酶(EC1.3.1.8)或反式-2-烯酰基-辅酶A还原酶(EC 1.3.1.38)。作为实例，(2S)-2-甲基酰基-辅酶A是(2S)-姥鲛烷酰-辅酶A并且反式-2，3-脱氢酰基-辅酶A是反式-2，3-脱氢姥鲛烷酰-辅酶A。可以将充分的硫代-NADP+和NADH加入到所述反应混合物以驱动循环反应中的两个反应，导致硫代-NADPH的积累。(2S)-2-甲基酰基-辅酶A转化酶类和反式-2，3-脱氢酰基-辅酶A转化酶类的任何其它组合可以用于实现相同的循环效果。步骤a)和b)中的酶反应一般在适于所述酶反应完成的条件(诸如缓冲液和温度)中进行。用于描述于此的步骤b)和步骤a)的缓冲液可以相同或可以不同。可以使用适于步骤a)和/或b)中特定酶反应的本领域已知的任何缓冲液。例如，所述缓冲液可以是pH为约6至约8的磷酸盐缓冲液；pH为约7至约9的Tris-HCl缓冲液，或pH为约6至约9的Good’s缓冲液。步骤b)的温度可以相同或不同于步骤a)。步骤b)中的温度优选在约25℃至约37℃之间。在一些实施方案中，在单独的反应混合物中进行描述于此的一个或多个步骤。例如，可以将所述反应中的一个或多个步骤的最终产品部分或完全与所述反应混合物分开，之后加入下一步骤的试剂。在一些实施方案中，在单一反应混合物中进行描述于此的步骤a)和b)。在一些实施方案中，在前一步骤末尾，将用于下一步骤的酶类、底物、或电子受体顺序加入到相同反应混合物。在一些实施方案中，终止前一步骤中的反应，之后加入用于下一步骤的试剂。在一些实施方案中，将用于超过一个步骤的一些或全部试剂同时加入到所述反应混合物。在一些实施方案中，将用于步骤a)和b)的试剂同时与所述样品混合。在这些实施方案中，将推测含有α-甲基酰基-辅酶A消旋酶的样品与(2R)-2-甲基酰基-辅酶A、(2S)-2-甲基酰基-辅酶A转化酶、氧化形式的第一电子受体、反式-2，3-去氢酰基-辅酶A转化酶、和还原形式的第二电子受体接触。在一些实施方案中，将用于步骤a)的试剂和步骤b)的一些试剂同时与所述样品混合。在这些实施方案中，将推测含有α-甲基酰基-辅酶A消旋酶的样品与(2R)-2-甲基酰基-辅酶A、(2S)-2-甲基酰基-辅酶A转化酶、和氧化形式的第一电子受体接触。在一些实施方案中，将用于步骤b)的一些试剂首先与所述样品混合，并且随后加入用于步骤a)的试剂和用于步骤b)的其它试剂。在一些实施方案中，首先将(2S)-2-甲基酰基-辅酶A转化酶和氧化形式的第一电子受体加入样品中，并然后将所述样品与(2R)-2-甲基酰基-辅酶A、反式-2，3-去氢酰基-辅酶A转化酶、和还原形式的第二电子受体接触。在一些实施方案中，将具有(2S)-2-甲基酰基-辅酶A转化酶和氧化形式的第一电子受体的样品温育而容许样品中的(2S)-2-甲基酰基-辅酶A转化成反式-2，3-脱氢酰基-辅酶A。在实施例1和2中详细地描述这些实施方案。
步骤c)步骤b)中产生的评定信号样品中α-甲基酰基-辅酶A消旋酶的定量可以通过监控步骤b)中产生的信号中减去的或添加的差异而实现。所述评定可以连续或在不同时间点进行。在一些实施方案中，评定第一电子受体的还原或氧化形式的浓度变化。在一些实施方案中，通过评定第一电子受体的还原形式的浓度增加而确定α-甲基酰基-辅酶A消旋酶的活性。在一些实施方案中，通过评定第一电子受体的氧化形式的浓度减少而确定α-甲基酰基-辅酶A消旋酶的活性。在一些实施方案中，评定第二电子受体的还原或氧化形式的浓度变化。在一些实施方案中，通过评定第二电子受体的还原形式的浓度减少而确定α-甲基酰基-辅酶A消旋酶的活性。在一些实施方案中，通过评定第二电子受体的氧化形式的浓度增加确定α-甲基酰基-辅酶A消旋酶的活性。可以利用本领域已知的方法评定描述于此的电子受体的浓度变化。例如，可以通过测量在340nm的吸收而分光光度法测定NADH或NADPH的浓度变化。可以通过测量在405nm的吸收而分光光度法测定硫代-NADPH的浓度变化。在一些实施方案中，可以通过比色法利用电子传递生色团测量NADH或NADPH的浓度变化，所述生色团包括，但不限于，3-(对-碘苯基)-2-(对-硝基苯基)-5-苯基-2H-四唑氯化物、3-(4，5-二甲基-2-噻唑基)-2，5-二苯基-2H-四唑溴化物、3，3′-(4，4′-亚联苯基)-双(2，5-二苯基-2H-四唑化物、3，3′-(3，3′-二甲氧基-4，4′-亚联苯基)-双[2-(对-硝基苯基)-5-苯基-2H-四唑氯化物](＝硝基-四唑NTB)、3，3′-(3，3′-二甲氧基-4，4′-亚联苯基)-双[2，5-双(对-硝基苯基)-2H-四唑氯化物]、3，3′-(3，3′-二甲氧基-4，4′-亚联苯基)-双(2，5-二苯基-2H-四唑氯化物)、和2，6-二氯苯酚-靛酚。优选的实施例是水溶性四唑盐和心肌黄酶或吩嗪硫酸二甲酯的组合。这些电子传递生色团是NADP或NADPH的电子受体以形成显色的甲 (formazane)颜料，并且形成的颜料在其最大吸收处是比色测量的。用于NADH或NADPH的进一步测定法是荧光测定法，其中在荧光试剂诸如刃天青(resazulin)存在下将NAD或NADPH用心肌黄酶处理。描述于此的电子受体的还原和/或氧化形式的浓度测量在本领域中是已知的。例如，可以通过利用电子传感器检定消耗的O2或H2O2的量。可以使用许多氧化还原指示剂用于本用途，并且在文献中对于检定溶液中的H2O2和O2描述了广泛的方法。产生的H2O2还可以通过与指示剂和H2O2起反应作为可检测出产物而测量。指示剂的实例是可以通过分光光度方法测量的试剂、颜色指示剂、荧光试剂或发光试剂。例如，可以利用peroxioxalate和吖啶酯的非-酶催化的化学发光反应评定H2O2。检定可以一式两份进行，同时具有阳性和背景对照。可以通过利用己知量的具有已知活性的α-甲基酰基-辅酶A消旋酶获得标准曲线。然后可以通过将每个测量信号对所述标准曲线比较而确定每个样品中的α-甲基酰基-辅酶A消旋酶的水平。
C.方法的用途本发明提供具有增加的灵敏性的检定法，用于检测样品例如血样中存在的α-甲基酰基-辅酶A消旋酶。因而本发明的方法提供用于与α-甲基酰基-辅酶A消旋酶改变水平有关的检测条件并用于监控个体中α-甲基酰基-辅酶A消旋酶水平的实用方法。所述方法可以用于受试者中与α-甲基酰基-辅酶A消旋酶的不适当的量或活性，或这样的效果或活性有关的任何疾病的预后或诊断。这样疾病的实例包括，但不限于，癌症诸如前列腺癌、结肠直肠癌、卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌、肺癌、肾癌、淋巴瘤、和黑素瘤。本发明的酶检定法也提供用于探查α-甲基酰基-辅酶A消旋酶在生物过程和多种病理性病症中作用的研究工具。
D.检定α-甲基酰基-辅酶A消旋酶的试剂盒本发明也提供用于检定α-甲基酰基-辅酶A消旋酶活性的试剂盒，诸如诊断试剂盒。这样的试剂盒包含描述于此的一种或多种底物、酶试剂和电子受体用于进行本发明的方法。在一些实施方案中，所述试剂盒包含(2R)-2-甲基酰基-辅酶A、(2S)-2-甲基酰基-辅酶A转化酶、氧化形式的第一电子受体、反式-2，3-脱氢酰基-辅酶A转化酶、还原形式的第二电子受体，其中第一电子受体和第二电子受体是不同的。在所述试剂盒中可以包括描述于此的任何底物、酶类、和电子受体。所述试剂盒也可以包含阳性和/或阴性对照标准，还有用于评定由步骤b)产生的信号的必要试剂，例如，可以包括用于进行比色检定的试剂。所述试剂盒也可以包含用于进行本发明方法和/或将样品传递到用于处理的诊断实验室的装置或容器，还包含用于进行本发明方法的适合的指导书。本发明的试剂盒可以在任何适合的包装中。例如，有关诊断系统的在此讨论的包装是诊断系统中通常利用的那些。这样的包装包括适合于在自动分析器中使用的容器。
E.实施例仅为了说明性目的包括下列实施例，不意欲限制本发明的范围。
实施例1.利用酰基-辅酶A脱氢酶和反式-2-烯酰基-辅酶A还原酶的α-甲基酰基-辅酶A消旋酶(AMACR)在本研究中，(2S)-2-甲基酰基-辅酶A转化酶是酰基-辅酶A脱氢酶；并且反式-2，3-脱氢酰基-辅酶A转化酶是反式-2-烯酰基-辅酶A还原酶。在下面表1和表2中陈述了本研究中所用试剂。
表1试剂1的比较
表2试剂2的比较 在本研究中，将260μl的试剂1加入到20μl的样品(血清或血浆)。在25℃或37℃的5min温育后，将60μl的试剂2加入到所述反应混合物。在8min-10min之间监控405nm的吸光度变化。针对来自AMACR校准器产生的速率，将405nm的增长率用于计算样品中AMACR活性。
实施例2.利用酰基辅酶A氧化酶和反式-2-烯酰基-辅酶A还原酶检定α-甲基酰基-辅酶A消旋酶(AMACR)在本研究中，(2S)-2-甲基酰基-辅酶A转化酶是酰基-辅酶A氧化酶；并且反式-2，3-脱氢酰基-辅酶A转化酶是反式-2-烯酰基-辅酶A还原酶。用于本研究的试剂陈述在下面的表3和表4中。
表3.试剂1的组成
表4.试剂2的组成 在本研究中，将260μl的试剂1加入到25μl的样品(血清或血浆)。在25℃或37℃的5min温育后，将60μl的试剂2加入到所述反应混合物。在8min-10min之间监控550nm的吸光度变化。利用AMACR校准器计算样品中的AMACR活性。仅为了说明性目的包括上述实施例，并且不意欲限制本发明的范围。可以对上述那些进行许多变化。因为上述实施例的修改和变化对本领域技术人员是显而易见的，所以意欲本发明仅受后附权利要求范围所限制。
权利要求
1.一种用于检定样品中α-甲基酰基-辅酶A消旋酶的方法，所述方法包含a)将推测含有α-甲基酰基-辅酶A消旋酶的样品与(2R)-2-甲基酰基-辅酶A接触以产生(2S)-2-甲基酰基-辅酶A；b)在(2S)-2-甲基酰基-辅酶A转化酶和氧化形式的第一电子受体存在下，将如果产生的来自步骤a)的所述(2S)-2-甲基酰基-辅酶A转化成反式-2，3-脱氢酰基-辅酶A，由此产生第一电子受体的还原形式；在反式-2，3-脱氢酰基-辅酶A转化酶和还原形式的第二电子受体存在下，将所述反式-2，3-脱氢酰基-辅酶A转化回(2S)-2-甲基酰基-辅酶A而形成循环反应体系，由此产生第二电子受体的氧化形式；其中第一电子受体和第二电子受体是不同的；和c)评定所述循环反应体系中第一电子受体的还原或氧化形式或者第二电子受体的还原或氧化形式的浓度变化，由此确定样品中α-甲基酰基-辅酶A消旋酶的存在、不存在和/或数量。
2.权利要求1的方法，其中所述(2R)-2-甲基酰基-辅酶A是(2R)-2-甲基-支链酰基-辅酶A，链长从C(4)至C(30)。
3.权利要求1的方法，其中所述(2R)-2-甲基酰基-辅酶A是(2R)-2-甲基-支链酰基-辅酶A，链长从C(8)至C(25)。
4.权利要求1的方法，其中所述(2R)-2-甲基酰基-辅酶A是(2R)-姥鲛烷酰-辅酶A。
5.权利要求1的方法，其中所述(2R)-2-甲基酰基-辅酶A是(25R)-3α，7α，12α-三羟基(tyrihydroxy)-5β-胆甾烷酰-辅酶A。
6.权利要求1的方法，其中首先将所述(2S)-2-甲基酰基-辅酶A转化酶和氧化形式的第一电子受体加入到所述样品，并且然后将所述样品与(2R)-2-甲基酰基-辅酶A、反式-2，3-脱氢酰基-辅酶A转化酶、和还原形式的第二电子受体接触。
7.权利要求1的方法，其中所述(2S)-2-甲基酰基-辅酶A转化酶和所述反式-2，3-脱氢酰基-辅酶A转化酶是不同的。
8.权利要求7的方法，其中所述(2S)-2-甲基酰基-辅酶A转化酶是酰基-辅酶A脱氢酶，并且所述第一电子受体选自由NAD+、NADP+、硫代-NAD+、硫代-NADP+、乙酰基-NAD+、和乙酰基-NADP+组成的组。
9.权利要求7的方法，其中所述(2S)-2-甲基酰基-辅酶A转化酶是酰基-辅酶A氧化酶，并且所述第一电子受体是O2。
10.权利要求7的方法，其中所述反式-2，3-脱氢酰基-辅酶A转化酶是反式-2-烯酰基-辅酶A还原酶，并且所述第二电子受体选自由NADH、NADPH、硫代-NADH、硫代-NADPH、乙酰基-NADH、和乙酰基-NADPH组成的组。
11.权利要求8的方法，其中所述反式-2，3-脱氢酰基-辅酶A转化酶是反式-2-烯酰基-辅酶A还原酶，并且所述第二电子受体选自由NADH、NADPH、硫代-NADH、硫代-NADPH、乙酰基-NADH、和乙酰基-NADPH组成的组。
12.权利要求9的方法，其中所述反式-2，3-脱氢酰基-辅酶A转化酶是反式-2-烯酰基-辅酶A还原酶，并且所述第二电子受体选自由NADH、NADPH、硫代-NADH、硫代-NADPH、乙酰基-NADH、和乙酰基-NADPH组成的组。
13.权利要求1的方法，其中所述(2S)-2-甲基酰基-辅酶A转化酶和所述反式-2，3-脱氢酰基-辅酶A转化酶是相同的。
14.权利要求13的方法，其中所述(2S)-2-甲基酰基-辅酶A转化酶和所述反式-2，3-脱氢酰基-辅酶A转化酶都是酰基-辅酶A脱氢酶或反式-2-烯酰基-辅酶A还原酶。
15.权利要求14的方法，其中所述第一电子受体的氧化形式选自由NAD+、NADP+、硫代-NAD+、硫代-NADP+、乙酰基-NAD+、和乙酰基-NADP+组成的组；并且所述第二电子受体的还原形式选自由NADH、NADPH、硫代-NADH、硫代-NADPH、乙酰基-NADH、和乙酰基-NADPH组成的组。
16.权利要求1的方法，其中通过光度测量法评定所述浓度变化。
17.权利要求1的方法，所述方法还包含在步骤c)以后将所述第一电子受体的氧化或还原形式或所述第二电子受体的还原或氧化形式偶联至颜色产生试剂的步骤，其中通过比色法评定所述第一电子受体的氧化或还原形式或者所述第二电子受体的还原或氧化形式的浓度变化。
18.权利要求1的方法，其中所述样品是生物样品。
19.权利要求18的方法，其中所述生物样品是血样。
20.权利要求19的方法，其中所述血样选自由全血、血清、和血浆组成的组。
21.权利要求18的方法，其中所述生物样品选自由前列腺、结肠、胎盘、乳房、膀胱、肺、肾、淋巴细胞组成的组。
22.权利要求1的方法，所述方法用于个体中癌症的预后和/或诊断。
23.权利要求22的方法，所述方法还包含将来自所述个体的样品中的α-甲基酰基-辅酶A消旋酶的量对于预定值比较的步骤，由此α-甲基酰基-辅酶A消旋酶的量的增加显示所述个体有癌症或者处于癌症形成的危险中。
24.权利要求22的方法，其中所述癌症选自由前列腺癌、结肠直肠癌、卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌、肺癌、肾癌、淋巴瘤、和黑素瘤组成的组。
25.一种用于检定样品中α-甲基酰基-辅酶A消旋酶的试剂盒，所述试剂盒包含(2R)-2-甲基酰基-辅酶A、氧化形式的第一电子受体、在氧化形式的第一电子受体存在下催化(2S)-2-甲基酰基-辅酶A转化成反式-2，3-脱氢酰基-辅酶A的(2S)-2-甲基酰基-辅酶A转化酶、还原形式的第二电子受体、和在还原形式的第二电子受体存在下催化反式-2，3-脱氢酰基-辅酶A转化成(2S)-2-甲基酰基-辅酶A的反式-2，3-脱氢酰基-辅酶A转化酶，其中所述第一电子受体和所述第二电子受体是不同的。
26.权利要求25的试剂盒，其中所述(2R)-2-甲基酰基-辅酶A是(2R)-2-甲基-支链酰基-辅酶A，链长从C(4)至C(30)。
27.权利要求25的试剂盒，其中所述(2R)-2-甲基酰基-辅酶A是(2R)-2-甲基-支链酰基-辅酶A，链长从C(8)至C(25)。
28.权利要求25的试剂盒，其中所述(2R)-2-甲基酰基-辅酶A是(2R)-姥鲛烷酰-辅酶A。
29.权利要求25的试剂盒，其中所述(2R)-2-甲基酰基-辅酶A是(25R)-3α，7α，12α-三羟基(tyrihydroxy)-5β-胆甾烷酰-辅酶A。
30.权利要求25的试剂盒，其中所述(2S)-2-甲基酰基-辅酶A转化酶是酰基-辅酶A脱氢酶，并且所述第一电子受体选自由NAD+、NADP+、硫代-NAD+、硫代-NADP+、乙酰基-NAD+、和乙酰基-NADP+组成的组。
31.权利要求25的试剂盒，其中所述(2S)-2-甲基酰基-辅酶A转化酶是酰基-辅酶A氧化酶，并且所述第一电子受体是O2。
32.权利要求25的试剂盒，其中所述反式-2，3-脱氢酰基-辅酶A转化酶是反式-2-烯酰基-辅酶A还原酶，并且所述第二电子受体选自由NADH、NADPH、硫代-NADH、硫代-NADPH、乙酰基-NADH、和乙酰基-NADPH组成的组。
33.权利要求30的试剂盒，其中所述反式-2，3-脱氢酰基-辅酶A转化酶是反式-2-烯酰基-辅酶A还原酶，并且所述第二电子受体选自由NADH、NADPH、硫代-NADH、硫代-NADPH、乙酰基-NADH、和乙酰基-NADPH组成的组。
34.权利要求31的试剂盒，其中所述反式-2，3-脱氢酰基-辅酶A转化酶是反式-2-烯酰基-辅酶A还原酶，并且所述第二电子受体选自由NADH、NADPH、硫代-NADH、硫代-NADPH、乙酰基-NADH、和乙酰基-NADPH组成的组。
35.权利要求25的试剂盒，所述试剂盒还包含指示用于癌症的预后和/或诊断的说明书。
36.权利要求35的试剂盒，其中所述癌症选自由前列腺癌、结肠直肠癌、卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌、肺癌、肾癌、淋巴瘤、和黑素瘤组成的组。
全文摘要
本发明提供了用于检定α－甲基酰基－辅酶A消旋酶活性的方法。在所述检定中，将含有α－甲基酰基－辅酶A消旋酶或推测含有α－甲基酰基－辅酶A消旋酶的样品与(2R)－2－甲基酰基－辅酶A接触。如果α－甲基酰基－辅酶A消旋酶存在于所述样品中，则(2R)－2－甲基酰基－辅酶A转化成(2S)－甲基酰基－辅酶A。所述方法然后利用(2S)－2－甲基酰基－辅酶A和反式－2，3－脱氢酰基－辅酶A之间的循环反应体系而产生对应于α－甲基酰基－辅酶A消旋酶酶活性的可检测信号。也提供了基于相同原理的α－甲基酰基－辅酶A消旋酶检定用试剂盒。
文档编号G01N33/53GK101040055SQ200580035331
公开日2007年9月19日 申请日期2005年10月14日 优先权日2004年10月15日
发明者袁崇生 申请人:通用原子公司