专利名称：经修饰的hiv－1肽及其在检测抗－hiv抗体中的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及可以在用于检测由HIV-1病毒引起的感染的免疫测定法中使用的合成肽，其制备方法，包含这样的肽的组合物和试剂盒，这样的肽用于诊断目的的用途，以及使用它们来检测抗HIV病毒抗体的免疫测定方法。
HIV-1型逆转录病毒(人免疫缺陷病毒1型或HIV-1)已知为历史上第一种造成人AIDS的因子。如今，HIV-1型病毒被分为M群HIV-1病毒(主要群)和O群HIV-1病毒(次要群，最初被称为O亚型)，两者尤其在基因组和免疫学上不同。自1986年(Clavel等人，Science，第233卷，第343-346页，18 July 1986)以来，已知了造成人AIDS的第二种病毒类型，称为HIV-2。
为了表达方便，在下文中将用“HIV-1M”这种表述来表示M群的HIV-1病毒，用“HIV-1 O”这种表述来表示O群的HIV-1病毒。
最初发现了3种不同分离物形式的HIV-1型逆转录病毒。这些分离物被称为LAV、HTLV-III和ARV分离物(有时也被称为ARV-2)。可以参考Barré-Sinoussi等人(Science 20 May 1983，220，第868-871页)；Popovic等人(Science 4 May 1984，224，第497-500页)；Gallo等人(Science 4 May 1984，224，第500-503页)和Levy等人(Science 24 August 1984，225，第840-842页)的文章，它们提及了这些分离物的发现。现在，所有这3种分离物均属于HIV-1M病毒这一类别。HIV-1 O病毒要更晚(从1990年开始)才得到描述，并且它们的分离物有过不同的命名，例如HIV-3或ANT 70(欧洲专利申请EP 345 375和De Leys等人，Journal of Virology，March 1990，第64卷，No.3，第1207-1216页)，或较晚时候的MVP5180/91(Gürtler等人，Journal of Virology，March 1994，第68卷，No.3，第1581-1585页；专利申请EP 0 591 914)等。其他O群分离物，例如HIV-1VAU、HIV-1DUR、MVP2901/94等，从那以后也已得到描述。
1985年初，HIV-1M逆转录病毒的最初分离物的序列被阐明并公布可参考Wain-Hobson等人(Cell，January 1985，40，第9-17页)；Ratner等人(Nature，24 January 1985，313，第277-284页)和Sanchez-Pescador等人(Science 1 February 1985，227，第484-492页)的文章。LAV、HTLV-III和ARV/ARV-2病毒从那以后一直被识别为是相同AIDS病毒的变体，现在已知被称为HIV-1(对于人免疫缺陷病毒)(Ratner等人，Nature，第313卷，21 February 1985，第636-637页)。
1984-1985年开始了由HIV-1 M引起的感染的最初体外诊断测定法，其通过免疫检测法进行，且旨在检测人生物样品例如血清或血浆中抗-HIV-1 M抗体的存在。用于检测抗HIV-1 M抗体的那些最初免疫测定法利用病毒裂解产物作为靶抗原用于捕获所研究的抗体(这即所谓的第一代免疫测定法)。由于它们所使用的抗原制剂纯度不够，有时给出假阴性结果和/或假阳性结果，因而随后求助于基因工程以便生产出更好控制且更均质的抗原，所述抗原被证明更灵敏且更特异。可以提及的是，例如，几个团队关于各种不同形式的HIV-1 M包膜跨膜糖蛋白(gp41)抗原所进行的工作以及使用它们的免疫测定法，他们的工作被记录在Chang等人(Science，228，5 April 1985，第93-96页)；Crowl等人(Cell，41，July 1985，第979-986页)；Chang等人(BioTechnology，3，October 1985，第905-909页)；Cabradilla等人(BioTechnology，4，February，1986，第128-133页)等的文章中。从而，基于重组抗原的那些免疫测定法构成了第二代免疫测定法。尽管它们带来了巨大的进步，但那些新的免疫测定法仍不能检测所有感染了HIV-1 M的受试者的血清。
为寻求更大的灵敏性和特异性，一些团队转向短的(通常少于50个氨基酸)合成肽，所述短的合成肽更易于制备和控制，并可用作用于检测抗-HIV-1 M抗体的靶抗原。就是这样，Wang等人(PNAS，第83卷，第6259-6163页，August 1986)描述了利用序列为RILAVERYLKDQQLLGIWGC603S(SEQ ID NO.8)的HIV-1 M gp41的肽作为抗体的捕获抗原。
同样地，以Genetic Systems Corporation的名义的专利申请WO86/06414描述了一系列短的肽，其中的一些来源于HIV-1 MBRU的gp41，例如肽(X)(39)，其相应于非常类似的序列RILAVERYLKDQQLLGIWGC603SGKLIC609(SEQ ID NO.9)。
专利US 4,879,212(Wang等人)描述了稍微更长(35个氨基酸)的HIV-1 M gp41的肽，其序列为RILAVERYLKDQQLLGIWGC603SGKLIC609TTAVPWNAS(SEQ ID NO.10)。
Wang等人的肽和专利申请WO86/06414的肽赋予新的基于肽的免疫测定法极大的灵敏性和极大的特异性，该基于肽的免疫测定法即所谓的第三代免疫测定法。许多作者沿着短肽这一途径以开发出新的试剂，并由此开发出大量商业性的包含它们的抗-HIV抗体检测试剂盒。
在位于La Jolla，California的Scripps诊所中，John W.Gnann的团队甚至在上述肽(X)(39)中已鉴定出一种在诊断方面非常重要的表位，因为该表位不仅具有非常高的免疫反应性而且对HIV-1 M非常特异它是HIV-1 M gp41的优势免疫表位，其序列为WGC603SGKLIC609(Gnann等人，Journal of Virology，August 1987，第2639-2641页；Gnann等人，Science，第237卷，11 September 1987，第1346-1349页)。Gnann等人提出了这样的观点，即，在这个优势免疫表位中，两个半胱氨酸C603和C609之间二硫桥的形成可能在该表位的抗原构象中起关键作用，从而潜在地促进环状结构的生成。
之后不久，以Ferring AB的名义的专利申请WO89/03844和以IAFBiochem International的名义的EP 0 326 490 A2描述了以通过两个半胱氨酸C603和C609之间的二硫桥而自动环化的形式存在的、携带“Gnann等人的表位”的HIV-1 M gp41的肽，它可以一般的、简化的和象征化的方式由下列任意的式来表示
(R1-SEQ ID NO.11-R2)。他们证实了Gnann等人的具有首创性的直觉。
申请EP 0 326 490 A2尤其描述了专利US 4,879,212(Wang等人)的HIV-1 M gp41的35聚体肽，但其为环化形式并具有下列序列(I) (SEQ ID NO.7)然而，由此类如此环化的肽所提供的改进仍受到争议，因为这些后面的肽不允许足够早期地检测某些HIV-1 M血清转变样品。就是这样，特别地，上述序列(I)的环状肽在灵敏性方面的表现仍不令人满意，因为这种肽不允许检测所有在抗HIV-1 M抗体方面阳性的血清转变样品，并且此外它存在合成产率和溶解性方面的问题。
简言之，无论使用哪种gp41的肽作为用于检测抗HIV-1 M血清转变的靶抗原，仍有一些弱阳性样品无法由第三代免疫测定法检测。因此，在本研究领域中需要改进的可溶性试剂，它可用于检测在抗HIV-1M抗体方面阳性的样品。尤其需要具有改进的灵敏性的试剂，它允许更加早期地检测出血清转变。在输血的情况下，事实上尽可能早地检测出任何感染了HIV-1 M的样品是至关紧要的。在检测时间方面即使仅仅赢得一周的时间也是非常重要的，以便例如避免将病毒传输给接受输血的受试者。
本发明的作者从寻求制造序列(I)的环状肽的近似肽开始着手，但是为更容易地制造，也就是说具有更佳的产率。在各种可能的方法中，一种是简单地减少肽的大小，另一种是更换可能致使合成产率降低的氨基酸残基(溶解性、偶联、二次反应等问题)。另一种可能的方法是用亲水性氨基酸来延长肽，以便尝试使其溶解性更大，等等。
本发明人用不同的残基替代第615位的色氨酸残基，以获得下列序列(II)的线性肽(没有在两个半胱氨酸残基之间环化)
RILAVERYLKDQQLLGIWGC603SGKLIC609TTAVPX615Naa1aa2(II)(SEQ ID NO.6)其中X表示选自F和G的氨基酸，和两个氨基酸aa1和aa2不存在或表示aa1丙氨酸aa2丝氨酸。
如本领域技术人员已知的，字母F和G指氨基酸苯丙氨酸(F)和甘氨酸(G)。
通过直接氧化序列(II)的肽中的两个半胱氨酸，本发明人随后制备了相应于下式(III)的环化肽 (SEQ ID NO.5)其中X表示选自F和G的氨基酸，和两个氨基酸aa1和aa2不存在或表示aa1丙氨酸aa2丝氨酸。
特别地，他们已经合成了下列环化肽，分别标示为SEQ ID NO.1、NO.
2、NO.3和NO.4SEQ ID NO.1RILAVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPF615NA617S618SEQ ID NO.2RILAVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPF615NSEQ ID NO.3RILAVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPG615NSEQ ID NO.4RILAVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPG615NA617S618。
以令人惊讶且完全出乎意料的方式，鉴于一方面对于某些肽缩短了具有35个氨基酸的最初的长序列，存在因而丢失功能性表位的风险，并且另一方面生成了在天然病毒株中不存在的部分人造的序列，本发明人已发现通过如此修饰现有技术的式(I)的环状肽，所述式(I)的环状肽不能检测所有在抗HIV-1 M抗体方面阳性的血清转变样品，得到了新型肽——能够检测所有那些样品的序列(III)的肽。
因此，本发明涉及序列(III)的HIV-1病毒gp41的环状肽 (SEQ ID NO.5)其中X表示选自F和G的氨基酸，和两个氨基酸aa1和aa2不存在或表示aa1丙氨酸aa2丝氨酸。
本发明还涉及组合物，特别是包含序列(III)的肽的抗原组合物。
本发明进一步涉及选自下列肽的序列(III)的HIV-1病毒gp41的肽SEQ ID NO.1RILAVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPF615NA617S618SEQ ID NO.2RILAVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPF615NSEQ ID NO.3RILAVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPG615NSEQ ID NO.4RILAVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPG615NA617S618。
本发明还涉及组合物，特别是包含序列(III)的肽的抗原组合物，所述序列(III)的肽选自上面显示的SEQ ID NO.1-4这些肽。
本发明的范围内，“组合物”被理解为多个分子组分的任何液体或固体联合体。某些组合物或混合物由包含一种或多种目的化学组分的水溶液、液体或固体构成。这样的水溶液可由pH一般接近中性(优选pH 5-pH 9)的缓冲液构成，所述缓冲液优选与一种或多种用于所需目的的蛋白质(protides)(即蛋白质、多肽、寡肽和/或氨基酸)相联合。在本领域技术人员熟知的缓冲液中，可以提及(但并不意味着任何限制)，磷酸盐、碳酸盐、Tris、硼酸盐缓冲液等。在可用于缓冲液中的蛋白质之中，可以特别提及，牛血清白蛋白(BSA)等。通常将防腐剂例如叠氮化钠以及任选的去污剂加入这样的组合物中。
在本发明范围内，“抗原组合物”被理解为包含至少一种根据本发明的(序列(III)的)肽的上文提及的任何组合物，所述肽为基本上保留其原始抗原反应性(即，被抗HIV抗体识别的能力)的形式。此类抗原组合物还可整合入HIV-2的抗原和/或HIV-1 O的抗原，所述抗原保留了免疫反应性。
根据本领域技术人员本身已知的任何形式的免疫测定方案(参见，特别是，下文“发明详述”部分的第4节)，此类抗原组合物可以用于体外诊断人生物学流体样品中的HIV感染，特别地但不是唯一地，用于检测抗HIV抗体。
此类抗原组合物可以液体或干燥形式整合到用于体外诊断HIV感染的试剂盒中，特别是整合到用于检测抗HIV抗体的试剂盒中。根据本领域技术人员本身已知的方法，此类抗原组合物可以固定在固相上，或整合到检测抗原中，例如经标记的抗原，特别是用酶标记的抗原，等等。
本发明进一步涉及用于制备序列(III)的肽，特别是选自SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4这些肽的肽的方法。
本发明进一步涉及用于制备组合物的方法，所述组合物包含序列(III)的肽，特别是选自SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4这些肽的肽。
本发明进一步涉及用于检测生物样品中抗HIV抗体的方法，其包括a)使生物样品与序列(III)的HIV-1病毒gp41的肽，特别是选自肽SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4这些肽的肽，和/或包含这样的肽的组合物接触；或者与序列(III)的肽的组合接触；b)在允许形成抗原-抗体复合物的条件下孵育所述混合物；和c)通过检测手段揭示和检测形成的抗原-抗体复合物，所述检测手段任选由HIV-1抗原构成，必要时它可以包含能够结合被捕获的抗HIV-1抗体的、经标记的、根据本发明的序列(III)的肽。
本发明还涉及前述抗HIV抗体的检测方法，其中步骤a)包括使生物样品与混合物接触，所述混合物由至少一种根据本发明的序列(III)的gp41的肽和HIV-2的抗原和/或HIV-10的抗原构成。
本发明还涉及用于检测生物样品中抗HIV抗体的试剂盒，所述试剂盒包括序列(III)的HIV-1病毒gp41的肽，特别是选自SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4这些肽的肽，或者包含这样的肽的组合物，任选与HIV-2的抗原和/或HIV-1 O的抗原相组合。
本发明进一步涉及至少一种序列(III)的HIV病毒gp41的肽，特别是选自SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4这些肽的肽，任选与HIV-2的抗原和/或HIV-1 O的抗原相组合，用于检测抗HIV病毒抗体的用途。
发明详述1.生物样品在本发明范围内，表述“生物样品”被理解为人的任何体液的样品，例如血液、血清、血浆、唾液、泪液、精液、脑脊液以及可能包含抗HIV抗体的任何其他体液。
2.根据本发明的肽的制备根据本发明的序列(III)的肽优选通过本领域技术人员熟知的常规技术制备，因为这更实际，但不是唯一的。作为实例，可以提及Merrifield型合成(Merrifield，J.Am.Chem.Soc.85，第2149-2154页，1963)。还可以使用“Fmoc”(9-芴基甲氧基羰基)型合成，因为纯度、抗原特异性、没有不希望的次生产物以及易于实施，所以它是有利的。
肽合成可通过合成仪而自动进行，例如Perspective的“Pioneer”合成仪、ABI(Applied Biosystems Inc.)的“433A”合成仪、或Rainin的“Symphony”合成仪那样的类型。
依据本领域技术人员本身已知的技术，肽同样可通过均相合成而获得。
通过本领域技术人员本身已知的各种方法，特别是根据专利申请WO89/03844(使用碘的甲醇溶液的化学氧化步骤)和EP 0 326 490 A2(铁氰化钾法)所描述的方法之一，可以进行线性肽的环化以获得根据本发明的式(III)的环化肽。
通过本领域技术人员本身已知的方法，在蛋白质、多肽、寡肽或氨基酸和用于构成根据本发明的抗原组合物的其他化学化合物存在下，根据本发明的肽可以任选地整合到缓冲液中。
3.可以在根据本发明的用于检测抗HIV抗体的方法以及抗HIV抗体的检测试剂盒中使用的其他HIV抗原作为HIV-2的抗原，可以使用各种抗原，优选HIV-2的gp140或跨膜糖蛋白gp36，更优选至少包含Gnann等人的(gp36的)优势免疫表位，即至少包含WGCAFRQVC这些氨基酸的肽(例如，参见Gnann等人的文章，Science，第237卷，11 September 1987，第1346-1349页；Guyader等人的文章，Nature 16 April 1987，326，第662-669页，它描述了HIV-2ROD的完整序列，或专利EP 0 239 425中给出的env序列)，更加优选至少包含WGCAFRQVC这些氨基酸的肽，其形式为通过这两个半胱氨酸之间的二硫桥而环化。
作为HIV-1 O的抗原，可以使用各种抗原，优选HIV-1 O的gp160或gp41。更优选地，可以使用包含Gnann等人的(gp41)优势免疫表位的肽，其例如至少包含WGCKGKLIC这些氨基酸(这些氨基酸是MVP5180/91的氨基酸，描述于专利申请EP 0 591 914的env序列中，或以登录号L20571可从GenBank数据库获得的序列中，参见Gürtler等人，Journal of Virology，March 1994，第68卷，No.3，第1581-1585页)。更加优选地，可以使用至少包含WGCKGKLIC这些氨基酸的肽，其形式为通过这两个半胱氨酸之间的二硫桥而环化。
可替代地，作为HIV-1 O的抗原，可以使用例如WGCKGKLVC这些氨基酸(这些氨基酸是以登录号L20587可从GenBank数据库获得的序列HIV-3/ANT70的氨基酸，参见Gürtler等人，Journal ofVirology，March 1994，第68卷，No.3，第1581-1585页)。更加优选地，可以利用至少包含WGCKGKLVC这些氨基酸的肽，其形式为通过这两个半胱氨酸之间的二硫桥而环化。
4.根据本发明的抗HIV抗体的检测方法的实施方案关于根据本发明的抗HIV抗体的检测方法的可能实施方案，可以有利地参考，例如，James P.Gosling的综述“A Decade of DevelopmentIn Immunoassay Methodology”，Clinical Chemistry，36/8，第1408-1427页，(1990)，文中提到了免疫测定中可用且已知的大量技术和变化形式。
用于检测生物样品中的抗HIV抗体的方法可以通过任何免疫测定法来进行，在广义上，即牵涉至少一种根据本发明的肽和至少一种抗-HIV抗体之间形成免疫复合物的免疫测定法。免疫学测定的方法或免疫测定法是本领域技术人员众所周知的，并且根据所选的标记物或经标记的试剂可以是EIA(酶免疫测定法)、ELISA(酶联免疫吸附测定法)、RIA(放射免疫测定法)、FIA(荧光免疫测定法)类型，等等。
术语“经标记的”不仅指直接标记(通过酶、放射性同位素、荧光染料、发光化合物等)，也指间接标记(例如，通过自身经直接标记的抗体，或借助于经标记的“亲和力对”的试剂，例如，但不是唯一的，经标记的抗生物素蛋白-生物素对，等等)。根据本发明的抗HIV抗体的检测方法的检测手段可以例如但不是唯一地由下列构成经标记的HIV抗原，经标记的人抗免疫球蛋白抗体，或以经标记的形式的对于免疫球蛋白具有亲和力的任何其他分子，如A蛋白或G蛋白，等等。作为标记物，可以提及酶、放射性同位素、荧光染料、发光化合物等，它们通过本身已知的方法而与所述根据本发明的肽、或所述抗免疫球蛋白抗体、或被选作检测手段的任何其他分子(如A蛋白或G蛋白)偶联。
在本发明范围内，根据本身已知的方案，例如Nakane和Kawaoki的技术(J.Histochem.Cytochem.22，第1984页(1974))，或本领域技术人员已知的任何其他偶联技术，可借助于辣根过氧化物酶对肽进行标记。可以使用其他酶，例如碱性磷酸酶等。
根据本发明的抗HIV抗体的检测方法可以以固相(非均相测定法)或以液相(均相测定法)进行。
根据本发明的对于抗HIV抗体的检测可涵盖本领域技术人员已知的各种不同的方案竞争类型的方案，间接类型的方案，或者常规的抗原-抗体-抗原夹心类型的方案，也称为“双抗原夹心”法(Maiolini等人，Journal of Immunological Methods，20(1978)25-34)。
根据本发明的一个优选的非均相实施方案，在间接类型的方案中或者在“双抗原夹心”法中，相应于gp160、gp41或本发明的肽的HIV-1M包膜抗原固定在固相上，其与HIV-2的抗原和/或HIV-1 O的抗原相组合或不相组合地用作抗体的捕获抗原。作为固相的非限制性实例，可以使用微量培养板，特别是聚苯乙烯微量培养板，例如由Nunc公司(Denmark)销售的那些。也可使用固体颗粒或珠，顺磁珠，例如由Dynal或Merck-Eurolab(France)(商标为EstaporTM)供给的那些，或者聚苯乙烯或聚丙烯试管，硝化纤维素细带。等等。
根据一个优选的实施方案，在“双抗原夹心”法(Maiolini等人，1978)的范围内，根据本发明的肽以经标记的形式用作检测手段，即，用作用于揭示在固相上形成并固定的复合物的抗原。
根据另一优选的实施方案，在间接类型的方案的范围内，人抗免疫球蛋白抗体，或所述抗体的免疫反应性片段(Fab、Fab′等)可以以经标记的形式用作检测手段，即，用作用于揭示在固相上形成并固定的复合物的抗原。
5.抗HIV抗体的检测试剂盒可以提供可用于根据本发明的方法来检测生物样品中的抗HIV抗体的试剂盒和试剂，从而以简单的并适用于大量生物样品的方式来实施本发明。
因此，本发明涉及用于检测生物样品中抗HIV抗体的试剂盒，其包含-至少一种捕获和/或检测抗原，所述抗原是可以由根据本发明的序列(III)的肽构成的肽，或包含这样的肽的抗原组合物；-至少一种用于检测形成的抗原-抗体复合物的手段。
有利地，该试剂盒可以包含多种捕获和/或检测抗原。
如上所述，捕获抗原可以有利地以固定在固相例如微量培养板上的形式存在。
优选的用于检测生物样品中抗HIV抗体的试剂盒包含a)捕获抗原，其是根据本发明的序列(III)的肽，或包含这样的肽的抗原组合物，所述捕获抗原固定在微量培养板上；b)用酶标记的检测抗原。
另一种优选的用于检测生物样品中抗HIV抗体的试剂盒包含a)捕获抗原，所述捕获抗原固定在微量培养板上；b)用酶标记的检测抗原，其是根据本发明的序列(III)的肽，或包含这样的肽的组合物。
另一种优选的用于检测生物样品中抗HIV抗体的试剂盒包含a)捕获抗原，其是根据本发明的序列(III)的肽，所述捕获抗原固定在微量培养板上；b)经标记的抗免疫球蛋白抗体，特别是用酶标记的抗免疫球蛋白抗体。
下列实施例举例说明了本发明，而并不限制其范围。
实施例1肽的合成下列合成通过采用“Fmoc”(9-芴基甲氧基羰基)化学在Pioneer合成仪上进行在每个步骤中，加入过量的(“试剂的摩尔数/树脂上的可替代基团的摩尔数”比＝5)试剂(即被保护的氨基酸和偶联活化剂(TBTU(2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲四氟硼酸盐)/HOBt(N-羟基苯并三唑))。在合成结束时，通过基于三氟乙酸的溶液(试剂K)从树脂上分离出肽。然后，肽在冷的醚溶液中沉淀，随后通过HPLC纯化。
在每个合成的线性肽上进行化学氧化步骤，其允许肽在两个半胱氨酸的区域内被环化。
如此，本发明人已实现了下列环化肽的合成RILAVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPW615NA617S618(SEQ ID NO.10)。
合成了序列SEQ ID NO.10的肽并用于下文所述实验中，因为，依据本发明人，该肽表示最接近的现有技术的肽。因此，它被用于下文所举例说明的比较中。
SEQ ID NO.1RILAVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPF615NA617S618SEQ ID NO.2RILAVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPF615NSEQ ID NO.3RILAVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPG615N
SEQ ID NO.4RILAVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPG615NA617S618。
根据众所周知的Nakane和Kawaoi(J.Histochem.Cytochem.22，第1984页(1974))的方法，这些肽中的每一个都缀合了辣根过氧化物酶(经标记的缀合物)。
实施例2所用的血清样品用于检测抗-HIV抗体的血清为-由Boston Biomedica Inc.(7组；17份样品)、Nabi(5组；14份样品)和Impath Bioclinical Partners(4组BCP；10份样品)提供的血清转变组的样品；-来自Bio-Rad，Marnes la Coquette，92430，France的内部组的在抗HIV-1抗体方面阳性的4份血清样品(C4、C5、C9和C10)；-另外测试了来自正常供体和来自阴性受试者的13份血清以确定测定法的阈值。
实施例3使用过氧化物酶-HIV 1肽这种缀合物的免疫酶测定法在下文的实施例中，针对HIV病毒的抗体的检测基于“双抗原夹心”类型的免疫酶技术的原则。该测试依靠，一方面使用用纯化的抗原(其中包括HIV-1 M病毒的包膜糖蛋白(gp160))敏化的微量培养板(固相)，另一方面使用由用过氧化物酶标记的本发明肽构成的缀合物，所述缀合物将待检测的抗HIV抗体捕捉入夹心中。
所采用的测定方案如下将100μl的稀释至3/4的每份测试血清样品分配于敏化的微量培养板的孔中，并使混合物均匀化。混合物在粘性膜下于37℃孵育60分钟后，随后用Tris NaCl缓冲液洗涤微量培养板，向每个孔中添加100μl经标记的缀合物(用过氧化物酶标记的根据本发明的HIV-1肽)。混合物在粘性膜下于18-30℃孵育30分钟。
用上述Tris NaCl缓冲液洗去仍然游离的缀合物级分后，揭示出固定在复合物上的酶的存在。为此，向每个孔中加入80μl揭示液(包含在柠檬酸和乙酸钠的溶液中的底物H2O2，以及生色化合物四甲基联苯胺或TMB)。将该新混合物在黑暗中于18-30℃孵育30分钟后，通过加入100μl 1N硫酸来终止显色。在分光光度计上于450/620nm处读取光密度。
通过比较所记录的每个测试样品的光密度(“OD”)与计算出的阈值的光密度(阈值＝阴性样品的OD的平均值+0.100OD单位)来确定抗-HIV抗体存在与否。
如果得到的OD大于阈值的OD，样品就被认为是阳性的(抗-HIV抗体的携带者)，如果OD小于阈值的OD，则被认为是阴性的。
表I显示了借助于在相同条件下制备的5种缀合物(上文合成的每种肽与过氧化物酶偶联)而获得的比较结果。所制得的各种不同的缀合物描述如下-缀合物A与过氧化物酶偶联的序列SEQ ID NO.10的肽-缀合物B与过氧化物酶偶联的SEQ ID NO.1的肽-缀合物C与过氧化物酶偶联的SEQ ID NO.2的肽-缀合物D与过氧化物酶偶联的SEQ ID NO.3的肽-缀合物E与过氧化物酶偶联的SEQ ID NO.4的肽。
在下表I中，给出的结果是在根据上述方案并使用所描述的缀合物A、B、C、D和E进行免疫酶测定法后而读取的OD值。
表I-以光密度单位表示的结果
表I-续及结束
对于受测试的阳性样品，并以几乎相同的阈值，用根据本发明的肽获得的缀合物B、C、D和E所给出的OD值明显高于用现有技术的35聚体肽(序列SEQ ID NO.10的肽)的缀合物A获得的OD值。
在下表II中，同样的结果以样品OD/阈值(OD/CO)的比表示。
表II-以光密度/阈值的比表示的结果
表II-续
表II-续及结束
以几乎相同的阈值，对于受测试的样品，用根据本发明的肽获得的缀合物B、C、D和E所给出的OD/CO比明显高于用现有技术的35聚体肽(序列SEQ ID NO.10的肽)的缀合物A所得的OD/CO比。同样地，某些在用现有技术的肽的缀合物A时为阴性的样品，在使用根据本发明的肽时被发现呈阳性。
以OD/CO比表示的结果的表(表III)显示了作为所得到的OD/CO比的函数的样品分布
表III
表III清楚地显示，使用根据本发明的肽比使用现有技术的序列SEQ ID NO.10的肽(缀合物A)能更好地检测出受测试的阳性血清，因为给出的OD/CO比大于1的样品数目明显更多。
如表I、II和III所总体显示的，根据本发明的肽(序列(III)的缀合物B、C、D和E)使得能够比现有技术的序列SEQ ID NO.10的肽(缀合物A)明显更早地检测出血清转变。
在下表IV中，缀合物B、C、D和E的免疫反应性以作为参考的缀合物A的免疫反应性的百分比给出。
表IV-以相对于缀合物A的免疫反应性的百分比表示的结果
表IV-续
表IV-续
表IV-续及结束
表IV清楚地显示了，根据发明的肽(序列(III)的缀合物B、C、D和E)所呈现的免疫反应性通常明显大于现有技术的序列SEQ ID NO.10的肽的免疫反应性，并因此通常具有更高的检测灵敏性。
总之，上述所有结果显示，以明显优于通过现有技术的肽(序列SEQ ID NO.10的缀合物A)这种最接近的肽而获得的检测结果的方式，通过根据本发明的肽(序列(III)的缀合物B、C、D和E)检测出受测试的抗HIV-1抗体阳性的血清。此外，根据本发明的肽(序列(III)的缀合物B、C、D和E)允许更加早地检测出血清转变。
因此，本发明通过根据本发明的肽很好地解答了所提出的问题。
序列表<110>Bio-Rad Pasteur<120>经修饰的HIV-1肽及其在检测抗-HIV抗体中的用途<130>BET 05P0796<150>FR 0408733<151>2004-08-06<160>11<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>35<212>PRT<213>人免疫缺陷病毒1型<220>
<221>DISULFID<222>(20)..(26)<223>
<400>1Arg Ile Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gln Gln Leu Leu Gly1 5 10 15Ile Trp Gly Cys Ser Gly Lys Leu Ile Cys Thr Thr Ala Val Pro Phe20 25 30Asn Ala Ser35<210>2<211>33<212>PRT<213>人免疫缺陷病毒1型<220>
<221>DISULFID<222>(20)..(26)<223>
<400>2Arg Ile Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gln Gln Leu Leu Gly1 5 10 15Ile Trp Gly Cys Ser Gly Lys Leu Ile Cys Thr Thr Ala Val Pro Phe20 25 30
Asn<210>3<211>33<212>PRT<213>人免疫缺陷病毒1型<220>
<221>DISULFID<222>(20)..(26)<223>
<400>3Arg Ile Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gln Gln Leu Leu Gly1 5 10 15Ile Trp Gly Cys Ser Gly Lys Leu Ile Cys Thr Thr Ala Val Pro Gly20 25 30Asn<210>4<211>35<212>PRT<213>人免疫缺陷病毒1型<220>
<221>DISULFID<222>(20)..(26)<223>
<400>4Arg Ile Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gln Gln Leu Leu Gly1 5 10 15Ile Trp Gly Cys Ser Gly Lys Leu Ile Cys Thr Thr Ala Val Pro Gly20 25 30Asn Ala Ser35<210>5<211>35<212>PRT<213>人免疫缺陷病毒1型<220>
<221>DISULFID<222>(20)..(26)<223>
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(32)..(32)<223>Xaa＝Phe或Gly<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(34)..(35)<223>Xaa Xaa＝不存在或Ala Ser<400>5Arg Ile Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gln Gln Leu Leu Gly1 5 10 15Ile Trp Gly Cys Ser Gly Lys Leu Ile Cys Thr Thr Ala Val Pro Xaa20 25 30Asn Xaa Xaa35<210>6<211>35<212>PRT<213>人免疫缺陷病毒1型<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(32)..(32)<223>Xaa＝Phe或Gly<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(34)..(35)<223>Xaa Xaa＝不存在或Ala Ser<400>6Arg Ile Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gln Gln Leu Leu Gly1 5 10 15Ile Trp Gly Cys Ser Gly Lys Leu Ile Cys Thr Thr Ala Val Pro Xaa20 25 30Asn Xaa Xaa35
<210>7<211>35<212>PRT<213>人免疫缺陷病毒1型<220>
<221>DISULFID<222>(20)..(26)<223>
<400>7Arg Ile Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gln Gln Leu Leu Gly1 5 10 15Ile Trp Gly Cys Ser Gly Lys Leu Ile Cys Thr Thr Ala Val Pro Trp20 25 30Asn Ala Ser35<210>8<211>21<212>PRT<213>人免疫缺陷病毒1型<400>8Arg Ile Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gln Gln Leu Leu Gly1 5 10 15Ile Trp Gly Cys Ser20<210>9<211>26<212>PRT<213>人免疫缺陷病毒1型<400>9Arg Ile Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gln Gln Leu Leu Gly1 5 10 15Ile Trp Gly Cys Ser Gly Lys Leu Ile Cys20 25<210>10<211>35<212>PRT<213>人免疫缺陷病毒1型
<400>10Arg Ile Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gln Gln Leu Leu Gly1 5 10 15Ile Trp Gly Cys Ser Gly Lys Leu Ile Cys Thr Thr Ala Val Pro Trp20 25 30Asn Ala Ser35<210>11<211>7<212>PRT<213>人免疫缺陷病毒1型<400>11Cys Ser Gly Lys Leu Ile Cys1 权利要求
1.序列(III)的HIV-1病毒gp41的环状肽 其中X表示选自F和G的氨基酸，和两个氨基酸aa1和aa2不存在或表示aa1丙氨酸aa2丝氨酸。
2.根据权利要求1的肽，其选自下列肽SEQ ID NO.1RILAVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPF615NA617S618SEQ ID NO.2RILAVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPF615NSEQ ID NO.3RILAVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPG615NSEQ ID NO.4RILAVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPG615NA617S618。
3.抗原组合物，其包含根据权利要求1或权利要求2的肽。
4.用于制备权利要求1或权利要求2所限定的序列(III)的肽的方法，所述方法包括所述肽的化学合成。
5.用于体外检测生物样品中的抗-HIV-1抗体的方法，其包括下列步骤a)使生物样品与至少一种权利要求1或权利要求2所限定的序列(III)的HIV-1病毒gp41的肽，和/或根据权利要求3的组合物接触；b)在允许序列(III)的肽和生物样品中存在的抗-HIV-1抗体之间形成抗原-抗体复合物的条件下孵育所述混合物；和c)揭示和检测形成的抗原-抗体复合物。
6.根据权利要求5的检测方法，其中，步骤a)包括使生物样品与抗原组合物接触，所述抗原组合物由至少一种序列(III)的gp41的肽和HIV-2的抗原和/或HIV-1 O的抗原构成。
7.用于检测生物样品中的抗-HIV抗体的试剂盒，所述试剂盒包含权利要求1或权利要求2所限定的序列(III)的HIV-1病毒gp41的肽，或根据权利要求3的组合物，任选与HIV-2的抗原和/或HIV-1 O抗原相组合。
8.用于检测生物样品中的抗-HIV抗体的试剂盒，所述试剂盒包含权利要求1或权利要求2所限定的序列(III)的HIV-1病毒gp41的肽，或根据权利要求3的组合物，其任选与HIV-2的抗原和/或HIV-1 O抗原相组合。
全文摘要
本发明涉及序列(III)的合成肽，其来源于HIV－1病毒的gp41，并可以在用于检测由HIV－1病毒引起的感染的免疫测定法中使用。本发明还涉及所述肽的制备方法，包含所述肽的组合物和试剂盒，所述肽用于诊断目的的用途，以及使用所述肽来检测抗－HIV病毒抗体的免疫测定法。
文档编号G01N33/569GK101035804SQ200580034237
公开日2007年9月12日 申请日期2005年7月27日 优先权日2004年8月6日
发明者S·加代勒, F·里厄尼耶 申请人:比奥-拉德巴斯德公司