肽在早期检测分枝杆菌疾病中的应用的制作方法

专利名称：肽在早期检测分枝杆菌疾病中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物和医药领域，涉及快速的早期检测人类分枝杆菌疾病的方法，它是基于检测是否存在针对特别“早期”的分枝杆杆菌蛋白抗原及其反应性表位的抗体，所述抗原及其表位的这种用途从前并没有被发现。对于这种抗体的检测是依赖于经选择的分枝杆菌蛋白、它的肽或融合多肽(肽多聚体、聚合蛋白)，从而使得TB的诊断能比目前还早。本发明还提供一种用于筛选TB易感人群的替代标记物，这些易感人群尤其是感染有人类免疫缺陷病毒(HIV)的患者。
背景技术：
1995年，世界卫生组织预测在随后的十年期间会出现大约9千万的肺结核(TB)新病例，并导致约3千万人死亡(Raviglione，MC et al.，1995，JAMA.273220-226)。具有高TB感染几率的HIV患者的扩增导致TB在世界范围内的再次复发(Raviglione，MC et al.，1992，Bull WHO 70515-526；Harries A.D.，1990，Lancet.335387-390)。这种趋势激发了人们对于改进TB疫苗、诊断方法、药物和药物传输方法的兴趣。由HIV引起的免疫缺陷使潜伏的TB被激活的几率提高，增加了对于原发疾病的易感性，并加快了疾病发展的进程(Raviglione et al.，1992，supra；1995，supra；Shafer RW et al.，1996，Clin.Infect.Dis.22683-704；Barnes PF etal.，1991，N.Engt.J Med.3241644-1650；Selwyn PA et al.，1989，N.Engl.J.Med.320545550)。
人们已经知道细胞免疫对于防治TB的重要性。这个领域的大量工作集中在确定致病菌，结核分枝杆菌(M.结核病；也在本发明中被缩写为″Mtb″)的抗原上，该抗原能够诱导有效的免疫反应，以及弄清楚各细胞群在宿主病原体相互作用中的作用(Andersen，P etal.，1992，Scafzd.J.Immuf2ol.36823-831；Havlir，DV et al.，1991，Infect.Immun.59665-670；Orme，IMetal.，1993，J.Ilifect.Dis.1671481-1497)。
检测到的针对Mtb纯化蛋白衍生物(缩写为“PPD”)的皮肤免疫反应的迟发过敏性是目前能够获得的唯一可用于检测感染Mtb潜伏期的标志。然而，PPD皮肤实验的灵敏性在HIV感染期间被显著减低了(Raviglione et al.，1992，supra，1995，supra；Graham NMH et al.，1991，JAMA267369-373；Huebner RE etal.，1994，Cli71.Infect.Dis.1926-32；Huebner RE etal.，1992，JAMA 267409-410；Caiaffa WT etal.，1995，Arch.Intern.Med.1552111-2117)。此外，在PPD皮肤实验中，接种紧密相关的分枝杆菌BacillusCalmette-Guerin(BCG)或先前接触了其它分枝杆菌都会导致假阳性结果。不仅PPD反应不能将活动期、亚临床疾病与感染潜伏期相区别，而且阳性的皮肤实验与发展成临床性疾病之间的时间也可能是几个月至几年的时间(Selwyn PA et al.，supra)。
由于无免疫应答的个体易于感染TB，美国疾病控制和预防中心建议所有HIV血清阳性(HIV+)、PPD阳性(PPD+)的个体采用预防性异烟肼疗法。然而，这种疗法的最佳治疗时间不清楚，理想的时间应该是与已经潜伏的细菌复制的时间相一致。必须避免没有必要的治疗，这是由于长期的异烟肼治疗会产生严重的毒副作用(Shafer et al.，supra)。这种治疗是否会引起耐药菌株的产生还不清楚。在发展中国家，由于大量的PPD+个体缺乏充足的医疗-社会基础和经济来源而使预防性疗法受到严重的限制。在美国也发现有高危人群，其主要是静脉药物使用者、无家人员、监禁者和贫民区居住者(Fitzgerald，JM et al.，1991，Chest 100191-200；Graham et al.，supra；Friedman，LNet al.，1996，NewEzlgl.J.Med.334828-833)以及与TB患者接触的家庭人员。因此，找到其它用于早期检测的替代标记物并及时对于这些高危人群中活动性、亚临床TB进行治疗已迫在眉睫。
人们对于TB抗体反应已经研究了几十年，其主要出于开发血清诊断检测的目的。尽管已经发现了一些血清反应性抗原/表位，但是由于缺乏检测相应抗体的简便技术，人们对Mtb的抗体反应方面的研究兴趣不高。用粗抗原制备物进行研究揭示了健康个体拥有能够与几种分枝杆菌抗原发生交叉反应的抗体，这些抗体可能是由于接触共生的和环境中的细菌和接种疫苗所引起的。(Bardana，EJ et al.，1973，Clin.Exp.Immunol.1365-77；Das，S et al.，1992，Clin.Exp.Iinmunol 89402-406；Del Giudice，G et al.，1993，JImmunol.1502025-2032；Grange，JM，1984，Adv.Tuberc.Res.211-78；Havlir，DV et al.，supra；Ivanyi，J et al.，1989，Brit.Med.Bull.44635-649；Verbon，A et al.，1990，J.Gen.Microbiol.136955-964)。几种分枝杆菌的抗原已经分离得到并且对其特征也研究清楚了(Young，DBet al.，1992，Mol.Microbiol.6133-145)，其包括71kDa DnaK，65 kDa GroEL，47kDa延伸因子tu，44kDa PstA同源体，40kDa L-丙氨酸脱氢酶，38kDa PhoS，23kDa超氧化歧化酶，23kDa外膜蛋白，12kDa硫氧还蛋白，以及14kDaGroES.。这些抗原中的大多数与其它分枝杆菌和非分支杆菌的原核生物中的类似蛋白具有显著的同源性(Andersen，AB et al.，1992，Infect.Immun.602317-2323；Andersen，ABet al.，1989，Infect.Immun.572481-2488；Braibant，M et al.，1994，Infect.Irnmu71.62849-854；Carlin，N et al.，1992，Infect.Iminun.603136-3142；Garsia，RJ et al.，1989，Infect.Immun.57204-212；Hirschfield，GR et al.，1990，J.BacterioL 1721001013；Shinnick，TM etal.，1989，Nucl.Acids Res.171254；Shinnick，TM etal.，1988，Infect.Immun.56446-451；Wieles，B et al.，1995，Infect.Immun.634946-4948；Young，DB et al.，supra；Zhang，Y et al.，1991，Mol.MicrobioL 5381-391)。因此，大多数个体(健康者或患者)都具有针对这些抗原的保守性区域表位的抗体。这些抗体造成了在Mtb粗抗原制备物上观察到的不提供任何信息的(有可能产生误导的)交叉反应性(Davenport，MP et al.，1992，Infect.Immun.601170-1177；Grandia，AA et al.，1991，Immunobiol.182127-134；Meeker，HC et al.，1989，Infect.Immun.573689-3694；Thole，J et al.，1987，Infect.Immun.551466-1475)。
因为这种交叉反应性抗体会掩盖Mtb抗原的特异性抗体，因此制备并测试了一些纯化抗原如38kDa PhoS，30/31kDa″抗原85″(下面将作详细讨论)，19kDa脂蛋白，14kDa GroES和脂阿拉伯甘露糖(LAM)(Daniel，T et al.，1985 Chest.88388-392；Drowart，L etal.，1991，Chest.100685-687；Jacket，PSet al.，1988，J.Clin.Microbiol.262313-2318；Ma，Y et al.，1986，Am Rev RespirDis 1341273-1275；Sada，E et al.，1990，J.Clin.Microbiol.282587-2590；Sada，ED et al.，1990，J.Infect.Dis.162928-931；Van Vooren，JP et al.，1991，J.Clin.Microbiol.292348-2350)。值得注目的是，选择哪种抗原进行测试主要由下列因素决定(a)可获得性，(b)在动物免疫反应中的免疫优势，或(c)其生化纯化的难易性。这些标准没有考虑人类对于分支杆菌疾病自然产生免疫应答的抗原的反应性。一段时期，使用38kDa抗原提供了极高的血清灵敏性和特异性(Daniel，TM et al.，1987，Am Rev Respir Dis 1351137-1151；Harboe，M et al.，1992，J.Infect.Dis.766874-884；Ivanyi，J et al.，1989，supra)。然而，与本发明人发现的抗原的抗体相对比，抗-38kDa抗体的存在主要与治疗后的、后期的和复发性的TB相关(Bothamley，GHet al.，1992，Thorax.47270-275；Daniel etal.，supra Ma etal.，supra.)。
分枝杆菌蛋白命名的一个惯例是采用MPB和MPT编号。用MPB来表示从M.bovis BCG纯化的蛋白，其后的数字表示蛋白在PH9.5条件下于7.7％聚丙烯酰胺凝胶中的相对迁移率。MPT表示从Mtb中分离的蛋白质。在本发明以前的蛋白质检测中，这两种分枝杆菌的N-末端氨基酸序列之间没有任何区别。
Wiker及其同事已经研究了一系列Mtb分泌蛋白家族，它包括3个蛋白85A，85B和85C的复合物(也称作″85复合物″或″85cx″)(Wiker，H.G.etal.，1992，Scafzd.J.Immunol.36307-319；Wiker，H.G.etal.，1992，Microbiol.Rev.56648-661)。从分泌物中还得到了具有活性的Mtb的相关成分。尽管85复合物与细菌表面有关，该复合物还被认为是分枝杆菌培养液中分泌蛋白的主要成分。在大多数SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析中，85A和85C没有被很好解聚，然而，等电聚焦中产生了三个分离带。
已克隆出编码6个分泌蛋白85A，85B，85C，″抗原78″(通常指38kDa蛋白)，MPB64和MPB70的基因。位于分枝杆菌染色体中的相隔离位点的三个单独的基因编码85A，B和C(Content，J.et al.，1991，Infect.Immun.593205-3212)。编码抗原MPT-32(一种45/47kDa分泌型抗原复合物)的基因已被克隆出，被测序并被表达(Laqueyrerie，A.et al.，1995，Infec.Immuii..634003-4010)，并被指定为apa基因。需要进一步阐明Mtb蛋白和糖蛋白的生化和免疫化学性质，这在血清诊断中极具重要性。
下表显示的是Wiker及其同事描述的抗原85复合物与其它两个抗原(在SDS-PAGE中)的分子量，以及其它名称Ag85A＝MPT44＝31kDa
Ag85B＝MPT59＝30KDaAg85C＝MPT45＝31.5kDaMPT64＝26kDaMPT51＝27kDaAg78----＝38kDaMPT32＝45/47kDa(本发明人认为是38/42kDa)采用(1)纯化蛋白的多克隆兔抗血清(2)小鼠单克隆抗体(″mAb″)进行交叉免疫电泳法、SDS-PAGE和免疫印迹以及酶免疫检测(EIA)，Wiker小组研究了5种具有活性的分泌型Mtb蛋白之间的交叉反应。mAb HBT4与MPT51蛋白反应。
下表所列氨基酸序列显示了85A，85B，85C，1和MPT64片段的同源性。最上端的数字对应于显示的序列部分。确定了分离出的蛋白质的N-末端序列且通过视觉进行检查排列。MPT64的位置66至91的序列是从被克隆出的基因中推导出的。
15101520253035序列号85A(1-39)FSRPGLPVEYLQVPS PSMGRDIKVQFQSGGANSP ALYLL185B(1-39)FSRPGLPVEYLQVPS PSMGRDIKVQFQSGGNNSP AVYLL285C(1-37)FSRPGLPVEYLQVPSA SMGRDIKVQFQGGG PHAVYLL 3MPT51(1-32) APYENLMVPS PSMGRDIPVAFLAGG PHAVYLL4MPT64(66-91) APYE LNITSATYQS AIPPRG TQAWL 5MPT51的N-末端序列与Ag85各成分的序列相比具有72％的同源性(当3个Ag85成分的位置2处的P与位置7处的P对齐)。
对TB患者的研究显示了检测Ag85复合物抗体的灵敏度约为50％。关于特异性，Ag85各成分具有高度交叉反应性，因此，在健康对照组中发生阳性反应是预料中的(且已经发现了)，尤其是那些处于高度接触非典型分枝杆菌的地理区域中的人群。对照组的种类很大程度地决定着特异性程度。值得注目的是传统的BCG接种似乎不能产生明显的抗体应答，有趣的是当进行抗TB化疗时，分枝杆菌抗原的抗体数量增加了。一些研究已经验证了TB血清中或患有其它疾病的患者的血清中存在不同的Mtb抗原的抗体。参见，如Espitia，Cet等，1989，Clin Exp Immunol 77373-377；Van Vooren，JP etal.，1991，J Clin.Microbiol.292348-2350；Wiker等(supra)C.Espitiaet al.，1995，Infect.Immun.63580-584，利用抗M.bovis蛋白的兔多克隆抗血清和抗Mtb抗原的mAb，发现了Mtb 50/55kDa蛋白和M.bovis BCG 45/47kDa抗原的交互反应性。两种抗原都是分泌型糖蛋白。N-末端序列和这些蛋白质的全部氨基酸含量是非常近似的。2D凝胶电泳显示Mtb50/55kDa抗原至少有7种不同成分。在固相免疫检测中，在70％的肺TB患者(n＝77)的血清中发现有Mtb 50/55kDa纯化蛋白。Mtb 41kDa抗原的N-末端即MPT32与50/55kDa和45-47kDa蛋白的N-末端很相似。根据这些观察，作者推测到这些抗原具有用于诊断的潜力，然而，将这些抗原作为早期TB诊断试剂既没有人对此进行分析，甚至也没有人提出这个建议。
重要的是，在本领域中，分析处于不同疾病阶段的抗体还存在缺陷，这是本发明的主要目的之一。到目前为止，可能除MPT32(在此将作描述)之外，没有任何抗原表现出能成为TB早期阶段诊断检测的合适候选物。因为在人类自然感染和疾病发展中检测出的抗原/表位与接种动物疫苗的被动免疫中的抗原/表位有显著不同(Bothamley，G.etal.，1988，Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis.7639-645；Calle，J.et al.，1992，J.Immunol.1492695-2701；Hartskeerl，R.A.et al.，1990，Infect.Immun.582821-2827；Laal，S.etal.，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.881054-1058；Meeker，H.C.etal.，1989，Infect.Immun.573689-3694；Verbon，A.，1994，Trop.Geog.Med.46275-279)，因此迫切需要选择出能够激发人类免疫系统的抗原。这将需要鉴定出有用的蛋白抗原和肽表位，将其用于TB的早期诊断检测以及用于制备疫苗。
HIV感染者中的TB尽管有关未受HIV感染的TB感染者的文献很多，但是关于HIV/TB患者针对Mtb的抗体反应的报道却很少而且还存在争议。Farber，C.et al.，1990，J.Infect.Dis，162279-280，报导了8个HIV/TB患者中有7个存在p32抗原的抗体(同85A)。Da Costa，C.et al.，1993，Clin.Exp.Immunol.9125-29，报导了35％的这类病人中存在抗-脂阿拉伯甘露糖(LAM)抗体。Barer，L.et al.，1992，Tuber.Lung.Dis.73187-191，报导了36％的HIV/TB患者中存在抗-PPD抗体。Martin-Casabona，N.et al.，1992，J.Clin.Microbiol.301089-1093，报导了73％的这类患者存在抗-硫脂(SLIV)抗体。此外，vanVooren，P.et al.，1988，Tubercle.69303-305，报导了在一名HIV-TB患者中检测出抗-p32抗体，它比临床显示TB还早几个月的时间。而对于Ag60抗体(Saltini C.et al.，1993，Am Rev Respir Dis 1451409-1414；van derWerf，T.S.et al.，1992.Med Microbiol Immunol 18171-76)和Ag85B抗体(McDonough，J.A.et al.，1992，J Lab.Clin.Med.120318-322)在这些患者中都没有检测出。
因此，特别需要一种能够检测出HIV患者中的TB早期感染，因为这些人群是世界上最易于感染TB的人群之一。
尿中的抗体很多实验室已经报到了尿中存在抗体，主要是针对传染性试剂的抗体。例如，Takahashi S；etal.(Clin Diagn Lablmnlunol，1998，524-27)在接种过风疹疫苗的健康个体的尿和血清样品中发现了风疹病毒抗体。Shutov AM etal.Arkh(RUSSIA)1996，6835-37在尿中检测出引起出血热伴有肾脏综合症(HFRS)的病毒的抗体，并得出结论，即检测存在于血液和尿中的病毒抗体可被用作早期诊断中。Vereta LA；etal.(Vopr Virusol(RUSSIA)1993，3818-21)利用一种商用诊断非直接免疫荧光测定技术来检测HFRS患者尿样中的汉坦病毒抗体。Koopmans M etal.(J Med Virol，1995，46321-328)通过ELISA和免疫印记法揭示了尿样中人类巨细胞病毒抗体的存在。Zhang Xetal.(J Med Virol，1994，44187-191)利用商用免疫测定技术检测尿中的肝炎C病毒(HCV)抗体。同小组人员(Constantine NT etal.，Am J Clin Pathol，1994，101157-161)在尿中检测HIV抗体。Perry KR et al.，J Med Virol 1992，38265-270，在尿样中检测肝炎A和肝炎B核心抗原的IgG和IgM抗体。
一些日本研究人员(Hashida S et al.，J Clin Lab Anal，1994，8237-246；Hashinaka K et al.，J Clin Microbiol 1994，32819-22；HashidaSet al.，J Clira Lab Anal 1994，8149-156 Hashida S et al.，J Clin LabAnal1994，886-95)利用一种超敏酶免疫测定技术(免疫复合物转移酶免疫测定技术)与作为抗原的重组蛋白质通过检测尿样中HIV-1的IgG抗体来诊断无症状携带者体内的HIV-1感染。他们报导通过利用浓缩尿样并利用不同重组HIV抗原使得结合酶的活性得到更长时间的检测，从而提高灵敏度。
Urnovitz HB et al.，(Lancet Dec 11 1993，3421458-9)，发现在许可的血清EIA检测中HIV-1抗体显阴性的7名个体在尿EIA和western印记(WB)检测中却显阳性。Connell JAetal.，JMed Virol 1993，41159-64，描述了一种快速、简便和强的IgG-捕捉酶联免疫吸附检测法(GACELISA)，它适用于唾液和尿液中检测抗-HIV1和抗-HIV2抗体。这个实验室的一项早期研究(Connell JA etal.，Lancet，1990，3351366-1369)描述了通过GACELISA检测尿液中抗-HIV抗体。Gershy-Damet GM etal.Trans R Soc Trop MedHyg 1992，86670-671，利用检测法成功地在非洲进行了尿中HIV-1和HIV-2的诊断，用于未处理的唾液和尿样。他们发现这种检测在相同条件下与传统的EIAs法相比，对血清的检测精确度相同。
Dr.A.Friedman-Kien和他的同事在一项研究中对相同HIV感染者的成对的尿样和血清样本进行检测肝炎B表面抗原(HBs)、肝炎B核心抗原(HBc)、CMV和HIV的抗体(CaoY et al.，1989，AIDS.Res.Hum.Retrovir.5311)。所有血清中含有抗-HIV抗体的感染者其尿液中也存在抗-HIV抗体；而对于HBs和CMV抗体则不存在这样的相关性。尿液中的抗-HIV抗体属于IgG类，且gp160和gp120是了解最透彻的蛋白质。基于这些观察，形成了利用尿液诊断HIV-1的方法。
鉴于HIV感染者尤其是发展中国家的感染者普遍患有TB，以及血清诊断法中采集血液/血清存在风险和代价，本发明人评价TB患者的尿液中是否存在抗-分支杆菌抗体。发明人推断Mtb感染肺的粘膜表面，其可以诱导粘膜组织产生抗体，从而导致尿液中存在抗体。这些研究的正面结果如下述。利用尿液作为检测样品会受到公共卫生官员和产业界的欢迎。
上述引用文献并无意于认可任何一个是相关的现有技术。所有对于文献中关于日期或内容的描述只是基于申请人能够获得的信息，并不能确证其日期和内容的正确无误。
发明概述本发明人系统分析了TB患者的血清和尿液与Mtb抗原的反应性，以阐述在感染致病的早期阶段人类抗体应答的主要靶点。发明人观察到起初用E.coli抗原对患者血清进行吸附，成功地减少了交叉反应抗体的干扰，因此获得了一种血清学研究的新方法。通过免疫吸附血清能够鉴别疾病发展早期的大部分患者体内的抗体识别的Mtb抗原。这些抗原也因此在诊断TB方法中成为有用的工具。其中尤为突出的抗原是高分子量的分泌蛋白88kDa或85kDa(依据情况将在下面进行描述)。这些蛋白被称作“88kDa蛋白”，且随着以后的发现，它是glcB基因的产物，也被称作GlcB(见下)。
除了在疾病发展成为X-光放射学或细菌学症状之前用于患者的分枝杆菌疾病的早期诊断，本发明还首次提供了用在患有TB的高危人群上的低成本筛选方法的替代标记物。这种应用的发现是通过利用本发明描述的方法来分析感染HIV的TB患者(HIV/TB)的抗体在疾病发展的各阶段对于Mtb分泌抗原的反应。大多数的HIV/TB患者具有可检测到的Mtb分泌抗原的抗体，其比临床上显示出现活动性结核病早几个月甚至几年。这些患者被称作“HIV/pre-TB″。然而，与没有感染HIV的TB患者(称作″非-HIV/TB″)相比，HIV/TB患者具有显著低水平的抗体，表明抗体只对有限的Mtb抗原种类表现为特异性。上述的88kDa抗原的抗体在约75％的HIV/pre-TB血清患者中存在，这些患者最终发展为临床上的TB。没能形成抗-Mtb抗体的HIV/TB患者与抗体阳性的患者，其淋巴细胞外形没有区别。这些发现导致发明了用在HIV-感染者以及任何高危人群上的活动性临床前TB的血清替代标记物。因此，本发明提供了一种新的早期检测无免疫人群的Mtb感染的方法。利用该发现能够为结核疾病的早期检测做出卓越贡献，从而加快治疗。
本发明旨在提供一种用于早期检测结核分枝杆菌疾病或感染的抗原组合物，或用于结核分枝杆菌感染的免疫应用中，其包括(a)一种选自下列序列的肽(1)CGTDGAEKGPTYNKVRGDK(序列识别号108)；(2)KIGIMDEERRTTVNLKAC(序列识别号109)；(3)ELAWAPDEIREEVDNNC(序列识别号110)；(4)HRRRREFKARAAEKPAPSDRAG(序列识别号111)；(5)ARDELQAQIDKWHRRR(序列识别号112)；(6)LNRDRNYTAPGGGQ(序列识别号113)；(7)GAPQLGRWKWHDPWV(序列识别号114)(8)VGNLRIARVLYDF序列识别号117)；(9)QAQIDKWHRRRVI(序列识别号126)；(10)WHRRRVIEPIDMD(序列识别号127)；(11)IEPIDMDAYRQFL(序列识别号128)；(12)ITTTAGPQLVVPV(序列识别号134)；(13)PQLVVPVLNARFA(序列识别号135)；(14)VLNARFALNAANA(序列识别号136)；(15)ALNAANARWGSLY(序列识别号137)；(16)ARWGSLYDALYGT(序列识别号138)；(17)SVLLINHGLHIEI(序列识别号154)；(18)HGLHIEILIDPES(序列识别号155)；(19)GGQFTLPGRSLMF(序列识别号170)；(20)FVRNVGHLMTNDA(序列识别号172)；(21)DRVVFINTGFLDR(序列识别号191)；(22)NCQSILGYVVRWV(序列识别号216)；以及(23)GYVVRWVDQGVGC(序列识别号217)；前提条件是该组合物不是具有序列识别号106或序列识别号107序列的全长蛋白质；(b)(a)中肽的突变体或功能性衍生物，其保留与GlcB或MPT51的特异性抗体进行反应的反应性；或者(c)(a)中肽(1)-(23)中任意两种或多种的组合或(b)的突变体或功能性衍生物。
在一个实施例中，上述抗原组合物是一种融合多肽，其包括(a)肽(1)-(23)中的一种或多种或其变体，其与(b)相连(b)一种或多种蛋白质，其选自序列识别号106、序列识别号107的序列和其它早期Mtb抗原。
其中，融合多肽包括任选的一种或多种连接物，其连接任意两种或多种蛋白或肽。
还包括一种如上抗原组合物，其为(a)一种具有通式的肽多聚体P1n
其中P1是肽(1)-(23)中的任何一种或其替代突变体，n＝2-8，(b)一种具有通式的肽多聚体(P1-Xm)n-p2其中，P1和p2是肽(1)-(23)中的任何一种或其保守性替代突变体，并且其中(i)P1和p2可以相同或不同，P1-Xm中的每个P1可以是不同的肽或其紧邻的突变体；而且(ii)X是(A)C1-C5烷基、C1-C5烯基、C1-C5炔基、含有最多4个氧原子的C1-C5聚醚，其中，m＝0或1，n＝1-7；或(B)Glyz其中，z＝1-6，并且其中肽多聚物与GlcB或MPT51蛋白的特异性抗体反应。
本发明还旨在提供一种如上的抗原组合物，它是一种重组的肽多聚物，具有通式(P1-Glyz)n-p2其中，P1和p2是肽(1)-(23)中的任何一种或其保守性替代突变体，并且其中(a)P1和p2可以相同或不同，P1-Xm中的每个P1可以是不同的肽或其紧邻的突变体；(b)n＝1-100，且z＝0-6，并且其中，肽多聚物与GlcB或MPT51蛋白的特异性抗体反应。
一种用于早期检测结核分枝杆菌疾病或感染的抗原组合物，其包括一种或多种肽混合物或被连接成肽多聚物或融合蛋白，该一种或多种肽具有早期结核分枝杆菌抗原的一个片段序列或是该抗原的衍生物，所述抗原具有如下特征(i)与结核患者中的抗体发生反应，该患者处于比唾液涂片阳性和肺部空腔病变更早的阶段，且(ii)与健康对照组或潜伏非活动性结核的健康者的血清不发生反应该组合物不含有其它结核分枝杆菌蛋白，该蛋白不是早期结核分枝杆菌抗原。
本发明还提供上述抗原组合物的使用方法。一种优选的早期检测受试者分枝杆菌疾病或分枝杆菌感染的方法包括测定活动性TB疑似患者的生物液体样本是否存在上述肽或突变体、融合蛋白或肽多聚体的特异性抗体，其中抗体的存在表明疾病或感染的存在。
在上述方法中，生物液体样本优选取自具有活动性结核症状者，但是在可鉴别为后期结核病症状之前，后期结核病症状表现为(a)唾液或其它肺部相关液体涂片抗酸杆菌检查呈阳性，(b)肺部空腔病变，或(a)和(b)。
通常，本方法包括测试前从受试者获取生物液体样本的步骤。
上述方法在测试前优选包括将存在于结核分枝杆菌和其它菌种的蛋白中的交叉反应性表位或抗原的特异性抗体从样本中除去，例如，用E.coli抗原免疫吸附样本。
上述方法可以进一步包括测试样本中是否存在结核分枝杆菌的一种或多种其它早期抗原的特异性抗体，所述抗原选自(a)结核分枝杆菌蛋白GlcB蛋白，其具有序列识别号106的氨基酸；(b)结核分枝杆菌MPT51，其具有序列识别号107的氨基酸；(c)一种特征如结核分枝杆菌病抗原85C的蛋白质；(d)一种特征如结核分枝杆菌抗原MPT32的糖蛋白；以及(e)包括(a)-(d)中的一种或多种融合蛋白质。
上述方法中优选的受试者人，例如感染HIV-1人群或结核病的高危人群。
在上述方法的一个优选实施例中，生物液体样本为血清、尿或唾液。
该方法可以进一步包括对受试者的唾液或其它体液样品进行分枝杆菌的检测。
本发明还旨在提供一种用于分枝杆菌结核疾病早期检测的试剂盒，该试剂盒包括(a)一种如上所述的抗原组合物，和(b)用于检测与肽相结合的抗体的必须试剂。
该试剂盒也可以包括一种或多种结核分枝杆菌的早期抗原，例如，一种抗原，其选自(a)结核分枝杆菌蛋白GlcB蛋白，其具有序列识别号106的氨基酸；
(b)结核分枝杆菌MPT51，其具有序列识别号107的氨基酸；(c)一种特征为结核分枝杆菌抗原85C的蛋白质；(d)一种特征为结核分枝杆菌抗原MPT32的糖蛋白；以及(e)一种包括(a)-(d)中一种或多种的融合蛋白。
附图简述

图1显示下列组别的血清TBnegHIVnegPPD+对照组(O)；TBnegHIVnegPPDneg对照组(_)，TBneg，HIV+，无症状对照组(△)；和TB患者(●)在用E.coli溶解产物进行吸附之前和之后，与Mtb H37Rv的无LAM培养液滤液蛋白(LFCFP)的反应性。各数值是测试的OD值，其平均值是图中所示的水平短线。
图2显示下列组别的血清非-HIV，PPD皮肤测试阳性(PPD+)健康对照组(非-HIV/PPD)，非-HIV TB患者(非-HIV/TB)和感染HIV的TB患者(HIV/前期-TB，HIV/期-TB以及HIV/后期-TB)与Mtb的全部LFCFP的反应性。取舍点(cut-off)由平均光密度(OD)±3个标准偏差而定，该取舍点由健康对照组血清而得。
图3是一图表，其显示了后期(黑棒)和早期(白棒)TB患者的血清对于结核分枝杆菌LFCFP、纯化的Ag85C或富含三种早期抗原的三个组分(fraction)(13，10和15)的反应性(见括号内标示)。
图4是显示后期(黑棒)和早期(白棒)TB患者的血清对于结核分枝杆菌LFCFP、纯化的Ag85C或纯化的MPT32的反应性的图表。
图5是显示晚期TB患者的尿液和血清与LFCF和MP32蛋白的反应性。结果以阳性样品的百分比表示。
优选实施例的描述在下列描述中，将引用免疫学、细胞生物学和分子生物学领域中已知的方法文献。那些包括这些已知方法的出版物和其它说明的材料都在此引作文献而参考。阐述免疫学总原理的标准文献著作包括A.K.Abbas et al.，Cellularand Molecular Immunology(Fourth Ed.)，W.B.Saunders Co.，Philadelphia，2000；C.A.Janeway et al.，In2munobiology.The ImmuneSystem in Healtla and Disease，Fourthed.，Garland Publishing Co.，NewYork，1999；Roitt，I.et al.，Immunology，(current ed.)C.V.Mosby Co.，St.Louis，MO(1999)；Klein，J.，Immunology，Blackwell ScientificPublications，Inc.，Cambridge，MA，(1990)。单克隆抗体(mAbs)和其制备方法及用途描述于Kohler and Milstein，Nature 256495-497(1975)；U.S.Patent No.4,376，110；Hartlow，E.et al.，AntibodiesA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1988)；Monoclonal Antibodies and HybridomasA New Dimension in BiologicalAnalyses，Plenum Press，New York，NY(1980)；H.Zola et al.，inMonoclonal Hybridoma AntibodiesTechniques and Applications，CRCPress，1982)).免疫测定方法描述于IColigan，J.E.et al.，eds.，CurrentProtocols in Immunology，Wiley-Interscience，New York 1991(or currentedition)；Butt，W.R.(ed.)Practical ImmunoassayThe State of the Art，Dekker，New York，1984；Bizollon，Ch.A.，ed.，Monoclonal Antibodies andNew Trends ill Initiiunoassays，Elsevier，New York，1984；Butler，J.E.，ELISA(Chapter 29)，Invan Oss，C.J.etal.，(eds)，IMMUNOCHEMISTRY，Marcel Dekker，Inc.，New York，1994，pp.759-803；Butler，J.E.(ed.)，Immunochemistry of Solid-Phase Immunoassa y，CRC Press，BocaRaton，1991；Weintraub，B.，Principles of Radioimmunoassays，SeventhTraining Course on Radioligand Assay Techniques，The Endocrine Society，March，1986；Work，T.S.et al.，Laboratory Techniquesand Biochemistfy inMolecular Biology，North Holland Publishing Company，NY，(1978)(Chapterby T.Chard).
本发明提供了一种诊断性免疫测试方法以检测和/或定量分枝杆菌抗原的特异性抗体，尤其是分枝杆菌感染致病发展的早期和具有临床表征之前的抗体。基于这种检测，可能比以往更早地检测出TB，从而构建适宜的治疗方案。在本发明之前可获得的用于TB血清诊断的最好抗原是38kDa分泌蛋白，也称作Ag78(见上)。然而，本发明能够在缺乏38kDa抗原的可检测抗体的受试者中进行血清学反应检测。
免疫测试方法是基于本发明人发现某些Mtb抗原诱导人类反应早于其它抗原，后者只在已经发展成临床疾病后才诱导抗体。在感染HIV的免疫系统缺陷的患者体内，抗体与这些抗原中的部份产生的反应可以在TB的临床表征出现之前检测到。已经鉴定出五种分泌蛋白可作为具有诊断价值的早期抗原。尤其是一种优选的早期抗原为88kDa的分泌蛋白Mtb GlcB，其优选是富含半纯化的(至少50％的纯度)或高纯化的(至少95％的纯度，优选至少99％的纯度)。
本发明还提供了来自GlcB和MPT51的带有表位的肽，其与TB血清发生反应，且这些肽用于早期诊断的形式为肽(单肽或其混合物)、肽多聚体(合成或重组)，其包括一种或多种不同的含有表位的肽、或融合多肽，其包括至少两个全长的早期抗原蛋白质，并且还可以包括基于相同Mtb蛋白或其它Mtb蛋白的肽的其它表位。
本发明的方法进一步基于发明人的观念，即认为在分析通过粗制或半纯化抗原制备物而感染Mtb的患者血清的抗原反应性和特异性之前，首先清除交叉反应性抗原的特异性抗体(其不是Mtb特异性的)是很重要的。然而，一旦得到纯化抗原或基于本发明建立了表位特异性的竞争性EIAs(参见，例如，Wilkins，E.et al.，1991，Eur.R Clin.Microbiol.Infect.Dis.10559-563)，这种早先进行吸附的步骤就应该被免去了。
本发明关于(1)Mtb感染或致病，或感染者或患者，(2)抗体对Mtb抗原的反应，(3)Mtb抗原自身或(4)诊断测试，其中所用术语“早期”和“晚期”是根据TB发展阶段而被定义。早期和晚期(或后期)TB在下表中给出其定义。
因此，早期TB受试者是无症状的或更典型的是具有一种或多种“典型症状”(如发烧、咳嗽、体重减轻)。在TB早期，结核分枝杆菌太少以致其在唾液或其它体液涂片抗酸杆菌检测中不能被检测出，其它体液主要是那些与肺相关的液体(诸如，支气管洗液、支气管肺泡灌洗液、胸膜积液)。然而，Mtb杆菌存在于这些受试者中，而且这些杆菌是可以培养的，即Mtb杆菌能在体液这样的培养液中生长。最后，早期TB受试者可能会出现X光影像表征的肺部病变，如肺浸润但还没形成空腔。任何在早期阶段形成的抗体被称作“早期抗体”，而任何由这些抗体识别的Mtb抗原被称作“早期抗原”。抗体被称作“早期”并不意味着抗体不存在于后期的TB中。这样的抗体被预见存在于从早期TB至成熟阶段的发展过程中。

因此，术语“晚期”或“后期”的特征在于受试者具有明显的临床疾病和更后期的肺部空洞病变。在晚期TB，Mtb杆菌不仅可从唾液和/或其它上述体液涂片上培养得到，而且还大量存在于上述液体涂片中，并在抗酸杆菌实验中可被检测到。“晚期TB”或“晚期分枝杆菌疾病”与“后期TB”或“后期分枝杆菌疾病”可交互使用。在诊断的临床症状和其它特征性症状开始后首次出现的抗体(包括肺部空洞病变)为晚期抗体，由晚期抗体识别的抗原(不是早期抗体所识别的)为晚期抗原。
根据本发明，早期诊断检测必须能在比传统临床诊断方法诊断Mtb疾病的更早阶段快速地做出诊断才是有益的，所谓的传统临床诊断方法为放射学检查、细菌涂片和培养法或其它早于本发明的实验方法。(培养液阳性是最后的确诊检查，但其需要两周或更长时间)。
本免疫测试方法通常包括培养生物液，优选为TB疑似患者的血清或尿液，该生物液中还有包含一种或多种Mtb早期抗原的试剂。依据含有表位的肽单元，这些抗原可以结合为混合物或聚合蛋白质或肽多聚体。然后，测定样本中与分枝杆菌抗原结合的抗体。所谓“生物液”是指任何来自正常或疾病患者体内的可能包含抗体的液体，诸如血液、血清、血浆、淋巴、尿液、唾液、痰、眼泪、脑脊髓灌洗液、胸膜积液、胆汁、腹水、脓汁及类似物。在本发明所用该术语的含义范围内，其还包括组织提取液、或培养液，其中来自受试者的细胞或组织已经被培养。
分枝杆菌抗原组合物本发明的分枝杆菌抗原组合物或制备物可以是一种或多种分离出的结核杆菌分泌蛋白或肽的组合物。正如上所述，制备的该组合物可以是混合物或一种聚合蛋白或肽多聚体。
抗原组合物可以是一种或多种结核分枝杆菌蛋白或其带有表位的肽的完全纯化的或重组获得的制备物。此外，抗原组合物还可以是部分纯化或完全纯化的制备物，其含有一种或多种能与TB患者中的抗体结合的结核分枝杆菌表位。这些表位可以是早期抗原蛋白的肽片段，或结核分枝杆菌蛋白的其它“功能性衍生物”或如下所述的肽。
“功能性衍生物”是指早期抗原蛋白的一种“片段”“突变体”“类似物”或“化学衍生物”，其定义如下。功能性衍生物至少保留了一部分蛋白质的功能，主要是与早期抗体结合的能力，从而使其应用于本发明中。“片段”是指任何分子的一段，即较短的肽。“突变体”是指与全部蛋白质或其片段本质上相似的分子。突变体肽可以通过传统的化学法直接合成，或重组手段进行制备。抗原蛋白或肽的“化学衍生物”包括与天然蛋白质(或肽片段)正常部分不同的其它化学部分。肽的共价修饰也包括在本发明的范畴之内。这种修饰可以通过将肽的目标氨基酸残基与有机衍化试剂反应而完成，这些衍化试剂能够与所选择的侧链或末端残基发生反应。
在Mtb培养滤液中鉴别出的四种蛋白质或糖蛋白优选的是本发明的早期Mtb抗原(或抗原肽来源)。因此，尽管这些蛋白质是分泌蛋白，它也存在于杆菌的细胞制备物中。因此，这些早期抗原并无意于限制到分泌蛋白形式上。该蛋白特征如下(1)88kDa蛋白(GlcB)该蛋白是由本发明人从培养滤液中分离得到的Mtb分泌蛋白，其分子量为88kDa，等电点约为pH5.2。该蛋白在一个共同发明人的实验室中的所测分子量为82-85kDa(在另一个共同发明人的实验室中的所测分子量为88kDa)，PI为5.12-5.19。该蛋白最初被认为可与mAb IT-42和mAb IT-57反应，但之后发现分子量范围内的第二个蛋白，过氧化氢酶/过氧化物酶(katG基因产物)与这些mAbs发生反应。Th 88kDa蛋白是组分15(实施例I)和组分14(实施例II)的主要抗原成分。该蛋白对应于二维凝胶中Ref.No.124中所标出的蛋白质斑点(参见US Patent 6,245,331和WO98/29132(09July 1998公开)，二者全文都在此被引作文献；还参见下表4和6。因此，尽管分子量在测量时存在微小差别，但它们仍是一种蛋白质(尽管可能存在不同的异构体)。
正如实施例IV所描述，蛋白质的序列是本发明人依据氨基酸组合物而鉴定得到，该氨基酸组合物与要求优先权的申请，申请日1996年12月31日，申请号US 60/034,003之后获得的Mtb基因序列相关。该蛋白是Mtb glcB基因的产物，其编码了苹果酸盐合成酶并被称作GlcB蛋白。该蛋白的氨基酸序列(序列识别号106)如下MTDRVSVGNL RIARVLYDFV NNEALPGTDI DPDSFWAGVD KVVADLTPQN QALLNARDELQAQIDKWHRR RVIEPIDMDA YRQFLTEIGY LLPEPDDFTI TTSGVDAEIT TTAGPQLVVPVLNARFALNA ANARWGSLYD ALYGTDVIPE TDGAEKGPTY NKVRGDKVIA YARKFLDDSVPLSSGSFGDA TGFTVQDGQL VVALPDKSTG LANPGQFAGY TGAAESPTSV LLINHGLHIEILIDPESQVG TTDRAGVKDV ILESAITTIM DFEDSVAAVD AADKVLGYRN WLGLNKGDLAAAVDKDGTAF LRVLNRDRNY TAPGGGQFTL PGRSLMFVRN VGHLMTNDAI VDTDGSEVFEGIMDALFTGL IAIHGLKASD VNGPLINSRT GSIYIVKPKM HGPAEVAFTC ELFSRVEDVLGLPQNTMKIG IMDEERRTTV NLKACIKAAA DRVVFINTGF LDRTGDEIHT SMEAGPMVRKGTMKSQPWIL AYEDHNVDAG LAAGFSGRAQ VGKGMWTMTE LMADMVETKI AQPRAGASTAWVPSPTAATL HALHYHQVDV AAVQQGLAGK RRATIEQLLT IPLAKELAWA PDEIREEVDNNCQSILGYVV RWVDQGVGCS KVPDIHDVAL MEDRATLRIS SQLLANWLRH GVITSADVRASLERMAPLVD RQNAGDVAYR PMAPNFDDSI AFLAAQELIL SGAQQPNGYT EPILHRRRREFKARAAEKPA PSDRAGDDAA R在本发明人发现88kDa蛋白和其作为早期抗原的应用之后(见US 6,245,331和WO 98/29132)，Hendrickson RC等，J Cliva Microbiol 382354-2356(2000)通过血清蛋白分析结合串联质谱鉴定了被称作Mtb81的蛋白质并确定了其序列，该蛋白可以用于诊断TB，尤其是共感染了HIV的患者。重组的Mtb81通过E LISA方法在HIV血清阳性的25/27TB患者(92％)中检测到抗体，还在只有TB阳性的38/67个体(57％)中检测到抗体。在只是HIV血清阳性的11/11个体(100％)中没有观察到反应。在PPD阴性(0/29)和健康者(0/45)的血清中都没有检测到Mtb81阳性。只有2/57的PPD阳性个体检测到Mtb81阳性。对TB涂片阳性和HIV血清阳性、但针对另一个抗原的检测显示TB阴性的个体的血清检测到有抗Mtb81的反应性，其与患有肺癌和肺炎的个体血清反应相同。在该组中，Mtb81与26/37 HIV+/TB+血清(70％)发生反应，而2/37(5％)与38-kDa抗原发生反应。正如本发明人更早得到的结论一样，将Mtb81用作TB血清诊断中的补充性抗原具有很好的前景。
(2)抗原85C这是一种Mtb分泌蛋白，其分子量约为31kDa，等电点约为pH5.17。该蛋白与mAb IT-49发生反应，其也被指定为MPT45。Ag85C对应于表4或表6中Ref.No.119标出的蛋白斑点。
(3))MPT51该Mtb分泌蛋白的分子量约为27kDa，等电点约为5.91，氨基酸序列识别号为107，序列为APYENLMVPS PSMGRDIPVA FLAGGPHAVY LLDAFNAGPD VSNWVTAGNA MNTLAGKGISVVAPAGGAYS MYFNWEQDGS KQWDTFLSAE LPDWLAANRG AAQGGYGAMA LAAFHPDRFGFAGSMSGFLY PSNTTTNGAI AAGMQQFGGV DTNGMWGAPQ LGRWKWHDPW VHASLLAQNNTRVWVWSPTN PGASDPAAMI GQTAEAMGNS RMFYNQYRSV GGHNGHFDFP ASGDNGWGSWAPQLGAMSGD IVGAIRMPT51的全长核苷酸和氨基酸序列可以在1997年开始的GenBank中获得。(GenBank登录号CAA05211MPT51[Mycobacterium tuberculosis]submitted 17-OCT-1997by T.Oettinger)。公开的GenBank序列包括全长基因，因此，氨基酸序列包括33个残基信号序列，其在分泌前就从蛋白质上被切除了。因此，最终的蛋白质产物是序列识别号107所示的物质。
MPT51与mAb IT-52发生反应。该蛋白对应于二维凝胶的Ref.No.170所标出的蛋白质斑点，本发明中没有给出(在表4和6中所总结)。
(4)MPT32该糖蛋白的分子量为(双峰)38和42kDa(根据Espitia等(前述)报导是42/45kDa)，等电点约为pH4.51。其与多克隆抗-MPT 32抗血清发生反应。该蛋白是组分13(见实施例)的主要抗原成分。MPT32对应于表4和6中Ref.No.14标出的蛋白质斑点。
另外一种蛋白质，称作″49kDa蛋白″，分子量约为49kDa，等电点约为pH5.1。该蛋白质与mAb IT-58反应，对应于表4和6中Ref.No.82指出的蛋白质斑点。
分枝杆菌肽和功能性衍生物本发明还提供了早期抗原Mtb蛋白质GlcB和MPT51的肽。这种肽也可用在诊断中和疫苗组合物中。如实施例IX中所示，正如所预见的并且确实能与TB血清发生反应的优选肽包括，但不受限于(1)CGTDGAEKGPTYNKVRGDK，对应于N-末端加上C-G的GlcB残基151-167(序列识别号108)；(2)KIGIMDEERRTTVNLKAC，对应于GlcB残基428-445(序列识别号109)；(3)ELAWAPDEIREEVDNNC，对应于GlcB残基586-603(序列识别号110)；(4)LHRRRREFKARAAEKPAPSDRAG，对应于GlcB残基715-736(序列识别号111)；(5)ARDELQAQIDKWHRRR，对应于GlcB残基56-71(序列识别号112)；(6)LNRDRNYTAPGGGQ，对应于GlcB残基314-327(序列识别号113)；(7)GAPQLGRWKWHDPWV，对应于MPT51残基167-181(序列识别号114)；对TB血清中重叠的13-mer肽进行分析，以下16个肽中的氨基酸与GlcB(序列识别号106)的残基紧邻，这些肽包括或者成为血清反应性GlcB表位的一部分(8)LRIARVLYDF(序列识别号117)；(9)QAQIDKWHRRRVI(序列识别号126)；(10)WHRRRVIEPIDMD序列识别号127)；(11)IEPIDMDAYRQFL(序列识别号128)；(12)ITTTAGPQLVVPV(序列识别号134)；(13)PQLVVPVLNARFA(序列识别号135)；(14)VLNARFALNAANA(序列识别号136)；(15)ALNAANARWGSLY(序列识别号137)；(16)ARWGSLYDALYGT(序列识别号138)；
(17)SVLLINHGLHIEI(序列识别号154)；(18)HGLHIEILIDPES(序列识别号155)；(19)GGQFTLPGRSLMF(序列识别号170)；(20)FVRNVGHLMTNDA(序列识别号172)；(21)DRVVFINTGFLDR(序列识别号191)；(22)NCQSILGYVVRWV(序列识别号216)；以及(23)GYVVRWVDQGVGC序列识别号217)。
包括抗体表位的肽应该至少有约5个氨基酸。一个T细胞表位优选为约10-15个氨基酸。因此，本发明包括具有约5-30个残基的肽、具有天然Mtb早期抗原蛋白序列或是同源体、替代突变体、增加性突变体或删减性突变体。
当将肽施用于受试者时，尤其是在作为疫苗的本发明实施例中，该肽可以用酰基(缩写为Ac)和氨基(缩写为Am)分别在其N和C末端处封闭，例如N末端的乙酰基(CH3CO-)和C末端的氨基(-NH2)。
N-末端被封闭的功能基范围广泛，优选连接于末端氨基，可以是甲羧基；具有1-10个碳原子的烷酰基，如乙酰基、丙酰基、丁酰基；具有1-10个碳原子的烯酰基，如3-己烯酰基；具有1-10个碳原子的炔酰基，如5-己炔酰基；芳酰基，如苯甲酰基或1-萘甲酰基；杂芳酰基，如3-吡咯甲酰基或4-喹啉甲酰基；烷基磺酰基，如甲磺酰基；芳基磺酰基，如苯磺酰基或磺胺酰基；杂芳基磺酰基，如吡啶-4-磺酰基；具有1-10个碳原子的取代的烷酰基，如4-氨基丁酰基；具有1-10个碳原子的取代的烯酰基，如6-羟基-3-己烯酰基；具有1-10个碳原子的取代的炔酰基，如3-羟基-5-己炔酰基；取代的芳酰基，如4-氯苯甲酰基或8-羟基-2-萘甲酰；取代的杂芳酰基，如2，4-二氧-1，2，3，4-四氢-3-甲基-6-喹唑啉甲酰基；取代的烷基磺酰基，如2-氨基乙磺酰基；取代的芳基磺酰基，如5-二甲基氨基-1-萘磺酰基；取代的杂芳磺酰基，如1-甲氧基-6-异喹啉磺酰基；氨基甲酰基或硫代氨基甲酰基；取代的氨基甲酰基(R′-NH-CO)或取代的硫代氨基甲酰基(R′-NH-CS)，其中R′是烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、取代的烷基、取代的烯基、取代的炔基、取代的芳基、或取代的杂芳基；取代的氨基甲酰基(R′-NH-CO)和取代的硫代氨基甲酰基(R′-NH-CS)，其中R′是烷酰基、烯酰基、炔酰基、芳酰基、杂芳酰基、取代的烷酰基、取代的烯酰基、取代的炔酰基、取代的芳酰基、或取代的杂芳酰基，所有如上定义的基团。
C-末端封闭的功能基既可以是与末端羧基连接的酰胺也可以是与末端羧基连接的酯键。封闭基团是为了提供NR1R2的酰胺键，其中R1和R2可以独立地选自下列基团氢；烷基，优选具有1-10个碳原子，如甲基、乙基、异丙基；烯基，优选具有1-10个碳原子，如丙-2-烯；炔基，优选具有1-10个碳原子，如丙-2-炔；具有1-10个碳原子的取代的烷基，如羟基烷基、烷氧烷基、巯基烷基、烷基硫代烷基、卤代烷基、氰基烷基、氨基烷基、烷基氨基烷基、二烷基氨基烷基、烷酰基烷基、羧烷基、氨甲酰烷基；具有1-10个碳原子的取代的烯基，如羟基烯基、烷氧烯基、巯基烯基、烷基硫代烯基、卤代烯基、氰基烯基、氨基烯基、烷基氨基烯基、二烷基氨基烯基、烷酰基烯基、羧烯基、氨甲酰烯基；具有1-10个碳原子的取代的炔基，如羟基炔基、烷氧炔基、巯基炔基、烷基硫代炔基、卤代炔基、氰基炔基、氨基炔基、烷基氨基炔基、二烷基氨基炔基、烷酰基炔基、羧炔基、氨甲酰炔基；具有1-10个碳原子的芳烷基，如苯甲酰甲基或2-苯甲酰乙基；芳基，如苯基或1-萘基；杂芳基，如4-喹啉基；具有1-10个碳原子的烷酰基，如乙酰基或丁酰基；芳酰基，如苯甲酰基；杂芳酰基，如3-喹啉甲酰基；OR′或NR′R″，其中R′和R″独立为氢，烷基，芳基，杂芳基，酰基，芳酰基，磺酰基，亚磺酰基，或SO2-R_或SO-R_，其中R″是取代的或未被取代的烷基、芳基、杂芳基、烯基、或炔基。
提供酯键的封闭功能基是OR，其中R可以是烷氧基；芳氧基；杂芳氧基；芳烷氧基；杂芳烷氧基；取代的烷氧基；取代的芳氧基；取代的杂芳氧基；取代的芳烷氧基；或取代的杂芳烷氧基。
选择适宜的封闭基团能够增加肽的其它活性。例如，N-或C-末端帽上连接巯基可以使衍生的肽连接在其它分子上。
肽和衍生物的制备总的化学合成步骤本发明的肽可以用重组DNA技术进行制备。然而，一些较短的肽可以用固相合成方法制备，如Merrifield，J.Amer.Chem.Soc.，852149-54(1963)中所描述，当然也可以采用其它本领域熟知的其它等效的化学合成方法。固相肽合成可以从肽的C-末端开始，将保护的a-氨基酸偶联到适当的树脂上。这种起始原料可以将a-氨基被保护的氨基酸通过酯键与氯甲基化树脂或羟甲基树脂相连接，或通过酰胺键与BHA树脂或MBHA树脂相连而制备得。这种方法是本领域熟知的方法，如U.S.5,994,309(issued 11/30/1999)中所公开的内容，在此作为参考文献而引用。
氨基酸替代和增加突变体本发明还包括这类肽，其中至少一种氨基酸残基被去除，并优选只有一个残基被去除，并且与天然的Mtb序列相比在该位置上插入了一个不同的残基。有关蛋白质化学和结构内容，详见Schulz，G.E.et al.，Principles ofProtein Structure，Springer-Verlag，New York，1979，和Creighton，T.E.，ProteinsStructure and Molecular Principles，W.H.Freeman & Co.，SanFrancisco，1984，这些文献都在此被引作参考文献。在本发明的肽分子上进行的替代类型是保守性替代，其中下述基团中的一个可以被替换1.小分子脂肪族的、非极性的或微极性的残基如Ala，Ser，Thr，Gly；2.极性的、带负电荷的残基及其酰胺如，Asp，Asn，Glu，Gln；3.极性的、带正电荷的残基如，His，Arg，Lys；由于其不正常的几何特征，Pro大大限制了肽链。通过选择不太保守的替代物而使功能性特性发生显著变化，如不在上述基团范围内，则就是在超出该范围(或者是两个其它没有列出的氨基酸基团)内进行选择，这将使其在维持(a)替代物部分的肽骨架结构(b)靶点分子的电荷或疏水性，或(c)侧链的位阻等方面的效果会发生显著变化。本发明优选的替代物是那些肽分子特征不发生根本变化的物质。甚至当难于预见替代物的确定效果时，本领域技术人员可以通过常规筛选测试方法对其效果进行评价，所述测试方法优选为本发明描述的生物测试方法，其中优选为用抗血清、抗血清池、或单克隆抗体的血清测试法。肽性质的变化包括氧化还原作用或热稳定性，疏水性、蛋白水解降解倾向性或与载体聚合的趋势(或形成多聚体)都是通过本领域熟知的方法进行测试的。
Mtb肽的增加突变体优选包括1-4个氨基酸，也可以包括X个氨基酸，可添加在N-末端、C-末端或两个末端同时添加。添加在基本肽单元上的氨基酸并不影响该肽维持本发明的生物反应性，即抗原性(可被抗体或T淋巴细胞识别)或作为疫苗时的免疫原性。
作为疫苗的肽，优选为具有增强的稳定性和/或免疫原性的突变体，其采用传统的蛋白工程方法。在一个实施例中，通过在适宜的位置上引入一个或多个Cys残基来提高其稳定性，其中两个Cys残基之间形成了二硫键而使稳定性增加。另一个方法是在不妨碍肽的免疫活性的位置上，如N-和C-末端处，引入残基以形成α螺旋。
具有n个残基的肽或多肽，n-5个氨基酸可以被替代，前提条件是没有失去与早期Mtb抗体的免疫反应性。
还包括肽的化学衍生物。赖氨酸基和氨基末端残基可以用琥珀酸或其它羧酸酐进行衍生化。环状羧酸酐的衍生化具有逆转赖氨酸残基电荷的作用。其它适宜的衍生化含有α-氨基残基的试剂包括亚氨酯，例如甲基picolinimidate；磷酸吡哆醛；吡哆醛；氯硼氢化物；三硝基苯磺酸；O-甲基异脲；2，4-戊二酮；以及转移酶催化下与乙醛酸的反应。
羧基侧基，天冬氨酰基或谷氨酰基，可以通过与碳二亚胺(R-N＝C＝N-R′)反应而选择性地修饰，所述碳二亚胺可以是例如1-环己基-3-(2-吗啉基-(4-乙基))碳二亚胺或1-乙基-3-(4-氮鎓-4，4-二甲基戊基)碳二亚胺。天冬氨酰基或谷氨酰基可通过与氨基反应而进一步转变成天冬酰胺酰基和谷氨酰胺酰基残基。
其它的修饰包括脯氨酸和赖氨酸的羟基化，丝氨酰或苏氨酰残基的羟基磷酸化，赖氨酸氨基的甲基化(Creighton，supra，pp.79-86)，N-末端氨基的乙酰化和C-末端羧基的酰胺化。
多肽和融合肽(聚合蛋白质)本发明还包括长链肽或多肽，其中Mtb早期抗原肽或其替代物或增加的突变体或其化学衍生物的序列被重复两次至100次，中间可以具有，也可以没有间隔体或连接体。这样的分子在本领域中被称作多聚体、多联体或具有多个表位的聚合蛋白质，这些名称可互换使用，且在本发明中主要是指肽多聚体。当用重组方法制备，他们也可以被称作融合多肽或融合蛋白质。
肽多聚体是指下式中的″P″(P-Xm)n-P，其中m＝0或1，n＝1-100。X是间隔基，其含有1-20个甘氨酸或化学交联剂。因此，当m＝0时，肽之间没有间隔基。当n＝1时，多聚体是二聚体，等。
这些多聚体可以由本发明所提及的任何抗原肽或突变体构成。而且，一种肽多聚体可以包括肽单体的多种组合(单体可以是天然序列或其突变体)。因此一种多聚体可以包括第一个肽序列的几次重复，然后是第二个肽的一次或多次重复等等。这样的多聚体肽可以通过肽的化学合成，重组DNA技术或结合，如将重组制备得到的多聚体进行化学连接。
当通过化学合成制备时，多聚体优选具有2-12个核心肽序列的重复单元，更优选具有2-8个重复单元，多聚体中全部氨基酸数目不应该超过约110个残基(或其等效体，当包括连接体或间隔体时)。
优选的合成的化学肽多聚体具有通式；P1n其中，P1是一种天然的Mtb肽或其替代物或其增加的突变体，且n＝2-8，其中单独的肽或多聚体形式的肽具有必需的免疫反应性。
在另一个实施例中，一个优选的合成化学肽多聚体具有通式(P1-Xm)n-P2，其中P1和P2是Mtb肽或其增加的突变体，其中(a)P1和P2可以相同或不同；而且，多聚体中的每个P1可以是与其相邻肽不同的肽(或突变体)；(b)X是C1-C5烷基、C1-C5烯基、C1-C5炔基、最多含4个氧的C1-C5聚醚、其中m＝0或1，n＝1-7；X也可以是Glyz其中z＝1-6，且其中单独的肽或聚合体形式的肽具有与抗-Mtb抗体，优选为早期抗体，发生反应的免疫活性。
当采用重组方法制备时，间隔基是Glyz，如上所述，其中z＝1-6，多聚体可以具有表达系统所允许的核心肽序列的重复数，如2-100个重复单元。优选的重组法制备的肽多聚体具有通式(P1-Glyz)n-P2其中(a)P1和P2是如上所述的Mtb肽或其替代物或增加的突变体，其中P1和P2可以相同或不同；而且，多聚体中的每个P1可以是与其相邻肽不同的肽(或变体)。
其中，n＝1-100，z＝0-6；其中，单独的肽或聚合体形式的肽具有所需的免疫反应性。
在前述的肽多聚体中，P1和P2优选选自下述序列中的任何一种序列识别号为108-114；117；126-128，134-138，154，155，170，172，191，216，和217。
多聚体被任选在其N-末端和C-末端处封闭。
可以理解，这种多聚体可以由本发明所述的任何肽或突变体构建得到。尽管多聚体中的增加的突变体单体优选具有如上描述的生物活性，但这也不是必需的，只要这些单体能够使多聚体具有这样的活性即可。
本发明包括融合多肽，其可以包括上述肽单体的两个或多个重复单元构成的线性多聚体，肽单体可以各端点直接相连，也可以是单体重复单元之间具有连接体，并进一步融合成另一个多肽序列，以增强抗原肽的活性。
本发明中的多聚体和融合多肽也因此可以包括多个表位，这些表位来自相同的或不同的Mtb蛋白质，这些蛋白质不同时出现，即在天然Mtb蛋白质中处于相邻结构。
本发明还包括聚合蛋白质或融合蛋白质，它以多种结合方式结合了更长的多肽，甚至是全长的Mtb蛋白质，如GlcB，MPT51和其它本发明描述的Mtb早期抗原，诸如GlcB和MPT51的融合或者这两种与另一种或多种早期抗原蛋白的融合。这些全长蛋白质可以与较短的带有表位的Mtb肽或其突变体或与肽多聚体(相同-或不同的多聚体)结合成聚合蛋白质。这种融合蛋白在一些或所有蛋白质或肽单元之间任选地包括间隔体或连接体。
肽和多聚体可以通过化学连接而形成多聚体和更大的聚集体。优选的连接多聚体包括Cys，且通过残基的-SH之间形成二硫键而连接，从而形成支链和直链的肽或多肽。
除了上述的连接体外，本发明的多聚体和融合多肽可以包括可酶切的连接体。优选的酶为金属蛋白酶(metalloprotealse)、尿激酶、组织蛋白酶、纤溶酶或凝血酶。优选的连接体含有序列VPRGSD(序列识别号115)或DDKDWH(序列识别号238)。
这些肽可以以融合多肽的形式与其它蛋白质融合，其中融合多肽包括一个或多个肽单体或这些肽的混合物，其它蛋白质可以是例如载体分子或被用作疫苗组合物时能够促进免疫原性的蛋白质。
本发明保护范围内的其它组合物是前述的肽、多聚体或融合多肽，这些肽被固定在固体支撑物或载体上，以便用作免疫测试中。“固相支撑物”是指任何能结合抗原或抗体的支撑物。熟知的支撑物或载体包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、右旋糖酐、尼龙、淀粉酶、天然和人工修饰的纤维素、聚丙烯酰胺、聚偏二乙烯二氟化物、琼脂糖如Sepharose_和磁珠。支撑物材料可以具有任何可能的结构外形，只要固定其上的肽或多肽能够与其靶点分子，如抗体相结合。因此，支撑物外形包括微粒、珠、孔和不可渗透的条形和薄膜，反应容器如试管或微滴板的内表面，棒的外表面及类似物。本领域技术人员会获得很多其它的合适的载体用以结合肽，或者能够通过常规实验来确定载体。
下面详细描述的本发明的试剂盒可能包括一种或多种不同的肽组合物。
免疫测试在一个优选的实施例中，分枝杆菌抗原组合物与固相支撑物或载体接触，如硝酸纤维素或聚苯乙烯，使抗原组合物被吸附并被固定在固体支撑物上。然后将该固定的抗原与生物液体样品反应，用来测试抗-Mtb抗体的存在与否，样品中的任何抗体将与固定的抗原结合。用适宜的缓冲液清洗结合了抗体的固定物，然后引入用于测定抗体的可检测的标记结合物。结合物与固定的抗体结合。检测标记物是检测固定抗体的一种手段。
该测试中优选的结合物是不同种的抗-免疫球蛋白抗体(“第二抗体”)。因此检测人类抗体可以采用可检测的标记的山羊抗-人类免疫球蛋白“第二”抗体。然后可以第二次用缓冲液清洗固相支撑物以除去未结合的抗体。固相支撑物上结合的标记物的数量可通过与标记物类型相适宜的传统方法测定(见下)。
这样的“第二抗体”可以是特定的人类免疫球蛋白同型的表位的特异性抗体，如IgM，IgG1，IgG2a，IgA及其类似物，从而使得样品中的分枝杆菌抗原的特异性抗体同型被检测出来。可选择地，第二抗体可以是样品中的抗-Mtb抗体独特型的特异性抗体。
检测样品抗体的可选择的结合物，也可以使用其它与人类免疫球蛋白结合的已知结合物。实例有葡萄球菌免疫球蛋白结合的蛋白质，其中最被熟知的是蛋白质A。还有葡萄球菌蛋白质G，或蛋白质A和G之间重组的融合蛋白。蛋白质G(链球菌组G和C)与Ig分子的Fc部分结合，并与VH3区域上的IgG Fab片段相结合。Peptococcus magnus的蛋白质C结合到免疫球蛋白分子的Fab区域。还包括任何其它结合微生物免疫球蛋白的蛋白质，例如链球菌(例如，Langone，J.J.，Adv.ImmunoL 32157(1982))。
本发明的另一个实施例中，可能含有Mtb抗原特异性抗体的生物液体与能够固定可溶蛋白质的固相支撑物或载体相联。然后用分枝杆菌抗原试剂处理，该试剂是可检测的标记物，之后用适宜的缓冲液冲洗该支撑物。然后通过测定固定的可检测的标记物来测定结合的抗原。如果分枝杆菌抗原试剂不是可直接检测的标记物，则需将第二试剂，其包含可检测的Mtb抗原的标记结合物，通常是第二抗-Mtb抗体如鼠类mAb，与固定的抗原相结合。然后用缓冲液第二次清洗固相支撑物以除去未结合的抗体。然后通过传统方法测定上述固相支撑物上结合的标记物的数量。
“固相支撑物”是指任何能够与蛋白质类抗原或抗体或本发明所述的其它结合物相结合的支撑物。熟知的支撑物或载体包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚偏二乙烯二氟化物、右旋糖酐、尼龙、磁珠、淀粉酶、天然和人工修饰的纤维素、聚丙烯酰胺、琼脂糖和磁铁矿。根据本发明，载体的性质是可部分溶解的或不可溶的。支撑物材料可以是任何可能结构的形状，只要其能够与抗原或抗体相结合。因此，支撑物外形可以是球形，如珠子，或圆柱形，如试管内表面，或棒的外表面。表面也可以是平坦的，如纸、测试条等。优选的支撑物包括聚苯乙烯珠，96-孔聚苯乙烯微板和测试条，这些都是本领域所熟知的。本领域技术人员会了解很多用于结合抗体或抗原的其它适宜载体，或通过常规实验能够确定一些载体。
采用本发明描述的任何测定方法，本领域技术人员都能通过常规实验来确定每次测试的可操作性最佳测试条件。而且，根据具体操作需要，还可在测试中加入其它步骤，诸如清洗、搅拌、振摇、过滤及类似步骤。
本发明中，用于检测分枝杆菌抗原的特异性抗体的优选免疫测定方法是酶联免疫吸附测定法(ELISA)，或更常用的术语酶免疫测定法(EIA)。在该种测定方法中，与结合的抗体或结合的抗原试剂相结合的可检测标记物是一种酶。当与底物接触，该酶将与之发生反应，从而生成可以检测的化学结构部分，检测方法包括如光谱测定、荧光测定或视觉观察。本发明中用于可测定得标记试剂的酶包括，但不受限于，山葵过氧化酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、苹果酸盐脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、天冬酰胺酶、Δ-5-菑类异构酶、酵母醇脱氢酶、α-甘油磷酸脱氢酶、丙糖磷酸酯异构酶、葡萄糖-6-磷酸酯脱氢酶、葡萄淀粉酶和胆碱酯酶。对于EIA步骤的描述，参见Voller，A.等，J.Clin.Pathol.31507-520(1978)；Butler，J.E.，Meth.Enzymol.73482-523(1981)；Maggio，E.(ed.)，EnzymeImmunoassay，CRC Press，Boca Raton，1980；Butler，JE，InStructure of Antigens，Vol.1(Van Regenmortel，M.，CRCPress，Boca Raton，1992，pp.209-259；Butler，J.E.，Invan Oss，CJ et al.，(eds)，Immunochemistry，Marcel Dekker，Inc.，New York，1994，pp.759-803；Butler，J.E.(ed.)，Immunochemist7-y of Solid-Phase Immunoassay，CRCPress，Boca Raton，1991)。
在另一个实施例中，可检测的标记物可以是放射性标记物，该方法为放射免疫测定法(RIA)，其在本领域是熟知的方法。参见，如Yalow，R.et al.，Nature 1841648(1959)；Work，T.S.，et al.，Laboratory Techniques andBiochemistry in Molecular Biology，North Holland Publishing Company，NY，1978，这些文献在此引用为参考文献。放射同位素可以通过γ计数器、闪烁计数器或放射自显影术来检测。本发明尤其适用的放射同位素是125I，131I，35S，3H和14C。
也可以用荧光团标记抗原或抗体试剂。荧光标记的抗体暴露在适宜波长的光环境下，通过荧光团的荧光而使抗体被检测到。最常用的荧光团是荧光黄异硫氰酸酯、罗丹明、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二甲醛、荧光胺、或发射荧光的金属如152Eu或其它澜系元素。这些金属利用金属螯合剂与抗体结合。
本发明中采用的抗原或抗体还可以是通过结合化学发光的化合物而被标记进行检测。然后通过测定在化学反应过程中产生的光来测定化学发光物标记的抗体或抗原。化学发光标记物可以是发光胺、异发光胺、theromaticacridinium ester、咪唑、吖啶翁盐和草酸酯。同法，生物发光化合物如生物发光蛋白也可以用作抗原或抗体试剂的标记物。通过测定发光度而检测结合性。生物发光化合物包括荧光素、荧光素酶和发光蛋白质。
对于本发明的可检测的标记试剂可通过闪烁计数器进行检测，例如，可检测的标记物是放射性γ发射物；或通过荧光计检测，如标记物是荧光团。当采用酶标记时，可通过比色法测量酶引起生色底物发生转变所生成的有色产物来进行测定。也可以通过视觉将适当的标准品或对照品与酶反应产物进行颜色比较来进行测定。
本发明的免疫测定法可以是“双层”或“夹心”方法。待检测的含有抗体的液体可以与固相支撑物接触。加入分枝杆菌抗原后，再加入一定量的可溶性、可检测的标记抗体从而形成三级复合物，即固相抗体、抗原和标记的抗体，再进行该复合物的测定和/或定量测定。夹心检测法的描述参见Wide，Radioimmune Assay Method，Kirkhamet al.，Eds.，E.& S.Livingstone，Edinburgh，1970，pp 199-206。
RIA和EIA之外的方法还包括各种类型的凝集反应测试法，包括直接和间接法，这些方法都是本领域所熟知的。在这些测试方法中，含有抗原(天然或化学连接)的颗粒的凝集表明相对应的抗体的存在。任何颗粒包括胶乳、木炭、高龄石或膨润土，以及微生物细胞或红血球细胞，都可以作为可凝集载体(Mochida，US 4,308,026；Gupta等，J.Immunol.Meth.80177-187(1985)；Castelan etal.，J.Clin.Pathol.21638(1968)；Singer et al.，Amer.J.Med.(Dec.1956，888；Molinaro，US 4,130,634)。传统的颗粒凝集或红血球凝集测试法速度较快，但灵敏度低于RIA和EIA。然而，凝集测试法具有实验环境条件要求低的优点，其在发达程度低的国家中适用。
除了检测抗体，本发明还提供了测定并列举分泌分枝杆菌抗原特异性抗体的细胞的方法。例如，可以使用各种空斑或斑点检测，测试中，含有淋巴细胞的样品如外周血淋巴细胞与含有抗原的试剂混合。当样本中分泌抗体的细胞分泌抗体，该抗体与抗原发生反应，分泌抗体的细胞(或形成细胞的空斑)的数量就可以测定了。抗原可以与排列一层的指示剂颗粒，如红血球，优选绵羊红血球相结合。当单个细胞分泌抗体时，抗体与周围具有抗原的红血球相结合。通过加入补体成分使结合抗体的红血球溶解，导致红血球层产生“孔”或“空斑”。每个空斑对应于一个分泌抗体的细胞。在另一个实施例中，含有分泌抗体的细胞样本被加入到覆盖有含抗原试剂的表面上，试剂可以是诸如单独的分枝杆菌抗原或结合到牛血清白蛋白上的分枝杆菌抗原，该抗原试剂附着在聚苯乙烯上。在细胞分泌抗体后，该抗体与被固定的抗原相结合，然后将细胞轻轻冲洗掉。可以用改进的EIA方法或本领域熟知的其它染色方法使结合抗体在细胞原来存在的部位周围出现带色的“斑点”。(See，for example，Sedgwick，JD等，J Immunol.Meth.57301-309(1983)；Logtenberg，T.等，Immunol.Lett.9343-347(1985)；Walker，A.G.等.，J.Immunol.Meth.104281-283(1987)。
本发明还旨在提供一种用于实施上述方法的试剂盒或试剂体系。这种试剂盒包括试剂组合，其包括本发明所述方法中必需的基本试剂。试剂体系以各商业包装形式存在，其可以是组合物或混合物(试剂之间具有相容性)，为适合于测试装置的形状，或更典型的是试验试剂盒。试验试剂盒是一种或多种装有必需试剂的容器、装置、或其类似物的组合包装物，其通常包括检测操作的说明书。该试剂盒还可以包括装有物质的容器，这些容器可用于储存过程、使用过程或两个过程。本发明的试剂盒可以包括用于进行上述各种测试形式的配置和组合物。
例如，用于测定是否存在抗-Mtb早期抗体的试剂盒包含一种或多种早期Mtb抗原、其可以是可固定的形式或者已经被固定在固相支撑上，以及一种能够识别抗-Mtb早期抗体样本的可检测的标记结合物，如标记的抗-人类Ig或抗-人类Fab抗体。用于测定是否存在早期Mtb抗原的试剂盒包含一种可固定的或已固定的“捕捉”抗体，该抗体与Mtb抗原的一个或多个表位发生反应，以及一种可检测的标记第二(“检测”)抗体，该抗体能与捕捉抗体识别的Mtb抗原的另一个表位反应。试剂盒还可以包括任何常用的标记物或可检测的标记物，如放射同位素、酶、生色团或荧光团。试剂盒还可以包括能够与免疫复合物发生沉淀反应的试剂。
本发明的试剂盒还可以包括辅助化学试剂，如缓冲剂，以及使抗原与抗体发生结合的溶液成分。
本发明还提供了一种早期Mtb抗原的鉴定、分离和定性的方法。例如，一种被吸附的患者血清或血清池，其中包含一种或多种抗原的抗体，可被用在抗原的制备和纯化的初期阶段，以及用于蛋白质抗原的克隆过程中。该抗血清可以进一步吸附一种Mtb或其它分枝杆菌制剂，以提供其功能性上的单一特异性或多特异性。该“富含的”抗血清可以与标准生化纯化技术结合使用，来检测纯化过程的组分中抗原的存在与否。按照本领域的标准方法，抗血清还可以在抗原的亲合力纯化中作为一种免疫吸附剂，以一种固定的形式使用。此外，抗血清还可以用在表达克隆方法中，以检测菌落中的抗原或表达抗原的噬菌体菌斑中的抗原存在与否。
一旦抗原得到纯化，例如，通过使用已被确定是目标抗原的特异性抗体的患者早期抗体进行纯化，得到的抗原可以被用于动物的免疫，来制备高滴定量的抗血清或优选获得该抗原的特异性mAb。这样的动物抗血清或mAb可以作为患者抗血清的替代品，或与实验体液样品相结合用于竞争性免疫测定法中。因此，抗血清或mAb可以被用作制备或纯化抗原，或用在免疫测试中检测抗原，例如作为免疫测试夹心法中的结合物(捕捉抗体或检测抗体)。
本发明提供了一种免疫测定法，该方法用于检测来自Mtb感染疑似者的体液或体液的细菌培养液中是否存在Mtb早期抗原。一种灵敏的免疫测试方法，如EIA直接夹心法或竞争性EIA法能够检测皮克数量级Mtb蛋白(早期抗原)。竞争性检测法可以在抗原没有纯化的前提下，检测出Mtb抗原的特异性表位。这种测定法可以比标准细菌分析法(即，在琼脂上出现菌落)更早地检测出患者体内的Mtb。因此，该方法能在体液中的抗原被检测出的几个小时或几天后，为开始临床治疗的决定提供基础。该方法比传统上通常需要从患者样本中培养出Mtb微生物所需的2-4周(或更长)的时间具有明显的优越性。在感染的阶段越早，体液中Mtb的滴度值就越低，本发明的方法与传统诊断方法相比就越有利。多种Mtb抗原的很多免疫测定法都是本领域公知的，它们可以作为本发明早期抗原测定法的基础(Wilkins等，supra；Verbon，1994，supra；Benjamin，RG et al.，1984，J.Med.Micro.18；309-318；Yanea，MA等，1986，J.Clin.Microbiol.23822-825；Ma等，supra；Daniel等，1986，1987，supra；Watt.G et al.，1988，J.Infec.Dis.158681-686；Wadee，AA等，1990，J.Clin.Microbiol.232786-2791)。对于Mtb抗原的竞争性EIA实例，见Jackett等，supra。
在一个优选的免疫测定夹心法中，人类抗血清(或池)或mAb，优选鼠，用作捕捉抗体，被固定在固相支撑物，优选微板上。将试验抗原制备物，如Mtb培养上清液或提取液加入到被固定的抗体中。冲洗后，在有一定数量的针对特定表位的mAb，优选鼠源mAb存在的条件下，结合第二“检测”抗体，如相同抗原的特异性鼠mAb或优选相同蛋白质的不同表位的特异性mAb。检测mAb可以是与酶相结合的。此外，第二步试剂如鼠免疫球蛋白特异性的酶标抗体可被用作检测被固定的抗原。
本发明分离出一种Mtb抗原，它然后被用于制备一种或多种表位特异性的mAb，优选在小鼠中制备。用已知的与早期抗原具有反应性的患者血清筛选这些推定的早期Mtb特异性mAb。然后，将这种方式制备的鼠mAb用于早期TB的高灵敏性表位特异性的竞争性免疫检测中。因此，通过与已知的mAb竞争性结合纯化的早期抗原的能力，来检测患者样本中Mtb早期表位的特异性抗体的存在与否。这种测试方法所需分枝杆菌制剂比纯品还少，因为在竞争性测试条件下，mAb为检测针对表位(对于该表位，mAb是特异性的)的患者抗体提供了必需的特异性。
除了检测早期Mtb抗原或早期抗体外，本发明还提供了一种采用如上所述的EIA法检测包含早期Mtb抗原的免疫复合物的方法。循环性免疫复合物被认为具有TB的诊断价值。(参见，例如，Mehta，PK等，1989，Med.Microbiol.Immunol.178；229-233；Radhakrishnan，VV等，1992，J.Med.Microbiol.36128-131)。测试免疫复合物的方法是本领域所熟知的。复合物可以在酸性条件下分解，再用免疫测定法测定得到的抗原和抗体。参见，例如，Bollinger，RC等，1992，J.Infec.Dis.165；913-916。可以用已知方法如聚乙二醇沉淀法将免疫复合物沉淀，来直接分析或进行分解。
如上所述的纯化的Mtb早期抗原优选采用重组方法制备。参见实施例IV。传统的细菌表达体系是利用革兰氏阴性菌如E.coli或Salmonella种。但这样的体系不适用于制备Mtb抗原(Burlein，JE，InTuberculosis；Pathogenesis，Protection and Control，B.Bloom，ed.，Amer Soc Microbiol，Washington，DC，1994，pp.239-252)。而是，其优选利用同源分枝杆菌宿主进行重组制备早期Mtb抗原蛋白或糖蛋白。控制方法和基因表达方法在Burlein，supra.中有描述。在分枝杆菌宿主，尤其是M.bovis(菌种BCG)或M.smegmatis中的表达是本领域所熟知的技术。两个实施例，一个是分枝杆菌基因(Rouse，DA等，1996，Microbiol.22583-592)和另一个非分枝杆菌基因，如HIV-1基因(Winter，N等，1992，Vaccines 92，Cold Spring Harbor Press，pp.373-378)在分枝杆菌宿主中被表达，在此引用为本领域的实例。前面三个参考文献在此全文被引作参考文献。
尿中的抗体检测本发明还提供了一种尿液中TB的诊断方法，其可以被用作独立的诊断试验，或作为前述血清诊断方法的附属方法。该方法能够使操作者(1)确定TB早期患者(非空洞性、涂片阴性)和感染HIV的TB患者的尿液中是否存在抗-分枝杆菌抗体；(2)确定特异性分枝杆菌抗原的特征，如培养滤液中的分枝杆菌抗原，这些抗原具有稳定的、强烈的与尿液中抗体发生反应的反应性；以及(3)得到能被尿液中的抗体识别的抗原。
涂片阳性(＝晚期)病例中只诊断出50％的TB病例，而相对早期的TB患者通常涂片检测是阴性的。而且，在HIV流行的发展中国家，感染HIV的TB患者的数量和比例在增加。
从无-空洞性和/或涂片阴性，培养液阳性的TB患者和感染HIV的TB患者中获得血清和尿样。含有PPD-阳性的人群和PPD-阴性的健康者、无结核的HIV感染者、或与TB患者密切接触的人群的血清和尿样都可以作为阴性对照物。
血清样本与结核分枝杆菌的培养滤液蛋白和纯化抗原(如所述的MPT32，Ag85C和88Kda)的反应性，优选通过ELISA进行测定。所有血清在进行ELISA测试之前，优选除去交叉反应的抗体。
下面所描述的是优选的测试方法，其无意于限制到具体步骤(或步骤顺序)、条件、试剂和材料的数量。
简言之，ELISA板上的孔用200μl的E.coli溶解产物(500μg/ml的悬浮液)包被(Immulon 2，Dynex，Chantilly VA.)，孔被5％牛血清白蛋白(BSA)封闭。将血清样品(用PBS-Tween-20稀释为1∶10)用E.coli溶解产物吸附8次。然后将吸附后的血清用于ELISA测试中。
50μl抗原，以2μg/ml悬浮在包被缓冲液中(除了所有培养滤液蛋白质是以5μg/ml使用以外)，与ELISA板的孔中物质结合过夜。用PBS(磷酸缓冲盐)清洗3次，孔被7.5％FBS(胎牛血清，Hyclone，Logan，UT.)和含2.5％BSA的PBS封闭，在37℃下保持2.5小时。每孔加入50μl的血清样本，样本以预定的比例稀释(培养滤液蛋白稀释1∶1000，Ag85C稀释1∶50，MPT32稀释1∶150，88kDa抗原稀释1∶200)。于37℃下，抗原抗体结合达90分钟。用PBS-Tween-20(0.05％)清洗板6次，每孔加入用PBS-Tween-20以1∶2000稀释的50μl结合碱性磷酸酯的山羊抗人类IgG(Zymed，CA)。60分钟后，用Tris缓冲盐水(50mM Tris，150mMNaCl)清洗板6次，用Gibco BRL扩增系统(Life Technologies，Gaithersburg，MD)显色。加入50μl的0.3M H2SO4使反应停止，读取490nm的吸收度。ELISA检测的取舍点是平均吸收(光密度O.D.)+3阴性对照组的标准偏差(SD)，其中该对照组包括PPD阳性和PPD阴性健康者。
尿样与多种抗原的反应性最初是用上述未稀释的尿样测定。对尿样的ELISA测定，本发明人得到的结果(见实施例VII)显示了培养滤液蛋白的较佳浓度是每孔125μl的4μg/ml悬浮液，而对于MPT32，是每孔125μl的2μg/ml溶液。尿液在抗原包被的孔中放置过夜。如果涂片阴性和感染HIV患者的尿中抗体滴度值低于观察的涂片阳性患者的抗体滴度值，则有必要第一次浓缩尿样。浓缩时，优选使用Amicon浓缩器，除去分子量为30kDa的蛋白质。测定浓缩后的尿样中是否存在上述抗原的抗体。这些测试的较佳条件很易确定。利用一种或多种抗原，测试尿样和血清两种样本，很容易确定抗体的灵敏性和特异性。
如实施例VII中所描述，ELISA和1D SDS-PAGE分离的培养滤液蛋白表明，尿液抗体是针对血清抗体所识别的相同抗原的抗体，只是尿液抗体滴度值较低。根据蛋白质与不同抗分枝杆菌单克隆抗体的反应性而鉴定的几种蛋白质，显示出培养滤液蛋白2D图，或对肽进行测序(如本发明所描述的，还可参见Sonnenberg，M.G.等，1997，Infect.Immun.654515)。
基于该图，本发明人得到抗原的2-D图，该抗原被早期血清抗体(来自涂片阴性患者)，以及来自晚期患者、涂片阳性的未感染HIV的TB患者以及感染HIV的TB患者的抗体所识别(在实施例中有描述)。通过筛选确定除了MPT32，Ag85C和88kDa蛋白质外，测试中所包括的其它抗原是否为较佳。优选确定是否抗-MPT51抗体在尿液中能很好地被检测出，因为该蛋白质在TB早期和晚期都被血清抗体高度识别，它的特性和序列都是已知的。
Mtb的培养滤液抗原在2-D凝胶上被分开，并被转移以获得2-D斑点，如下所述。简言之，70μg的培养滤液蛋白质被悬浮于30μl的等电聚焦样本缓冲液中(如，9M尿素、2％NP-40，5％β-巯基乙醇，和5％的PH3-10或PH4-6.5的两性电解质)。以下实施例中所用的两性电解质被称作“两性电解质TM”，它是甘氨酸、甘氨酰甘氨酸、胺和表氯醇的共聚体。在实施例的2-D凝胶分析中的等电聚焦步骤中，采用PH范围不同的两种两性电解质TM(PH3-10或PH4-6.5)。(正如实施例中所采用的，这两种渗质的两性电解质类别编号为17-0456-01和17-0452-01。)将上述样本在20℃下培养3个小时。将该制备液中的25μl用于6％聚丙烯酰胺IEF管凝胶中，其中凝胶含有5％的PH3-10和PH4-6.5的两性电解质，两种电解质比例为1∶4，在1kV下聚焦达3个小时。聚焦后，管凝胶在样本转移缓冲液中浸泡30分钟，然后用15％SDS-聚丙烯酰胺凝胶进行第二维电泳。每种凝胶先进行20mA达0.3小时的电泳，然后再进行30mA达1.8小时的电泳。分离到的蛋白转移进行后续没有印迹。用PBS清洗该2-D印记斑点，再用5％BSA封闭2-2.5个小时。再一次清洗斑点后，将斑点置于尿样中(未稀释或浓缩的)，振摇过夜。随后，用PBS-Tween清洗，斑点与偶联有碱性磷酸酯酶的抗人类IgG接触，然后再与适宜底物相接触。根据2-D图鉴定与尿样反应的抗原。被涂片阴性、无空洞(＝早期)的TB患者、涂片阳性(＝晚期)TB患者以及感染HIV的TB患者尿样中的抗体所识别的抗原得到了鉴别。
将尿样中的抗体以及血清中的抗体所识别的抗原用于优选的诊断测定方法中。优选的抗原是上述的88kDa蛋白Glcβ或MPT51及其表位，这些抗原存在于上述的各种肽中。克隆并表达了编码这些蛋白质或片段或其变体的DNA。
正如本发明所述，Mtb培养滤液制备液包含＞100个不同的蛋白质(205个蛋白质斑点)，大部分49-76kDa范围内的蛋白质在培养介质中的表达量很少(Sonnenberg et al.，supra)。这也许是由于在少量介质中培养Mtb的结果，这样可避免与大量介质中的蛋白质分离困难的问题(BSA，casein digests，etc.)。如果免疫反应蛋白质能够在培养滤液中很好的表达，而且可用凝胶进行分离，它就可以从PVDF斑点中分离出并被测序。因为，Mtb的整个染色体序列是已知的，将肽序列用于鉴定蛋白质肯定是准确的。
编码该蛋白的基因的核苷酸序列(即，开放阅读框架)则成为染色体DNA中相关的DNA进行PCR扩增的基础，接着克隆到表达载体中。因为很多培养滤液蛋白质含量少，可以采用另一种也许是更可靠的方式，即利用尿液抗体免疫筛选一种Mtbs的表达库以获得编码相关蛋白质的基因。
这些方法可以被用来，例如，克隆MPT51基因或鉴定49-76kDa区域的免疫反应性蛋白质。对于MPT51的表达，优选使用穿梭载体pVV16；该载体具有E.coli的复制起点，分枝杆菌pAL5000的复制起点，抗潮霉素基因和hsp60启动子。在C末端进行修饰以编码六个His残基。该载体可以在E.coli或M.smegmatis中表达。因为在E.coli宿主中表达的分枝杆菌蛋白经常比在分枝杆菌宿主中表达的相同蛋白的免疫反应性差，因此优选在M.smegmatis中表达抗原。对于分枝杆菌宿主中的基因表达方法有详细的描述(Gaora，PO et al.，1997，Med.Principles Pract.691)。
简言之，为了将特定基因克隆到表达载体中，用含有限制位点的引物对目标基因进行PCR扩增来获得结构内融合(in-frame fusions)。纯化PCR产物，用适宜的限制性酶消化该产物并再次纯化。用适宜的限制性酶剪切载体DNA，然后进行纯化。将PCR产物和载体结合，并电穿孔进入DH5α中，在潮霉素的存在下生长过夜。几种耐受抗菌素的菌落在少量的介质中生长，质粒DNA通过小量制备被分离出。检查这些菌落中插入物的大小。对一种或多种菌落的插入物进行测序。
为了电穿孔进入M.smegmatis中，振摇7H9介质使细菌生长达到0.8-1.0吸收值。收集细菌，用冰水清洗两次，用冰冷却的10％甘油清洗一次，并悬浮其中。用菌落中的质粒DNA电穿孔进入细胞，质粒DNA插入物已被测序。电穿孔了的细胞在7H9中生长3-4个小时，然后放在含有噬菌体的板上。在少量介质中培养48-72小时，生长出几种耐受菌落。用超声波降解M.smegmatis细胞球，溶解产物通过SDS-PAGE被分离，再通过与含有抗体的尿样反应来确定免疫反应性蛋白质的存在与否。扩增表达所需蛋白质的菌落，用商业用镍-琼脂柱(Qiagen)纯化标记His的重组蛋白质。
重组蛋白质与整个尿样的反应性通过如上所述的ELISA测定法进行评价。抗原组合，优选单个表位的组合可表现出最佳的灵敏性和特异性。
为了制备一种或多种49-67kDa范围内的蛋白质，用抗体阳性的尿样筛选Mtb染色体DNA表达库。10-15名TB患者中的一组尿样(Mtb的培养滤液蛋白质在免疫印记检测-显示强反应性的样本)被E.coli溶解产物所吸附，用适宜稀释浓度筛选表达库。
简言之，将感染有适宜噬菌体菌斑形成单元的E.coli Y1090放在LB板的上层琼脂上。42℃条件下，2.5个小时后，将采用异丙基β-D硫代半乳糖苷(IPTG)饱和的硝酸纤维素滤膜置于该板的上端，在37℃下，放置2.5小时。取走滤膜并彻底清洗，然后置于尿样中过夜。再次清洗，然后将滤膜置于碱性磷酸酯酶偶联的抗人类IgG的1∶1000稀释液中，然后加入BCIP-NBT底物。将阳性菌斑(重组噬菌体)置于最初的板上，剪切并再次筛选，然后纯化。
用尿抗体筛选的库可以鉴别几种蛋白质。为了鉴定表达抗原的克隆，其中该抗原能被多数患者的抗体识别，将克隆的噬菌体用于在E.coli Y1089中构建溶原性细菌。溶原性细菌的单菌落在LB介质中，于32℃下生长，直至600nm时的吸收度为0.5。通过升温至45℃来诱导溶原性细菌表达重组蛋白质，并加入IPTG(10mM)。培养物在37℃下，再培养1.5小时来积聚重组蛋白质，收集细菌球。细菌球在少量的PBS中进行超声波降解，溶解产物在10％ SDS-PA凝胶上被分离，然后在硝酸纤维素膜上进行电印记。印记用20-25名TB患者的尿样进行测试，编码能被所有或大部分尿样所识别的强免疫反应性的蛋白质的克隆基因则被鉴定出。仅使用E.coli Y1089的溶解产物或λgtl 1载体溶原化的Y1089的溶解产物作为对照。
将编码强免疫反应性蛋白质的重组克隆的DNA用商用Wizard LambdaPreps DNA纯化体系(Promega)分离，再用EcoRI消化，从而得到插入片段。将克隆中插入的DNA亚克隆至pGEMEX-1载体(Promega)中，其在EcoRI克隆位点上的阅读框与λgtl 1相同。将重组质粒(Pgemex加上克隆的插入DNA)转染至有活性的E.coli JM 109细胞中。用Wizard Plus Minipreps(Promega)分离质粒DNA，并用引物从SP6和T3引物特异性启动子开始自动测序，跟随引物移动的启动子从侧面与PGEMEX-1的多克隆位点相接。将核苷酸序列用于针对Mtb基因序列的类似研究中来鉴定蛋白质，并获得全基因的序列。
一旦蛋白质被鉴定出，基因序列也就清楚了，按照上述克隆MPT 51基因的范例克隆该基因来进行表达。
总之，通过血清学研究已确定了抗原或表位的组合，上述鉴定和制备的新抗原/表位为灵敏的TB早期诊断测试提供了基础。如果尿样中抗体检测灵敏度足够，则无须血液检测。否则，采用血清+尿样的测试方法也可以得到灵敏的诊断测试。所述抗原以低成本的形式(浸入条或流动盒)为诊断TB提供了廉价、快速的方法。
疫苗前述内容和下述实施例证明感染Mtb的患者体内确实产生了本发明所述的早期抗原的抗体。这些抗原能激发免疫系统并产生免疫反应。因此，可以设计疫苗组合物和使用方法来增强这种免疫性，优选在细菌感染能够被阻止或推迟的阶段激发免疫反应。疫苗组合物尤其被用于预防高危人群的Mtb感染。疫苗组合物和方法也用于兽医用途。
因此，本发明包括一种疫苗组合物，它能使受免疫的个体对Mtb感染获得免疫。一种Mtb早期抗原，优选本发明所述四种抗原之一，或抗原中的一种肽，被作为活性成分制备成疫苗组合物。这四种蛋白质是(a)pI值约为5.2，序列识别号为106的88kDa蛋白质；(b)特征为Mtb抗原85C的蛋白质；(c)特征为Mtb抗原MPT51(序列识别号107)的蛋白质；和(d)特征为Mtb抗原MPT32的糖蛋白。疫苗也可以包括一种或多种本发明所述的蛋白质，其肽或功能性衍生物，或编码蛋白质的DNA，和药用载体或溶媒。
用于疫苗组合物的优选的肽包括上述诊断组合物中所描述的23种肽，这些肽可单独使用、联合使用或聚合成线性聚合体。
在一个实施例中，疫苗包括一种融合蛋白质或肽多聚体，所述融合蛋白质或肽多聚体包括一种Mtb早期抗原，如全长蛋白质和/或一种或多种上述肽。
疫苗组合物中可以进一步包括一种佐剂或其它免疫激发剂。用于疫苗的Mtb早期抗原蛋白质或其带有表位的肽优选是重组制备所得，优选在原核细胞中制备。
优选的免疫原是全长蛋白质或较长的带有表位的Mtb早期抗原蛋白质片段，尤其是那些与早期抗体具有反应性的片段。如果是较短的带有表位的片段，如含有20个氨基酸或更少的片段作为疫苗活性成分，将肽与免疫性载体偶联来增强免疫性会更有利。这种偶联是本领域熟知的技术，其包括用连接体进行偶联的标准的化学偶联技术，如Pierce Chemical Company，Rockford，Illinois中所描述的。适宜的载体是诸如钥孔戚血蓝蛋白(KLH)、E.coli pilin蛋白k99，BSA，或轮状病毒VP6蛋白的蛋白质。
另一个疫苗实施例是肽多聚体或融合蛋白，其包括Mtb早期抗原蛋白或被线性融合至另一个氨基酸序列中的带有表位的肽。由于易于控制重组物质，一个单一的融合蛋白分子中可以包含多拷贝的选择性表位区域。此外的其它方法是，将几种不同的表位区域“混合并匹配”至单一多聚体或融合蛋白中。
这类活性成分优选是重组产物，优选作为蛋白质或肽疫苗施用。另一个实施例中，疫苗的形式是细菌菌株(优选是已知的“疫苗菌株”)，其基因被转染以表达蛋白质或带有表位的肽。一些已知的Salmonella疫苗菌株将在下面描述。Salmonella dublin活疫苗菌株SL5928 aroA148fliC(i)Tn10 and S.typhimurium LB5000 hsdSB121 leu-3121(Newton S.M.et al.，Science1989，24470)。
表达本发明的Mtb蛋白质或片段的Salmonella株可用已知的方法构建。因而，构建一种编码蛋白质或肽的质粒。该质粒可以首先在适宜的宿主如E.coli株MC1061中进行筛选。然后将纯化的质粒导入S.typhimurium株LB5000中，使得质粒DNA被适当修饰以导入Salmonella疫苗株中。从LB5000中分离的质粒DNA通过电穿孔被导入如S.dublin株SL5928中。由SL5928中的质粒编码表达的Mtb蛋白或片段可通过细菌溶解产物和相关抗原或表位的特异性抗体的Western blot测试而得到验证。
蛋白质或肽疫苗组合物中的活性成分或活性成分混合物，可采用传统疫苗制剂的方法制备。活性成分通常溶解或悬浮于药用载体，诸如磷酸缓冲盐中。疫苗组合物可以包括一种免疫激发剂或佐剂，如完全或不完全弗氏佐剂、氢氧化铝、脂质体、珠子如乳胶或金珠、ISCOMs及类似物。例如，肌内或皮下注射0.5ml的完全弗氏佐剂或副作用小的合成佐剂，优选用于所有的初始免疫中；也可接着注射不完全弗氏佐剂作为强化注射。制备疫苗的常用方法在Remington′s Pharmaceutical Science；Mack Publishing CompanyEaston，PA(最近版本)中有描述。
脂质体药物组合物中的活性蛋白质被分散其中或存在于微粒中，该微粒由附着于油脂层的水性中心层组成。活性蛋白质优选存在于水层和油脂层里或层外，或在任一情况下处于非均相体系中，这就是通常所说的脂质体悬浮液。疏水层或油质层，通常包括磷脂如卵磷脂和鞘磷脂，载体如胆固醇，或多或少的离子表面活性剂如二酰基磷酸酯、硬脂酰胺或磷脂酸和/或其它疏水物质。佐剂，包括脂质体，将在以下文献中讨论，这些文献在此作为参考Gregoriades，G.et al.，Immunological Adjuvants and Vaccines，PlenumPress，New York，1989 Michalek，S.M.et al.，″Liposomes asOralAdiuvants，″Curr.Top.Microbiol.Immunol.14651-58(1989)。
疫苗组合物优选包括(1)有效量的活性成分，即蛋白质或肽，以及(2)适宜量的载体分子，或者如果需要的话包含载体赋形剂，(3)防腐剂、缓冲液及类似物。疫苗制剂在Voller，A.et al.，New Trends and Developments inVaccines，University Park Press，Baltimore，Maryland(1978)中有描述。
关于所有激发抗体产生的免疫原组合物，本发明有效量的免疫原蛋白质或肽必须依据经验来确定的。被考虑的因素包括天然肽的免疫原性、该肽是否与佐剂或载体蛋白质或其它载体复合或共价偶联，以及组合物的给药途径，即静脉内、肌内、皮下等，以及给药剂量数。在疫苗领域中这些因素是已知的，而且免疫研究人员可以根据适当试验而确定出这些因素。
疫苗给药途径通常是本领域所公知的方式。通常是注射途径的系统给药，以及其他几种已知的有效给药途径。针对剂型，肽疫苗可以与渗透剂如胆盐或梭链胞酸联合使用通过粘液膜给药，通常还有表面活性剂。肽还可以进行皮下给药。也可以作为口服制剂使用。剂量依据给药方式，患者性质、和载体/佐剂性质而定。优选地，有效量的蛋白质或肽是约0.01μg/kg-1mg/kg体重。可以通过注射或口服使患者进行系统性免疫，如疫苗菌株，一次或多次给予108-1010个细菌。通常，多次给药是疫苗的标准免疫方案，如同本领域的标准方案。例如，疫苗从一次至四次接种的给药间隔可以是约2-6周，优选月间隔。
用疫苗组合物进行疫苗接种会产生免疫应答，其为抗体应答、细胞介导的应答或者二者都有的应答，免疫应答会阻断Mtb细菌感染周期中的一个或多个阶段，优选阻断结合和进入宿主细胞阶段。
通过本发明的整体描述，结合下面实施例将更利于理解本发明，这些实施例并无意于限定本发明。
实施例I高分子量抗原在Mtb抗原的人类抗体应答中的免疫优势材料和方法研究群体包括确诊为肺结核的58名HIVneg个体。其中，16名来自纽约的the Veterans Affairs Medical Center的传染性疾病门诊。所有患者都是Mtb培养物阳性，9/16的患者是涂片阴性，14/16显示了最小程度至无影像学病变，所有个体在TB化疗开始的1-2周内或更早时候就有出血症状。从Leonid Heifitz and Lory Powell(National Jewish Center，Denver，CO)中得到8例血清。其它20例血清由J.M.Phadtare(Grant Medical College，Bombay，India)提供。印度新德里Mehrauli的Lala Ram Sarup结核病医院的S.Singh提供了14例血清样本。这42名患者中的大部分是涂片阳性，具有中期至晚期肺部病变的影像学特征，在开始化疗后的4-24周有出血现象。对照组包含以下人群(a)16名HIVneg，TBneg，PPD+健康个体(来自流行性国家的近期移民，或VA医疗中心的照顾TB患者的医务人员)；(b)23名HIVneg，TBneg健康对照，其中7人PPD皮肤试验阴性(PPDneg)，其余16人的PPD反应性不详；(c)48名HIV+，PPD？，无症状健康个体，CD4细胞数＞800/mm3。
组(b)个体被包括在内是因为TB已经是感染HIV人群中的主要机会性疾病。
抗原抗原试剂是所有的细胞超声波降解物(CS)，所有培养滤液(CF)，脂阿拉伯甘露糖(LAM)，无LAM的培养滤液蛋白(LFCFP)，所有的细胞壁(CW)，SDS-可溶性细胞壁蛋白质(SCWP)，和细胞壁核(CWC)，所有都从MtbH37Rv中分离出的。CS来自生长在Middlebrook 7H9肉汤中2-3周的Mtb(Difco Laboratories，Detroit，MI)。1000rpm转速下离心30分钟，收集细菌，然后将细菌小球悬浮于含有PMSF、EDTA和DTT的磷酸缓冲盐(PBS)中，每种终浓度为1mM。在液氮中冷却悬浮液，然后解冻(几次)以激醒细胞壁，然后在4℃下，超声波降解20分钟。超声波降解物在10,000rpm下，离心10分钟，收集上清液。
为了得到其余抗原，Mtb在甘油-丙氨酸-盐介质中生长至对数生长期的中间阶段(14天)。用0.22μm膜过滤，除去细胞，培养上清液用带有10,000MW过滤膜的Amicon仪器(Beverly，MA)超滤，然后浓缩。浓缩物(CF)用100mM碳酸氢铵透析，再用冻干法干燥。
为了得到LFCFP，将CF悬浮于(7mg/ml)含有50mM Tris HCl(pH7.4)，和150mM NaCl的缓冲液中，随后加入20％ TritonX-114，最终浓度为4％。将悬浮液在4℃下，震荡过夜。加热4％ TritonX-114悬浮液至37℃达40分钟，形成了两相体系，然后在12,000xg下离心。水相用4％ TritonX-114抽提两次，以确保脂阿拉伯甘露糖、脂甘露糖(LM)和磷脂酰肌醇甘露糖酐(PIM)完全被除去。最终的水相用10倍体积的冷丙酮沉积，用冷丙酮清洗小球数次以除去残余TritonX-114。无LAM的水相CFPs被悬浮于100mM碳酸氢铵中，分成几等份，再用冻干法干燥。
在含有4％ Triton-X 114的PBS(pH7.4)的株磨器(Bead Beater)(Biospec Products，Bartelsville，OK)中，通过机械破碎杆菌，从全部细胞中提取到LAM，LM和PIM。在12000g、4℃下离心15分钟，除去未破碎的细胞和细胞壁。收集上清液，得到两相体系。将得到的洗涤剂相用冷PBS萃取(back-extracted)几次，用10倍体积的冷丙酮沉淀最后洗涤相中的大分子。离心后收集沉淀物，在空气中风干。将该沉淀物(含有脂多糖)悬浮于PBS中，用PBS饱和的苯酚提取残余的蛋白质。收集水相，蒸除水后，脂多糖用冻干法干燥。通过排阻色谱法将LAM进一步从LM和PIM中分离出，该方法同先前所述(Chatteriee，D.et al.，1992，J.Biol.Chez.26966228-66233)。
为了分离全部的CW，80℃下，等温杀伤1个小时使Mtb细胞失活，并将Mtb以0.5g细胞/ml的浓度悬浮于含有PBS，pH7.4，4％ Triton X-114、PMSF、胃蛋白酶抑制剂、EDTA和脱氧核糖核酸酶的缓冲液中。用0.1mm氧化锆株在株磨器中研磨细胞。裂解的细胞先于3000xg下离心5分钟，以除去未破碎细胞，然后于4℃，27,000xg下离心20分钟。得到的小球用冷PBS在室温下清洗三次。将最终的小球称之为CW。
用含2％ SDS的PBS，pH7.4，室温下，清洗CW获得SCWP。用含2％ SDS的PBS，pH7.4，55℃下，抽提CW小球三次而分离出密切相关的蛋白质。55℃下，回收2％ SDS提取液，用Extracti凝胶柱除去SDS(Pierce，Rockford，IL)。将洗出液针对双蒸水进行透析，分成几等份，并用冻干法干燥。
CWC(mycolyl-阿拉伯半乳聚糖-肽聚糖复合物)根据(Daffe，M.et al.，1990，J；Biol.Chem.2656734-6743)中描述的方法(只有少数变化)而得到。将SCWP提取后获得的SDS不溶性材料悬浮于PBS，1％ SDS，0.1mg/ml蛋白酶K中，并在50℃下，培养20个小时。不溶性物质通过离心而成小球，用2％ SDS，在95℃，清洗两次共1个小时，然后离心，收集该不溶物。用水和80％丙酮清洗几次以除去SDS。
使用制备型SDS-PAGE体系，按照大小对LFCFP进行分离(model 491Prep cell，Bio-Rad，Hercules，CA)。将CFP(20-25mg)直接装入30ml 10％制备型聚丙烯酰胺管凝胶中，该凝胶含有6％层积凝胶，这些凝胶被装入内径为37mm的浇铸管中。所用流动缓冲液由25mM Tris，pH8.3，192mM甘氨酸，0.1％ SDS组成。通过电泳分离蛋白质，采用梯度增加瓦特数方法，8W，分离3.13小时，12W分离2.5小时，最后20W分离11.1小时。恒定流出液为5mM磷酸钠，pH6.8，收集凝胶管底部流出液中的蛋白质。最初65ml的洗脱液为空白液，其后，以0.4ml/min的速度收集80个馏分，每个为4.2ml。利用一维SDS-PAGE检测各馏分，并根据检测结果合并各组份。用Extracti-凝胶柱(Pierce)将合并的浓缩组份中的SDS除去。干燥合并后的组份，冷冻储存以备试验用。
用E.coli超声降解物吸附血清在Luria-Bertani介质中培养E.coli(Y1090)过夜，离心得到杆菌小球，按上述超声降解Mtb杆菌的方法处理，只是超声降解的时间为30秒。200μlE.coli溶菌产物以500μg/ml的浓度，悬浮于20mM碳酸盐缓冲液中，pH9.6，并包被在2BELISA板(Dynatech，Alexandria，VA)的每个孔中，放置过夜。清洗板，并用含5％ BSA的PBS(牛血清白蛋白，Sigma Enmuno-chemicals，St.Louis)封闭90分钟。在每个血清样本中加入Triton X-100(最终浓度为1％)以使HIV失活，随后加热至55℃，达60分钟。用同样的方法处理无HIV感染的个体样本，以保持样本制备的一致性。用PBS/Tween20(0.05％)将每个个体的血清(20μl)稀释至200μl，加入培养板的96个孔中。将稀释的血清样本利用多通道移液管转移至包被E.coli的、封闭的ELISA板中。血清样本与结合的E.coli抗原作用90分钟，然后被转移至另一个ELISA板中，该板包被有E.coli，并被封闭，操作同上。血清样本被E.coli抗原吸附8次，然后，将样本转移至96孔组织培养板中，各孔中加入叠氮化钠(最终浓度为1mM)。该方案可以快速、有效地处理小量的多样本。吸附的血清样本一周之内要使用。
Mtb抗原的ELISA分析将50μl的抗原以5μg/ml(除CS和SCWP外，其分别为15μg/ml和1Lg/ml)悬浮在包被缓冲液中，与ELISA板中的孔结合过夜。用PBS清洗3次，在37℃下，各孔用含有7.5％ FBS(胎牛血清，Hyclone，Logan，UT.)和2.5％ BSA的PBS封闭2.5小时。随后，用含有1％FCS和0.25％BSA的PBS/Tween20(0.05％，PBST)稀释血清至1∶1000，将各血清的50μl加入至各孔中。抗原抗体于37℃下结合90分钟，然后用PBST清洗板6次。将50μl稀释为1∶2000(与血清样本的稀释剂相同)的碱性磷酸酯酶偶联的山羊抗-人类IgG(Zymed，CA)加入各孔中。60分钟后，用Tris-缓冲的盐(50mMTris，150mM NaCl)清洗板6次，用Gibco BRL扩增体系(Life Technologies，Gaithersburg，MD)显色。用50μl的0.3M H2SO4停止反应，读取490nm时板的吸收值。每种抗原的较佳抗原和抗体浓度的确定是在全部血清进行ELISA检测之前，用有限数量的对照物和无TB血清通过检测板滴定法进行滴定而确定的。
制备型聚丙烯酰胺凝胶电泳分离得到的各级大小的ELISA测定同上述方法，只是抗原以2μg/ml加入，血清测试的最终稀释比例为1∶200。42例TB血清和44例无TB对照组(16PPD+；7HIVneg，PPDneg；和21HIV+，无症状个体)都包含在这些测定中。
按大小分离的无LAM的CFP中分支杆菌的已知抗原的特征描述以下mAbs是从世界卫生组织得到的(Centers for Disease Control，Atlanta的Dr.Thomas M.Shinnick许可)IT-53 IT-13 IT-46 IT-63 IT-61 IT-51 MLO4-A2IT-45 IT-64 IT-15 IT-49 IT-52 IT-69 SAID2DIT-42 IT-70 IT-23 IT-48 IT-67 IT-4 CS-01IT-41 IT-43 IT-62 IT-59 IT-68 IT-1IT-56 IT-58 IT-47 IT-60 IT-19 IT-20″IT″是世界卫生组织收集抗-Mtb抗体的标准名称。mAbs的其它名称，它们识别的抗原和实验室来源都在Engers，H.等，1986，Infect.Immun.51718-720；Khanolkar-Young，S.et al.，1992，Infect.Immun.603925-3925；Young etal.，supra中有描述，这些文献在此全文引用为参考文献。50/55kDa抗原的抗血清MPT32来自于NIH，协约1-AI-25147。下表总结了这些抗体和其反应性。
在ELISA测定中，用抗体检测到的大小级别的抗原组合物与用于人血清的反应性测定的抗原组合物类似，只是上述定义的抗体采用的浓度是提供实验室所推荐的50μl/孔。ELISA测定中的第二抗体是碱性磷酸酯酶偶联的兔抗-鼠IgG或山羊抗-兔IgG(1∶2000，Sigma Immnunochemicals)，加入量为50μl/孔。
SDS-PAGE和免疫印迹分析在10％ SDS-PA微型凝胶上分离所有成分(LFCFP及其分离组分)，在用抗体检测之前将蛋白质转移至硝酸纤维素膜上。为了更好地鉴定ELISA中被测试血清所识别的分离组分15中的抗原，将所有LFCFP和分离组分10和15的斑点用下述样本进行测定(a)6例TB血清，在ELISA测定中，其与LFCFP呈反应阳性；(b)6例TB血清，ELISA测定呈阴性；以及(c)PPD+健康对照组中的6例血清。
所有斑点利用碱性磷酸酯酶偶联的兔抗-人IgG进行抗体结合筛选，随后与BCIP/NBT底物发生显色反应(Kirkegaard & Perry Laboratories，Gaithersburg，MD)。
统计分析所有ELISA检测中的阳性取舍点被设定为平均吸收值或光密度(OD)±3标准偏差(SD)(对照组)。用检验成队样本的Wilcoxon符号秩来比较血清吸附前和吸附后的反应性。上述两组的SD通过F检验进行比较。利用McNemar′s成对检验比较TB血清与LFCFP的反应性和TB血清与其它抗原的反应性。用The Graphpad Instat program程序进行所有统计分析。
结果A.用E.coli溶解产物吸附测试血清的效果用E.coli溶解产物吸附除去交叉反应性抗体之前和之后，评价38名HIVneg(16名PPD+，7名PPDneg，15名PPD不详)的无结核者、21名感染HIV的无症状者、42名TB患者的血清与LFCFP的反应性(图1)。各对照血清亚组的反应性没有区别。未吸附的对照血清的平均吸收度(O.D.±SD)是0.316±0.111，吸附后的吸收度为0.165±0.05(表1)。反应性降低具统计学显著性(p＜0.0001)。此外，对照血清样本吸附后的方差(表示为SD)与相同血清吸附前的SD相比较，显著降低(p＜0.0001)(图1，表1)。吸附前TB血清的平均O.D为0.911±0.454，相同血清吸附后平均O.D为0.694±0.440(图1)。尽管吸附后的TB血清反应性与吸附前血清相比也显著降低(p＜0.0001)，但吸附前后TB样本的SD相似。因此，存在于对照组和测试血清中的高水平交叉反应性抗体被E.coli溶解产物所吸附。对于对照组，清除这些抗体会降低基线血清反应性。然而，正如所预料的，尽管减少了抗体水平，各TB血清的误差并未受影响。超出对照组血清平均值3倍S.D.值被设定为阳性反应性的阈值。
与LFCFP反应的抗体在25/42(60％)的未吸附TB血清中可以检测到(图1)。当吸附后进行测定，在4/17(24％)的其余的、以前为血清阴性的血清中检测到抗-分支杆菌抗体，灵敏度提高至69％(图1)。
表1吸附前的血清与E.coli吸附血清的比较

a比较吸附前和吸附后的血清Wilcoxon符号秩检验。
bF检验比较吸附前和吸附后血清的标准偏差。NS；不显著。
这些实验也利用对照组血清的最高O.D.值作为取舍点进行分析，方法也可参见文献(Ivanyi et al.，1989，supra)。在吸附之前，59个对照血清的O.D.s值在0.16-0.68范围之间(图1)。24/42(57％)TB血清的O.D.s值高于最高对照血清。吸附后，相同对照血清的O.D.s值在0.08-0.25范围之间，而31/42(74％)的TB血清显示抗体阳性。因此，7/18(39％)Mtb抗原的抗体在其余的、先前为阴性的血清中被检测出。鉴于吸附后血清的灵敏度提高，此后所有血清在各种测定之前都要先被吸附。
实施例II将结核分支杆菌的88kDa分泌抗原的抗体作为HIV感染者的TB临床前期检测替代标记物A.材料和方法1.血清研究人群包括49名HIV感染者，这些感染者来自纽约V.A.医疗中心的传染性疾病门诊，并在最后几年内发展成或表现出TB(HIV/TB)。从这些患者体内共得到259个血清样本。其中有(a)临床TB症状出现之前(″HIV/前期-TB″)几种状况下的38名患者中获得的136个样本；(b)临床上和细菌学诊断为TB(″HIV/期-TB″)的37名患者的37个样本，并包括几个组(a)患者；(c)开始进行TB治疗(″HIV/后期-TB″)的几个月内，取自35名患者的86个血清样本。大部分组(c)患者也是组(a)和/或(b)成员。
TB的诊断基于Mtb培养液阳性。
将20名非-HIV的TB患者(non-HIV/TB)的血清作为阳性对照，其中19名是涂片阳性，全部患者都显示中期至晚期空洞性影像学症状。将19名非-HIV/PPD皮肤试验阳性者的血清作为阴性对照。为了除去非特异性反应，研究包括(i)来自35名感染HIV的无症状者，且CD4细胞数＞800的血清；(ii)来自16名HIV感染者的48个血清样本，这些患者的血液培养液对于鸟型分枝杆菌(″HIV/MAI″)显阳性。其中28个HIV/MAI血清样本是在MAI杆菌出现前几个月的样本。
如实施例I中所述方法制备Mtb H37Rv(指无LAM的培养滤液蛋白(LFCFP))的分泌抗原。然后根据分子量，将抗原混合物用BioRad 491 PrepCell(Hercules，CA)在含有6％的层积凝胶的30ml 10％制备性聚丙烯酰胺管凝胶中进行分离。根据分子量收集分离组分(作为SDS-PAGE分离物)并干燥。
将LFCFP及其分离组分溶解在10％ SDS-PA微型凝胶上，并在使用血清检测之前转移至硝酸纤维素膜上。所用第二抗体为碱性磷酸酯酶偶联的兔抗-人IgG，底物是BCIP/NBT(Kirkegaard and Perry Laboratories，Gaithersburg，MD)。
所有血清在ELISA检测之前都用E.coli溶解产物进行吸附。吸附和ELISA检测如实施例I中的操作。
2.淋巴细胞染色和流式细胞分析用Simultest CD3/CD4和CD3/CD8(Becton Dickinson Immuno-cytochemistry systems，San Jose，CA)试剂，通过标准程序(Gordin F.M.etal.，1994，J.Ir fect.Dis.169893-897)进行细胞染色。流式细胞分析用Becton Dickinson FACScan.进行。
3.统计分析操作同前。
B.结果1.HIV/TB患者的血清与分支杆菌抗原的反应性将来自49名HIV/TB患者的259例血清和Mtb的全部LFCFP的反应性与来自16名非-HIV/PPD+个体(阴性对照)和20名非-HIV/TB患者(阳性对照)的血清反应性进行比较。对于各个体的各样本中是否存在抗-Mtb抗体，至少检测三次。一种代表性的ELISA测定结果显示了这些组中的每一组的抗体水平，如图2所示。将取舍点设定为16个来自非-HIV/PPD+个体的血清测定的平均值OD±3SD，在16/20(80％)的非-HIV/TB血清中发现LFCFP抗体。作为对照，只有9/37(24％)的HIV/期-TB血清具有这样的抗体反应性。然而，17/38(45％)HIV/TB患者的HIV/前期-TB血清是阳性，13/35(34％)HIV/后期-TB血清是阳性。
总之，HIV+者比非-HIV者的血清中的抗体水平低(在所有三个组中)。非-HIV/TB和HIV/期-TB组的平均OD值具有统计学上的显著性(与所有血清比较(p＝0.0001)，或与只有抗体阳性的血清(p＝0.0165)相比)。HIV/前期-TB血清中抗体水平的OD测定值显著低于非-HIV/TB血清(所有血清p＝0.0001)；抗体阳性血清p＝0.0007)。
评价HIV/TB患者中抗-Mtb抗体反应的特异性。来自35名感染HIV的无症状个体(CD4+细胞数＞800)的血清和来自16名HIV/MAI患者的48种血清与19名非-HIV/PPD+健康对照组和20名HIV/TB患者的血清一同检测。使用19名非-HIV/PPD+健康对照血清的平均值OD±3SD作为取舍点，2/35来自HIV-+组和7/48来自HIV/MAI组的血清显示与Mtb分泌抗原的最小反应性。这些结果确证了HIV/TB血清与Mtb抗原反应的特异性。
2.HIV/TB患者体内出现抗-Mtb抗体的时间由于Mtb分泌抗原的抗体存在于约一半的HIV/前期-TB血清中，这些抗体出现的时间早于临床上确定TB的时间。对来自6名抗体阳性者、3名抗体阴性的HIV/TB患者、3名HIV/MAI患者的血清进行抗-Mtb抗体的测定。所有6名抗体阳性者在出现TB临床症状之前的几年的不同时间都具有循环抗体。其中一名患者在临床诊断有TB的前1.5年左右出现抗-Mtb抗体，另一个患者是4.5年左右之前的时间出现抗-Mtb抗体。其余4名患者都是5-6年的时间之前出现循环抗体。相反，3名抗体阴性的HIV/TB患者和3名HIV/MAI患者都始终是阴性。
3.HIV/TB血清与分离的分泌抗原的反应性为了确定与HIV/TB患者的抗体反应的抗原(在LFCFP的制备中)特征与非-HIV/TB患者的抗体所识别的抗原特征是否不同，通过9名ELISA+HIV/TB(两名HIV/期-TB，7名HIV/前期-TB)和3名非-HIV/TB患者的血清检测经SDS-PAGE分离的LFCFP所得的Western blots。将结果与6名HIV-+无症状对照阻和5名非-HIV/PPD+健康对照组的抗体反应性相比较(ELISAneg)。如实施例I中所描述，所有血清(健康者和患者)都与65kDa和30-32kDa抗原发生反应。非-HIV/TB患者的血清与约26kDa至约115kDa之间的多种抗原(约20)反应。其中，与大量存在的38kDa抗原和少量存在的88kDa抗原的反应性最强。与分子量为32-38，45-65，72-78和80-115kDa的抗原发生反应。
相反，8/9HIV/TB血清与38kDa抗原不反应，而与45-65kDa范围内的抗原反应，尽管其在一些患者中反应性很低。与72-78kDa抗原的反应性也降低或完全丧失。两个患者的血清存在与80-115kDa抗原的反应性，但其余患者的反应性显著降低。多数HIV/TB血清与88kDa抗原的反应性似乎比该分子量范围内的其它抗原的反应性都高。无症状的HIV感染者或PPD+健康对照组的血清在相同稀释度下都不显示任何显著反应。因此，可以得出结论，被HIV/TB血清识别的抗原种类比非-HIV/TB血清识别的抗原少。
4.HIV/TB血清与经过大小分离的LFCFP的反应性为了缩小LFCFP中HIV/TB患者识别的抗原范围，将LFCFP基于分子量进行分离，得到14个重叠分离部分。对来自6名ELISA+非-HIV/TB或6名HIV/TB患者收集的血清进行Western blots测定来鉴定含有强血清反应性蛋白质的分离组分。除先前就显示(实施例I)与所有血清(健康者和患者)都反应的65 kDa和30-32kDa抗原以外，非-HIV/TB血清还与分离组分6-14中分子量超过30-32kDa的抗原发生反应。
更具体而言，与分离组分6、7和8中约32-38kDa的抗原也发生反应。分离组分9和10中显示了明显的38kDa带。此外，分离组分10中也检测出45、50和58-60kDa的抗原。在分离组分11-14中也发现了少量的38kDa抗原和30-32kDa抗原，分离组分11中的大部分血清反应性蛋白质在56-68kDa范围内，分离组分12中在58-76kDa范围内，分离组分13中在65-76kDa范围内，分离组分14中在65-88kDa范围内。明显的88kDa带只在分离部分14中可见。
用来自6名ELISA+HIV/TB患者(5名HIV/前期-TB和1名HIV/期-TB)的血清检测相似的印迹，分离组分6-9中的抗原反应性弱。根据HIV/TB个体血清的检测结果，与分离组分9-14中的38kDa抗原反应性很小或没有反应性。然而，与分离组分10中的45，50和58-60kDa双峰的抗原反应性尽管较弱但可以分辨出(其与非-HIV/TB血清具有强反应性)，与分离组分11-14中的其它抗原也具有反应性。与分离组分14中的88kDa抗原的反应性强且明显可辨。
这些结果说明HIV/TB血清中分离组分10-14抗原的反应性比其它分离组分的抗原反应性好。因此，在非-HIV/TB患者识别的抗原中，HIV/TB患者所识别的抗原只是一种亚类。例如，38kDa抗原的抗体在HIV/TB中没有发现，而分离组分10-14中的抗原抗体，尤其是88kDa抗原，即使是在感染HIV的患者中也存在。
5.Mtb抗原分离组分与个体血清的反应性为了精确确定HIV/TB患者高频率识别的Mtb抗原种类，用来自42名HIV/TB患者的145份血清测定与分离组分7-14和全部LFCFP(作为阳性对照)的反应性。由于这些研究的目标是鉴定Mtb抗原，其可能被用作亚临床的TB替代标记物，或作为TB疑似患者的辅助诊断，因此主要使用了HIV/前期-TB和HIV/TB血清。包括来自18名非-HIV/PPD+(阴性对照)和20名非-HIV/TB患者(阳性对照)的血清。
如上所示(如图2)，用非-HIV/PPD+对照血清的平均值OD±3SD作为取舍点，16/20(80％)的非-HIV/TB血清具有全部LFCFP的抗体。50％(21/42)的HIV/TB患者具有未分离的LFCFP的抗体。然而，74％(31/42)的相同患者显示了与分离组分14的抗原的阳性反应性。62％(26/42)患者与分离组分13的抗原有反应性，38％(16/42)与分离组分12(尽管对于分离组分12和13的抗原，O.D.值较低)。约50-60％的血清与分离组分9和10中的抗原发生反应，尽管比分离组分14抗原的反应性低。如实施例I所示，与未分离LFCFP反应的非-HIV/TB患者也与分离组分14抗原反应。
通过比较HIV/前期-TB和HIV/期-TB组，可以来分析HIV/TB血清与未分离的LFCFP以及与组分14中的抗原的反应性。相反，66％的HIV/期-TB和74％的HIV/前期-TB血清具有与组分14的抗原结合的抗体。
为了跟踪分离组分14抗原的抗体出现的时间，测试了来自个体患者的多血清样本与分离组分14和LFCFP的反应性。这些抗原的抗体在有临床TB症状几年前，就存在于个体患者(抗体阳性)的血清中。相反，来自抗体阴性患者的多种血清样本始终都是阴性。
6.抗体阳性和阴性的HIV/TB患者的细胞形态与分离组分14抗原反应的抗体阳性HIV/TB患者的T细胞形态与抗体阴性的T细胞相比较，二者都处于HIV/前期-TB和HIV/期-TB阶段。在HIV/TB患者的两个组中没有显著差异。
C.讨论前述结果证明，在出现临床TB症状之前，Mtb分泌抗原的抗体在约74％的HIV/TB患者中已存在几个月至几年的时间。由于HIV/TB患者中的反应性比非-HIV/TB患者要低，清除交叉反应性抗体可使反应性不被掩盖，因此在检测前清除交叉反应性抗体，从而使得血清样本可以检测到这种早期抗分枝杆菌抗体。
诱导HIV/TB患者体内产生抗体的Mtb抗原的种类比非-HIV/TB患者的种类少在这些HIV/TB患者中，分子量为32-45kDa的几种抗原的抗体不存在。存在于50-60％的非-HIV/TB TB患者中的强血清反应性38kDa抗原的抗体在大多数HIV/TB患者中都不存在。(实施例I；Danielet al.，1987，supra；Bothamley，1992，supra；Espitia C.et al.，1989，supra；VerbonA.et al.，1993，Am Rev Respir Dis 148378-384)。更值得注意的是，在HIV/TB血清中的抗体所识别的抗原是分离组分14中的抗原，其主要包括88kDa反应性抗原。88kDa抗原特异性的抗体在74％的HIV+个体的前期-TB血清中被检测到，这些个体即将发展成临床上的TB。
实施例I显示88kDa抗原(GlcB)(存在于实施例I中的分离组分15，实施例II中的分离组分14)是一种Mtb分泌抗原，其在疾病进展早期诱导抗体产生(在非-HIV TB患者中)。因此，检测高危HIV感染者的抗-88kDa抗体可以作为诊断性检测，且抗体可作为鉴定活动期临床前TB的替代标记物。在呈现临床性TB时，只有约1/3的HIV/TB患者是PPD+(Fitzgerald J.M.et al.，Chest 100191-200)，PPD+是一种T细胞介导的免疫性方法。相反，66％的HIV/TB患者具有88kDa抗原(GlcB)的抗体。将这种新型替代标记物，以及其它早期抗体用于发展成TB或活动期TB的高危人群的检测中，对减缓全球TB流行是一个重大的贡献。
在美国，只有约3％的TB患者是HIV感染者。然而，在发展中国家，HIV的血清传染范围是17％-66％(Raviglione et al.，1992，supra；Shaferetal.，supra)。对于PPD无免疫力的HIV患者的比例很大，其为扎伊尔的33％至巴西的90％以上，在早期HIV感染者中是43％，而在晚期HIV患者中是100％(Raviglione et al.，1992，supra)。
皮肤试验反应性的延迟超敏性在HIV+个体中不稳定。因为PPD反应性的发展和抗分枝杆菌抗体的产生不一定同步(Das，S.et al.，Clin.Exp.Immunol.1992；89402-06；Kardjito，T.et al.，Tubercle.1988，63269-274；Balestrino，E.A.et al.，Bull.World Health Org.1984，62755-761)，同时利用两个标记物将提高我们对于这样的患者进行早期检测，并及时建立治疗方案的能力。
一些研究者对HIV感染者进行的血清诊断试验的结果有争议。例如vanVooren et al.，supra，报导所有Mtb分泌性抗原在随后发展成TB的患者体内存在几个月。他们还报导了7/8的HIV/TB患者具有p32抗原(Ag85A)的循环抗体。在本发明研究中，该抗原在分离组分的6-9中存在。确实，只考虑38kDa抗原和Ag85B抗原的特异性抗体时，HIV/TB患者血清与这些分离组分之间的反应性可能是由于存在该抗原(McDonough etal.，supra)。DaCosta et al.，supra，在约35％的HIV/TB患者中发现抗-LAM抗体，正如Bareret al.(supra)用PPD作为抗原(Tuber Lung Dis 1992，73187-91)。这些报导的结果都类似，即出现TB临床症状时，未分离的LFCFP的抗体在约25％的HIV/期-TB血清中可检测到。然而，66％的这类患者的血清与分离组分14的抗原发生反应。McDonough et al.(supra)未能在HIV/TB患者血清中检测到Ag85B的抗体，可能是由于HIV/TB患者所识别的抗原数目的限制。一些研究者采用的A-60抗原(Saltini et al.，supra；van derWerf et al.，supra)甚至在非-HIV/TB患者中，其灵敏度低、特异性差，而非-HIV/TB患者是公知的抗体水平较高的人群(Charpin D et al.，Am Rev Respir Dis 1990，142380-384；Qadri，S.etal.，Can J Microbiol 1991，38804-806)。
约25-30％的HIV/TB患者表现缺乏88kDa抗原GlcB的抗体的原因还不清楚。在HIV/TB患者中，CD4+细胞数和抗体水平无相关性。相类似，CD4+细胞数和迟缓型过敏反应之间也缺乏相关性(Huebner et al.，1994，supra)，说明不仅CD4+细胞亚群的数量变化，而且功能差别都会对HIV感染者的免疫状态有影响。
在HIV/TB患者发展为临床症状之前，其体内就存在Mtb分泌抗原的循环抗体，这说明在免疫系统完全丧失之前，Mtb在体内就开始复制直至发展成临床性疾病。流行病学的研究表明HIV感染者从初级感染至临床性疾病的快速发展(Small，PM etal.，NEngl JMed 1993，3281137-1141；Daley，CLetal.，NEng JMed 1992，326231-235；Edlin BR etal.，NEngl JMed 1992，3261514-1521；Coronado VG etal.，Jlnfect Dis 1993，3281137-1155)。因此有可能只有再次激活潜伏的TB，并建立再次免疫应答的患者具有抗-Mtb抗体。分析Mtb株的限制性片段长度多态现象(RFLP)的近期研究(Alland Detal.，NEngl JMed 1994，3301710-1716；Small etal.，supra)表明约60-70％的纽约TB病例(和San Francisco)是由于潜伏感染的再次激活引起的。
表面上，抗体阴性患者体内的抗-分枝杆菌抗体可能通过与抗原结合的免疫复合物的形式而循环，因此在检测中遮掩了抗体的存在。这种现象至少存在一部分的患者中，建议在HIV/后期-TB血清中增加检测抗体的频率。
目前结果说明具有Mtb 88 kDa抗原，GlcB，的持久循环抗体的患者可以进行预防性抗TB治疗，如同PPD+HIV感染者(Shafer，et al.，supra；Pape，J.W.etal.，Lancet 1993，342268-272)。本发明的患者是基于临床确诊的TB患者中挑选的。他们的PPD反应性是未知的。在HIV感染者中，从PPD皮肤过敏试验阳性到发展成临床疾病的时间为1-7年(Selwyn et al.，supra；Huebner et al.，supra)。没有确定最佳时间和预防性抗-TB治疗持续时间的参数。进一步分析发展成临床TB疾病的HIV/PPD+个体的抗体反应，可以进一步探究这些个体的预防性治疗的最佳时间。
实施例III通过2-D聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱、N-末端氨基酸序列分析和电喷雾质谱来定义Mtb培养滤液蛋白质如上所述，将Mtb体外培养，在细胞外环境中得到多种蛋白质，在此称为培养滤液蛋白质(CFPs)。这部分蛋白质最显著的特征是免疫优势性。CFP被认为是保护性免疫应答相关抗原的主要储存库，并为这部分蛋白质提供生化定义。最近，有人推断用活病毒加热灭活杆菌接种试验动物而产生的两重免疫应答是由于活Mtb的分泌活性抗原而致。Mtb CFP能诱导保护性T细胞应答也支持了这一假说。为了定义分离组分中的免疫性活性成分，纯化并描述了包括6kDa ESAT6、24kDa MPT64、Ag85复合物和MPT32的几个蛋白质的特征。一些CFPs产生了强抗体应答，这些CFPs包括MPT32，38kDa PstS同源物和88kDa蛋白GlcB。本发明人发现这些抗原和其它本发明所述的抗原都可用于早期TB的血清诊断中。
在本发明之前最广泛特征描述的Mtb CFPs中，Nagai与其同事纯化了12种主要的蛋白质，对它们进行了部分表征并提供了2-D PAGE图谱。主要通过mAb反应性定义的其它几种蛋白质，已经在培养滤液制备物中得到了确定。培养滤液不仅包括活性的分泌蛋白质，而且还包括在复制或自溶过程中被释放到介质中的菌体分子。如Andersen et al.(supra)所描述，培养滤液蛋白质特征高度依赖于培养时间。而且，所用介质和培养方法(静置或振摇)也影响CFP的特征。因此，由于制备CFP试剂的方案多变，可以理解其蛋白质组合物很难从现有文献中得到。
在该实施例中，本发明人结合了2-D PAGE、Western blot分析、N-末端氨基酸序列分析和液相色谱质谱质谱联用(LC-MS-MS)来得到培养滤液蛋白质详细的分离图谱，并且已经得到从前没有定义的5种蛋白质的部分氨基酸序列，这些蛋白质在可用作血清诊断TB的早期抗原的培养滤液蛋白中含量较多。
此外，对三个Mtb实验室菌株H37Ra，H37Rv和Erdman的CFP的2-DPAGE图谱进行分析，三者只有微小差别。下述结果对于这个新了解的免疫学重要蛋白质组的蛋白质特征和图谱给予了详细描述，从而可以将临床分离的Mtb与之进行比较。在TB发展的早期阶段，能被患者体内的循环抗体所识别的主要的TB早期抗原的蛋白质定义在以下实施例V和VIII中给予描述。
A.材料和方法1.Mtb的生长和培养滤液蛋白质的制备Mtb菌株H37Rv(ATCC 27294)和H37Ra(ATCC 25177)来自American Type Culture Collection(Rockville，MD)。Mtb菌株Erdman(TMC 107)来自Trudeau Mycobacterial Collection。首先，每个Mtb菌株从1ml冷冻的储存液接种至10ml的甘油丙氨酸盐(GAS)介质中；为每个菌株准备三个同样的培养液。接种后，在37℃下培养14天，培养中伴有轻微振摇，每10ml培养液用10倍体积的介质稀释后，再取10ml培养液用10倍体积的介质稀释，如此操作两次以上。得到的1升培养液被称为4号稀释液(pass number four)。对于每个Mtb菌株，使用3升的4号稀释液来接种30升的GAS介质。37℃下轻微振摇培养14天后，过滤培养上清液以除去细胞，浓缩CFPs，程序如上所述。浓缩的培养滤液中的蛋白质用bicinchoninic酸蛋白质定量法进行分析。
为了确定Mtb菌株H37Ra、H37Rv和Erdman的生长曲线，将600nm下光密度为0.1的快速生长的Mtb培养液接种到培养管(13by 100mm)中，改培养管含有0.05％Tween 80的3ml GAS介质。这些培养液于37℃，搅拌下进行培养，每12小时测定600nm时的光密度，共测22天。
2.抗体mAbs IT-69(HBT11)和IT-67(L24.b4)由Dr.A.B.Andersen，StatensSeruminstitut，Copenhagen，Denmark提供。mAb A3h4由荷兰阿姆斯特丹大学的Drs.P.K.Das和A.Rambukana提供，mAbs F126-2和HYB 76-8由荷兰阿姆斯特丹皇家热带研究所的Dr.A.Kolk和丹麦哥本哈根的Dr.I.Rosenkrands，Statens Seruminstitut分别提供。其它所有的mAbs由WHO单克隆抗体库提供，然后由乔治亚州亚特兰大CDC的Dr.T.Shinnick保存。抗-MPT63多克隆血清由挪威奥斯陆大学的Dr.H.Wiker提供。Dr.S.Nagai提供了MPT32、MPT35、MPT46、MPT53和MPT57的特异性多克隆血清。
3.培养滤液蛋白的SDS-PAGE和2-D PAGE用凝胶(7.5×10cm×0.75mm)，其中含有6％层积凝胶、15％溶解性凝胶，在还原性条件下进行标准SDS-PAGE分析。每个凝胶在10mA下，分离15分钟，随后15mA下，分离1.5个小时。
用O′Farrell方法得到的2-D PAGE蛋白质分离，与SDS-PAGE分离的差别微小。具体而言，干燥70μg的CFP，并将其悬浮于30μ1的等电聚焦(IEF)样本缓冲液(9M尿素，2％ NP-40，5％ β-巯基乙醇和5％两性电解质pH3-10(Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ))中，并于20℃培养3个小时。将一份25μg的蛋白质用6％聚丙烯酰胺IEF凝胶管(1.5mm by 6.5cm)进行分离，其中凝胶管含有5％ Pharmalytes pH3-10与4-6.5的比例为1∶4。10mM H3PO4和20mM NaOH分别作为阴极电解液和阳极电解液，在1kV下，聚焦3个小时。随后将管中凝胶吸取到样本转移缓冲液中达30分钟，然后加到制备型SDS-聚丙烯酰胺凝胶(7.5×10cm×1.5mm)中，其中凝胶中含有6％层积凝胶、15％溶解凝胶。每种凝胶在20mA，进行二维电泳达0.3小时，随后，在30mA，分离1.8个小时。用硝酸银染色，使蛋白质可见。
4.二维凝胶的计算机辅助分析用冷却的CCD数字相机拍摄银染色的2-D PAGE凝胶，并用MicroScan1000 2-D凝胶分析软件(Technology Resources，Inc.，Nashville，TN)分析。用斑点滤器定位蛋白质峰的位置并进行分析，可允许的最小峰高为1.0，最小峰面积为2.0。
5.Western blot分析经过2-D或SDS-PAGE分析的蛋白质被转移至硝酸纤维素膜(Schleicherand Schuell，Keene，NH.)上，并用含0.1％牛血清白蛋白的0.05M Tris-HCl，pH7.5，0.15M NaCl，和0.05％ Tween80(TBST)溶液进行封闭。这些膜与被TBST稀释至适宜浓度的特异性抗体一起培养2个小时(表2)。清洗后，将膜与经TBST稀释的山羊抗-鼠或抗-兔的碱性磷酸酯酶偶联的抗体(Sigma)一起培养1个小时。用底物硝基四唑蓝和5-溴4-氯-3-吲哚基磷酸酯(BCIP)显色。
2-D PAGE凝胶中与特异性抗体反应的蛋白质图谱采用0.1％印度墨进行染色，该墨是免疫印迹检测之后的总蛋白质的二级染料。作为选择，对于用印度墨进行二级染色不能着色的抗体反应性蛋白质可以使用Digoxigenin(DIG)总蛋白质/抗原双染色试剂盒(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)。简言之，在电印迹之后，用0.05M K2HPO4，pH8.5清洗膜三次。将膜在室温下与含有0.3ng/ml digoxigenin-O-甲基羰基-ε-氨基-己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯和0.01％ Nonidet-P40的0.05MK2HPO4溶液(pH8.5)接触，在室温下，培养膜达1个小时，使所有蛋白质与digoxigenin结合。该膜随后被0.05M Tris-HCl，pH7.5，0.15M NaCl(TBS)中的3％牛血清白蛋白封闭1个小时，然后用TBS清洗。与特异性抗体培养的操作如前所述，随后该膜与偶联了碱性磷酸酯酶并被TBS以1∶2000稀释的鼠-抗-DIG-Fab片段一起培养1个小时。用TBS清洗三次，并用结合辣根过氧化物酶的山羊抗-鼠或抗-兔抗体检测。与特异性抗-Mtb蛋白抗体反应的蛋白质用底物4-(1，4，7，10-四氧癸基)-1-萘酚和1.8％H2O2显色。BCIP和[2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-苯基-四氮唑氯化物]作为底物对所有标记有digoxigenin的蛋白质进行二级显色。
6.氨基酸序列分析为了获得所选蛋白质的N-末端氨基酸序列，用2-D PAGE分离CFPs(200μg)，然后转移至聚偏二乙烯二氟化物膜上(Millipore，Milford，Mass.)，在50V下用含有10％甲醇的CAPS缓冲液进行电印迹1个小时。用0.1％考马斯亮兰(Coomassie brilliant blue)在10％醋酸中染色，并用50％甲醇和10％醋酸溶液脱色。将固定的蛋白质用带有连续流动反应器的气相测序仪进行自动Edman降解。苯基硫乙内酰脲氨基酸衍生物通过如前述的在线反相色谱法得到鉴定。
7.LC-MS-MS分析筛选的CFP经LC-MS-MS来确定其肽片段的序列。用2-D PAGE分离CFPs(200mg)，用0.1％考马斯亮兰使凝胶着色，并如所述方法使固定在PVDF膜上的蛋白质脱色。将需要的蛋白质从凝胶上切下来，用蒸馏水清洗数次以除去残留醋酸，然后用胰岛素进行凝胶蛋白溶解消化。肽从丙烯酰胺上洗脱下来，然后经C18毛细管RP-HPLC分离。将微毛细管的RP-HPLC洗脱液直接导入Finnigan-MAT(San Jose，CA)TSQ-700三部分的四极质谱仪。质谱和数据分析同Blyn等所描述的方法。
C.结果1.Mtb H37Rv的培养滤液中的蛋白质定义经过世界卫生组织(WHO)科学工作组(SWGs)在麻风病免疫学(IMMLEP)和结合病免疫学(IMMTUB)方面的努力，已经建立了大型分枝杆菌蛋白抗体mAbs库。该库以及不包括在其中的mAbs和多克隆血清使Mtb的培养滤液中已知的分枝杆菌蛋白得到鉴定。对已鉴定出与35个MtbCFP反应的mAbs和/或多克隆血清的文献进行详细研究(表2)。首先，为研究作准备，用western blot分析确定H37Rv的培养滤液中是否存在这些蛋白质。实验中所用抗体和血清，除了IT-56以外，所有都表现与制备液中的特定蛋白质具有反应性。mAb IT-56对于65kDa Mtb GroEL同源体具有特异性；蛋白质主要与细胞溶质相关。此外，mAb IT-7与14kDa而不是40kDa CFP反应。
2.Mtb H37Rv中已知的CFP的2-D PAGE图谱使用偶联了二级染色的2-D Western blot分析(印度墨或Dig总蛋白质/抗原双染色)，将与特定mAb反应的蛋白质或多克隆血清在Mtb H37Rv的CFP的2-D PAGE分离范围内进行图谱显示。通过2-D PAGE总共分离到32个由反应性抗体检测到的特异性蛋白质(表2)。然而，在传统Western blot分析中具反应性的两个抗体(IT-1和IT-46)，没能在2-D分离范围内检测到任何蛋白质(表2)，这可能是由于缺乏暴露出的线性表位，表位的暴露通常需要在用于分解分子的变性条件下发生。
大多数抗体识别的是单一蛋白质斑点。然而，也有几个抗体(IT-3、IT-4、IT-7、IT-20、IT-23、IT-41、IT-42、IT-44、IT-49、IT-57、IT-58、IT-61和MPT32)与多个蛋白质反应。其中五个，IT-23、IT-42、IT-44、IT-57和IT-58与蛋白簇反应，这些蛋白质的分子量分别集中在36kDa、85kDa、31kDa、85kDa和50kDa。每个簇中的蛋白质迁移的PI范围很窄，提示了抗体与相应蛋白质的多个同种异构体反应。85kDa蛋白簇(其包括“88kDa”GlcB早期抗原)被IT-57识别，最优势成分被IT-42所识别。
抗MPT32的多克隆血清识别具有相似PI值的45和42kDa蛋白质。在确定MPT32(见上)上的糖基化位置时，我们观察到该蛋白质易于自水解而形成42kDa产物。因此，用抗MPT32血清检测的42kDa蛋白质是45kDa MPT32糖蛋白的分解产物。mAb(抗原85(Ag85)复合物的特异性抗体T-49，清晰地检测到复合物的三个基因产物(Ag85A，B和C)。与抗体交叉反应的最大区域位于分子量低于16kDa处。该区域的最优势蛋白与14kDa GroES同源物特异性的mAb IT-3进行反应。该mAb也识别了几种14kDa左右的邻近蛋白质。有趣的是，相同蛋白簇的不同蛋白质与抗-MPT57和抗-MPT46多克隆血清以及mAbs IT-4、IT-7、IT-20发生反应。
3.筛选的CFPs的N-末端氨基酸序列用可得的抗体使图谱显示，从而获知几种Mtb的CFPs的N-末端氨基酸序列或完整的基因序列以及功能基。然而，这种方法缺乏那些与IT-42、IT-43、IT-44、IT-45、IT-51、IT-52、IT-53、IT-57、IT-59、IT-69反应的蛋白质的信息，以及不能被这些方法鉴定的几种优势蛋白质的信息。将这些蛋白中含量最大的蛋白质(IT-52、IT-57、IT-42、IT-58和标记A-K的蛋白质)进行N-末端氨基酸测序(表3)。
发现这些蛋白质中的3个与先前定义的产物相对应。标记D的蛋白质的N-末端氨基酸序列与Ag85B和C相同。由于IT-49没有检测到该蛋白质，得到的这个结果是未能预见的，N-末端氨基酸分析也确实了那些与IT-49反应的蛋白质是Ag85复合物的成员。第二，标记E的蛋白质的N-末端氨基酸序列与谷氨酸盐合成酶相同。与IT-52反应的第三蛋白质与MPT51相同。
然而，经分析这些蛋白质中的五种是新蛋白质。其中三个，标记B、C的蛋白质和IT-58与任何分枝杆菌或原核的已知序列都没有明显的同源性。标记I的蛋白质具有一个N-末端序列的72％与真杆菌类的α-羟基甾类脱氢酶的氨基末端相同，标记F的蛋白质与Mtb质粒MTCY1A11所识别的开放阅读框诱导的氨基酸序列具有同源性。
实施例I和II表明Mtb的CFP中的高分子量部分具有与TB患者血清的反应优势，因为该部分具有与mAb IT-57反应的产物，从而使其与其它天然部分相区别。鉴于此，将IT-42和IT-57所定义的蛋白簇(包括88kDa蛋白GlcB)从2-D聚丙烯酰胺凝胶上剪切下来，用胰岛素消化，得到的肽用LC-MS-MS进行分析。消化得到的10个肽的分子量以及碎片裂解方式和预见到的MtbkatG-编码的过氧化氢酶/过氧化物酶胰岛素片段一致(表3)。可见，不与IT-57反应的蛋白质似乎是katG产物。然而，88kDa蛋白簇中与IT57反应的蛋白质(LC-MS-MS分析)与鉴定到的Mtb蛋白质不具有序列同源性。
表2结核分枝杆菌H37Rv的CFPs与已报导的特异性mAbs和多克隆抗血清的反应性

*ND未检测1括号内是最初用于世界卫生组织分类Mab的命名表3通过LC-MS-MS鉴定的所选M.tuberculosis H37Rv的CFPs的N-末端氨基酸序列或肽片断蛋白质N-末端氨基酸序列 识别号 同源性

1“None”表示蛋白质难以通过Edman降解进行测序表4利用计算机辅助分析银染色的2D凝胶所探测的蛋白质斑点








1由本发明人所测得的N-末端序列为斜体字。Ref#＝印迹2D凝胶上的斑点编号4.Mtb菌株H37Rv，H37Ra和Erdman的CFP特征比较对来自Mtb典型菌株(H37Rv，H37Ra和Erdman)的CFPs的进行比较性2-DPAGE分析来鉴别各蛋白质成分之间可能存在的含量差别。首先，收集3份独立的H37Rv CFP，溶解在2-D PAGE中。使银染色的凝胶数字化，用Microscan 1000 2-D凝胶分析软件分析数据。共检测到205个H37Rv蛋白质斑点，并将各蛋白质按PI从酸性到碱性并按分子量递减的顺序依次编号(表4)。用类似方法得到H37Ra和Erdman菌株的CFP类似图谱，分别识别了206和203个蛋白质斑点(表4)。用2D主要软件比较这三个图谱，揭示了三者培养滤液组成的惊人相似性。与H37Rv培养滤液蛋白质斑点相吻合的H37Ra和Erdman培养滤液的蛋白质斑点都给予相同的编号，给予H37Ra或Erdman菌株的蛋白质最初的编号(表4)。只存在于一个或两个典型菌株中的蛋白质在培养滤液中含量较少。
C.讨论与Mtb细胞壁、细胞膜和细胞质的蛋白质相反，就功能、免疫原性和组成方面而言，CFPs被定义得很清楚***。然而，还没有对总蛋白质进行详细分析，也没有给予分子定义，大多数CFPs的2-D PAGE图谱也没有获得。Nagai和同事对在Sauton介质中培养5周后收集的丰富的蛋白质滤液通过2-DPAGE进行鉴定并显示图谱。本研究所用培养滤液来自Mtb典型菌株H37Ra，H37Rv，和Erdman的对数生长中期至晚期的培养液，首次对这些蛋白质进行广泛研究并详细分析。
利用计算机分析H37Rv，H37Ra和Erdman菌株滤液CFP中2-D凝胶溶解的蛋白质斑点，其分别为205、203和206个斑点。在所有斑点中，37个是用抗CFPs的mAb和多克隆血清而鉴定的。其中有几个抗体能识别出不止一个斑点；有几个被认为是与相同蛋白质的多个同种异构体发生反应，或以前就显示出能识别不止一个基因产物。用可获得的抗体得到17个蛋白质的图谱，其中部分或全部氨基酸序列已有报导(表4)。
为了定义更多的分子，对2-D PAGE上观察到的一些含量丰富的产物进行N-末端序列分析。
在Ag85B和Ag85C之间迁移的蛋白质经分析有16个残基(FSRPGLPVEYLQVPSP，[序列识别号95])与成熟的Ag85A和Ag85B的N-末端相同，而与Ag85C的一个残基(15位)不同。该蛋白质斑点显然只是Ag85A或B的同源体。然而，其复合物缺乏与Ag85-特异性的mAb(IT-49)的反应性，它的分子量大于Ag85B，且PI位移与Ag85A相关，推测该产物可能是由于后来翻译而产生了变化。或者，该蛋白质可能是Ag85复合物中未被识别的第四个成员。然而，Ag85复合物中的成员在一些报道中似乎都不存在后来翻译中的改变，而有其它报道在等电聚焦后存在几个与Ag85C相似的带。然而，没有直接的证据支持存在第四个Ag85产物。
经测序，第二产物为25kDa蛋白质，PI为5.34。其N-末端序列(XPVM/LVXPGXEXXQDN，[序列识别号100])显示了与Mtb质粒(cosmid)MTCY1A11的开放阅读框28c中的片段(DPVLVFPGMEIRQDN，[SEQ ID NO105])的同源性。对推导出的序列进行分析，揭示了信号肽酶I一致序列(Ala-Xaa-Ala)和以上所测序的25kDa蛋白的N-末端之前的明显信号肽。
对选择的CFPs进行N-末端测序，鉴定到三个新产物(1)与真杆菌类sp.VPI 12708的42kDaα-羟甾醇脱氢酶的N末端具有72％相同性的蛋白质；(2)前面定义为MPT-51的27kDa蛋白质；和(3))前面定义为谷氨酸盐合成酶的56kDa蛋白质。
这三个蛋白质的N-末端和任何已知的肽都没有表现出明显的同源性。对于这些蛋白质或其它难于进行N-基团分析的蛋白质，采用更先进的方法测序蛋白质(如，LC-MS-MS)可获得更多的序列信息。
由mAbs IT-42和IT-57识别的蛋白簇是本研究的主要内容。在一个共同发明人实验室得到的分子量范围在82-85kDa之间(或在另一个发明人实验室得到的88kDa)的蛋白质，pI范围为5.12-5.19。实施例I，1I和V中描述的结果是指约88kDa的CFP与70％的TB患者血清发生反应，并表现出100％的特异性。随后的2-D图谱与2-D Western blot分析显示了诱导TB患者早期抗体应答的优势抗原，它与IT-57和IT-42发生反应的蛋白质相同。如上所述，该抗原是指88kDa蛋白GlcB。
尽管最初的蛋白簇的N-末端测序失败，但经LC-MS-MS研究，表明蛋白簇中存在一种产物，即katG过氧化氢酶/过氧化物酶。
通过计算机辅助分析得到H37Rv的培养滤液的详细图谱，使得性质不同的Mtb的其它型菌株中的CFPs得到校准和比较。然而，所有检测到的区别都与所观察到的含量少的蛋白质有关。对于这些区别，一种解释是三种菌株的生长特性显著不同。几项研究已经表明Mtb培养时间对于分枝杆菌释放到培养上清液中的蛋白质特征具有显著作用。尤其是，Andersen et al.(supra)的研究表明少数定义明确的蛋白质是在培养期间的前三天分泌的，而逐渐分泌的细胞壁蛋白质是在对数生长期间出现的。对于异柠檬酸盐脱氢酶和65kDaGroEL同系物所检测的细胞质蛋白，直到对数生长期末期时才观察到有该蛋白的释放。
对致病Mtb菌株进行的这种广泛研究，已经鉴定了并且会继续鉴定免疫学上重要的蛋白质，而且会找到新的致病因素，从而产生改进的化疗方法。因此，本发明不仅促进了对Mtb的生理学全面认识，而且还提供了早期血清诊断的快速方法。
实施例IV通过重组方法进一步描述88kDa抗原的特征A.确定与mAb IT-57反应的88kDa抗原的一致性Mtb培养滤液的2-D Western blot分析和2-D图谱(参见US 6,245,331，12 June 2001，和WO 98/29132，published 09 July 1998)表明具血清优势的88kDa抗原可能与mAbs IT-42和IT57(#101，113，124)所识别的蛋白质相同。为了确定这些抗原的一致性，对与IT-57和IT-42反应的蛋白簇中得到的肽进行质谱分析。结果显示与两种mAbs都反应的蛋白质#124是KatG过氧化氢酶/过氧化物酶。对于只与一种mAb蛋白质反应的斑点#101和113的肽进行的分析还没有得出结论。为了获得与mAb IT-57反应的蛋白质，用mAb IT-57通过菌斑印迹筛选了具有λgt11 Mtb表达文库的约20,000个噬菌体。与mAb IT-57反应并编码分子量为88kDa的蛋白质的λgt11克隆体被称作″λgt11(IT-57)″。将λgt11(IT57)溶解的E.coli溶解产物和LFCFP通过含10％凝胶的SDS-PAGE聚丙烯酰胺进行分离，然后转移至硝酸纤维素滤器中，用mAb IT-57检测。mAb IT-57能识别LFCFP中的88kDa带和λgt11(IT-57)为溶菌原的E.coli溶解产物中的88kDa带。用野生型λgt11作溶菌原溶解的E.coli 1089的溶解产物中没有与mAb反应的蛋白质。
B.编码88kDa抗原的克隆体与katG基因的杂交由于2-D印迹上与mAb IT-57反应的斑点和mAb IT-42反应的斑点相互重叠，确定λgt11(IT-57)克隆体编码的88kDa蛋白质是否是katG基因产物、或者是否它是一种具有相似分子量和PI值的不同蛋白质是很重要的。Dr.Sheldon Morris提供了编码过氧化氢/过氧化物酶并被克隆至分枝杆菌穿梭载体pMD31中的MtbkatG基因。用酶KpnI和XbaI将katG基因从pMD31上剪切下来，得到2.9kb的插入片段。将λgt11(IT-57)中的DNA用EcoRI消化后所得到的约3.2kb插入片段与katG基因杂交。来自λgt11(IT-57)的3.2kb插入片段与其自身杂交，并且与含有katG基因的未剪切pMD31载体和katG插入DNA自身(2.9kb)进行杂交。因此，与mAb IT-57反应的88kDa抗原确实是过氧化氢/过氧化物酶。
C.在E.coli中表达的重组88kDa抗原的序列为了证实由λgt11(IT-57)得到的88kDa蛋白质确实是过氧化氢/过氧化物酶，对该克隆体中的插入DNA进行测序，发现其与NCBI BLAST研究的Mtb katG序列(accession number X68081)有99％的同源性。
D.TB血清与E.coli中表达的重组过氧化氢/过氧化物酶的反应性为了确定88kDa过氧化氢/过氧化物酶与TB患者血清的反应性，检测分离后的E.coli-λgt11(IT-57)的细胞溶解产物与来自6名晚期TB患者和4名PPD+健康者的血清的反应性。健康对照与TB血清都没有与88kDa过氧化氢/过氧化物酶蛋白质发生反应。因此，88kDa过氧化氢/过氧化物酶蛋白质不是后来被鉴定为GlcB的血清反应性抗原。
E.结核病血清与M.bovis BCG中表达的88kDa过氧化氢/过氧化物酶蛋白质的反应性由于TB患者与E.coli中表达的重组过氧化氢/过氧化物酶不发生反应，将pMD31MtBkAtG或对照pMD31质粒(载体对照)转染至katG-阴性的BCG株35747中进行测试。将LFCFPs，λgt11(IT-57)裂解的、感染野生型λgt11的E.coli 1089溶解的、含有pMD31MtbkatG的katG阴性的BCG株、和含有pMD31的katG阴性的BCG株的粗溶解产物通过10％凝胶上的SDS-PAGE聚丙烯酰胺分离。分离后的蛋白质被转移至硝酸纤维素滤器中，并用抗-过氧化氢/过氧化物酶多克隆血清(来自Dr.Clifton Barry，RockyMountain Laboratories，NIAID，Hamilton，MT)、mAb IT-57、mAb IT-42和晚期TB患者的血清进行检测。抗-过氧化氢/过氧化物酶多克隆血清和mAbIT-57与LFCFP、含有M.bovis BCG的Mtb katG和E.coliλgt11(IT-57)中的88kDa抗原发生显著反应。MAb IT-42与LFCFP和Mtb katG BCG中的相同带反应，但不与E.coli中表达的88kDa蛋白质反应。包含E.coli1089(λgt11)的溶解产物或katG-阴性的M.bovis BCG(只有pMD31)的溶解产物的对照带没有与任一mAbs反应。
与抗-过氧化氢/过氧化物酶抗体反应得到的结果相反，TB患者血清识别katG-阴性BCG株的溶解产物中的88kDa抗原。这就证明了血清反应性88kDa抗原是从前没有报导过的新蛋白质。
F.TB血清与Mtb 88kDa抗原GlcB的反应性为了确证存在于Mtb中的88kDa抗原与过氧化氢/过氧化物酶不同，对katG-Mtb的阴性株(ATCC 35822)进行了检测。该菌株中的裂解产物不与任何抗-过氧化氢/过氧化物酶抗体发生反应。然而，当用相同裂解产物检测健康者血清对照和所有三组的TB患者时，组III和组IV的所有血清都与88kDa蛋白质反应。
与血清反应的88kDa蛋白GlcB的氨基酸序列鉴定Mtb的katG-阴性株(ATCC 35822)的培养滤液蛋白通过上述2-D PAGE分解。将对应于血清反应性88kDa蛋白的蛋白斑点(″斑点1″)从凝胶中分离下来，并用胰岛素消化凝胶。抽提得到的胰蛋白酶肽，并用C18 RP-HPLC柱分离，用逐渐增加浓度的乙腈洗脱。将该方法洗脱出的肽直接导入FinniganLCQ电喷雾质谱仪中。(详见材料和方法部分)。当处于带电荷状态时，用高分辨扫描程序测定每种肽的分子量。
将上述质谱数据输入MS-Fit的计算机程序中，并在Mtb数据库中搜索，从而鉴定了88kDa蛋白GlcB。输入到MS-Fit分析系统中的数据和得到的结果如下所示。
输入的与MS匹配的搜索数据数据库NCBInr.07.09.99DNA框架翻译3菌种 分枝杆菌蛋白质分子量65000Da至97000Da蛋白质PI3.0至10.0 全部所用消化物 胰岛素Max.#Missed Cleavages2半胱氨酸的修饰物丙烯酰胺肽的N-末端 氢(H)肽的C-末端 游离酸(OH)样品识别号 Magic Bullet digest报告中的最大Hits25可能的修饰类型 M的氧化肽质量的变化范围±40.1Da肽质量 平均值Min.#Peptides to Match 9Report MOWSE Score Pfa0.4肽质量输入值(质量误差±1.5Da)

与MS匹配的搜索结果样品识别号Magic Bullet digest搜索的数据库NCBInr.07.09.99搜索的分子量(65000-97000Da)选中了21170条PI范围324311条搜索的菌种分枝杆菌选中了5990条结合分子量、PI和菌种进行搜索，选中了333条。
与MS-Fit的搜索结果为80条(显示的结果为前10个匹配结果)
结果总结

详细结果1.19/26匹配(73％) 80403.4Da，pI＝5.03.Acc#2497795.Mycobacteriumtuberculosis(Z78020)glcB(＝GlcB)
鉴定的蛋白质为Mtb的GlcB(Z78020)，基于它与其它已知细菌中蛋白质的同源性，它被认为是苹果酸盐合成酶。该蛋白质在NCBI基因库数据库中的登录号为CAB01465(Cole，S.T.et al.，Nature 393537-544(1998)，which describes the complete genome sequence of Mtb)。该蛋白的序列是前述的序列识别号106。
实施例V结核分枝杆菌的血清优势抗原的特征本研究的目标是确定TB患者体内抗体所识别的抗原种类，以阐明人体内对于Mtb产生的应答，并且评价这些抗原作为血清诊断候选物的潜力。该目标通过一维和二维电泳分离后的Mtb H37Rv分泌抗原与TB患者血清和健康对照血清(被E.coli吸附的)的免疫印迹分析而得到实现。
在超过200多种Mtb分泌蛋白质中，只有26种诱导TB患者体内产生抗体。这些抗原中的几个被确定具有同一性，这是根据(a)它们与鼠mAbs具有反应性，(b)N-末端氨基酸测序，和(c)液相色谱-质谱(实施例III)。26种抗原中的12种被来自早期患者、非空洞性TB和晚期空洞性TB的血清所识别。在这12种抗原中，有5种，包括88kDa抗原(实施例I)、MPT32和Ag85C与TB血清发生显著反应；其它两种抗原还没有被鉴定出。本发明旨在开发利用诱导早期和晚期TB患者体内产生抗体的抗原进行血清诊断的检测方法(如本发明所述)。
材料和方法受试者(a)晚期TB患者本研究包括来自33名HIV-阴性的被确定为肺结核(晚期TB)的血清样本。这些血清中的20例是由Dr.J.M.Phadtare(见实施例I)所提供。这些患者中的19名是涂片阳性，所有都具有影像学证明的中期至晚期空洞性病变。所有患者在开始治疗后的4-24周内都有出血现象。
(b)早期TB患者13名来自Manhattan VA Medical Center，New York的感染疾病中心的TB患者都显示培养液阳性，6/13是涂片阴性，12/13具有微小的或没有影像学病变。这些患者在开始治疗之前或治疗开始的1-2周内出血。
(c)对照组将23名HIVneg、TBneg、健康者作为对照组。其中16名是PPD+(皮肤试验)，其余7名是PPDneg.。
抗原将MtbH37Rv对数期的培养滤液作为分泌抗原的来源，如实施例I所描述(无LAM的培养滤液蛋白或CFPs)。LFCFP制备物中具有超过200种的蛋白质(实施例III，supra)。抗原按大小分离后，被装入制备型聚丙烯酰胺凝胶管中，利用逐渐增加的瓦特梯度进行电泳分离蛋白质(model 491 Prep Cell；Bio-Rad，Hercules，CA.)。收集分离部分，用SDS-PAGE检测并根据分子量收集。将污染的SDS按上述方法除去。每个分离部分与人血清以及载有针对Mtb抗原的鼠mAbs的大板进行发应，其反应性见实施例Example I。用E.coli溶解产物对血清进行免疫吸附，如实施例I所描述。所有ELISA测试，如实施例I所描述，都是利用E.coli溶解产物免疫吸附后的血清。
LFCFPs的一维(1-D)SDS-PAGE和2-D PAGELFCFPs(8μg/带)的分离用垂直板(SE 250 Mighty Small II，HoefferScientific，San Francisco，CA.)在微型凝胶上进行，凝胶中含有10％分离凝胶和5％层积凝胶。凝胶用银染色(Bio-Rad Silver Stain Kit，Hercules，CA)或用于免疫印迹中的电泳迁移。分离后的蛋白质被转至硝酸纤维膜上，以恒定100V进行1.5个小时。2-D PAGE操作在实施例III中有描述。经2-D PAGE分解的蛋白质被转移至硝酸膜上。
Western blot分析1-D和2-D印迹用含3％BSA的磷酸缓冲盐(PBS)封闭2个小时，用PBS/Tween 2％(清洗缓冲液)清洗1个小时。将含有分离后的LFCFPs的带在4℃下，与血清(用含1％BSA的PBS，以1∶100稀释)作用过夜。用四种不同的血清池检测包含2-D分离后的LFCFPs的斑点，其中血清池中包含的血清与上述抗原制剂的反应性已被ELISA确定。血清池包括(a)6名PPD阳性健康者对照血清，其对于任何抗原都没有特异性(组I)，(b)6名TB患者，其对于ELISA所用的全部3种抗原制剂都没有反应性(组II)，(c)6名TB患者，它们与所有的LFCFPs和88kDa大小的制备物都反应，但不与38kDa抗原制备物反应(组III)，以及(d)6名TB患者，其与38和88kDa大小的抗原都反应(组IV)。将斑点与血清或血清池作用，然后用清洗缓冲液清洗1.5个小时，再将碱性磷酸酯酶偶联的抗-人IgG(稀释比例为1∶2000，Zymed，CA.)加入其中，作用1.5个小时。清洗斑点达2个小时，用BCIP/NBT底物(Kirkegaard & Perry Laboratories，Gaithersburg，MD)显色。
表5TB患者的分类

na＝每组成员数结果血清与Mtb分泌抗原的反应性根据ELISA测定的血清与全部LFCFPs的反应性，或按大小分离的含有38kDa PstS或88kDa的血清反应性蛋白质，将血清分组(表5)。组I包括来自16名PPD+和7名PPDneg健康对照组的血清，这些血清在ELISA测试中与任何抗原都不显阳性。组II包括9名TB患者，这些患者在与三种抗原试剂检验中都显抗体阴性；其中5名患者是涂片阳性并具有空洞病变。其余4名患者没有空洞病变，但其中两名属涂片阳性。组III包括13名患者，具有LFCFPs和含有88kDa抗原分离部分的抗体，但不具有含38kDa抗原分离部分的抗体。其中5名涂片阳性并具有肺空洞病变。还有4名显示涂片阳性但没有任何空洞病变。其余4名涂片阴性且没有任何空洞病变。组IV包括11名患者，所有这些患者具有全部三种抗原试剂的抗体。10/11是涂片阳性，且所有患者具有中度至深度空洞病变的影像学特征。
血清所识别的LFCFPs中的抗原采用银染色后，经SDS-PAGE分离的LFCFP显示出从14至＞112kDa的大范围蛋白质。用4个组的血清(以1∶100稀释)探测经分离后的LFCFPs得到的Western blot斑点。经过大量的血清检测，得到几个印迹。当印迹被结合表示具有反应性时，不是所有的抗原带正好匹配。为了统一标准，以65kDa带为对照中心。在组I(PPD+和PPDneg健康对照)的血清中，被来自6名PPDneg健康者血清所识别的大多数抗原具有分子量为26，30-32kDa和65kDa。30-32和65kDa抗原也被9名PPD+健康对照组的血清所识别，其中只有3/9的血清识别26kDa抗原，而1例血清样本识别68kDa抗原。
组II结核血清是ELISA检测中与所有3种抗原试剂都显示抗体阴性的血清。尽管结核血清之间存在一些变化，但所有血清都与30-32kDa和65kDa抗原反应，5/8含有与26kDa抗原反应的抗体，这些抗原也被对照组所识别。一名患者的血清显示出与46、55和97kDa抗原的强反应性。四例血清，包括晚期患者表现出与74，76，88，105和112kDa抗原以及46-55kDa抗原的弱反应性。具有空洞病变的患者血清和没有空洞病变的患者血清在反应性方面没有表现出显著差异。
ELISA测试中，组III患者具有抗LFCFPs和88kDa制备物的抗体。10/11的血清显示了与88kDa抗原GlcB的中等反应性。此外，这些血清也能识别74，76，105，112kDa抗原以及46-55kDa中的一些抗原。尽管ELISA检测无反应性，但3/11的血清仍与38kDa抗原发生了反应。这可以表明结合了最近所描述的38kDa抗原(Bigi，F.et al.，1995，Infect.Immun.632581-2586)，该抗原是与PstS蛋白质不同的抗原。在(a)无肺空洞病变患者的血清(泳道25-30)与(b)具有空洞性病变的晚期患者的血清(泳道31-35)之间，反应类型没有区别。
ELISA检测中，与所有三种抗原试剂都反应的组IV患者(泳道36-43)与38kDa抗原产生强反应，并识别34kDa抗原，34kDa抗原没有被任何组III血清所识别。除了这两种抗原，被组IV血清所识别的抗原与组III血清识别的抗原相同，只是组IV血清与个别抗原的反应性显著增强。7/8的血清与88kDa GlcB抗原的反应强。
总之，所有抗体阳性的TB患者(组III和IV)主要与分子量＞46kDa的抗原发生反应。74，76，88，105，112kDa抗原和46-55kDa之间的抗原经常是人抗体反应的靶点。相反，38kDa和34kDa抗原被更有限的患者组所识别(组IV)。
被TB患者血清识别的抗原的鉴定2D-PAGE对于复杂蛋白质混合物的分辨率强。通过该方法，LFCFPs制备物分解成约200个不同的蛋白质。所有Mtb的CFPs的2-D图谱见US6,245,331和WO 98/29132(并在实施例III中讨论)。用组I-IV的血清池探测分离后的LFCFPs的2D免疫印记。每种血清池的反应性与鼠mAbs的反应性相比较来鉴定TB患者血清所识别的抗原(表6)。
与四种血清池反应的结果在表6A-C中描述。每种抗原的编号在实施例III中已给出。所有四种血清池都与4种分泌抗原反应，3/4的血清池与另外两种分泌抗原反应(表6A)。
这六种蛋白质在与健康对照组血清反应的2-D印记中清晰可见(组I)。与鼠mAb IT-49的反应性鉴别了其中两个是Ag 85B(#81，29kDa)和Ag 85A(#149，31kDa)。这些抗原对应于1-D免疫印记中的30-32kDa双峰。与所有血清组反应的其它两种抗原具有分子量为55kDa(#114，120)和58kDa(#86，96，105)，它不与鼠mAbs反应。之前的抗原已经通过N基团分析被鉴定为谷氨酸盐合成酶(实施例III)。这些抗原可能与1-D印记中与个别血清反应的65kDa抗原相似。抗原26kDa(#19，29)和46kDa(#51)与对照血清(组I)和抗体阳性TB血清(组III和组IV)发生反应，但不与抗体阴性的TB血清池(组II)反应。根据与鼠mAb IT67的反应性，之前的抗原(26kDa，#19，29)被鉴定为MPT64，而根据它在1-D印记上被几个对照血清识别的检测实验则表明可能是26kDa抗原。
组II TB患者的血清池(该血清缺乏与任一所测试的分泌抗原的ELISA-反应性抗体)反应性在表6A中描述。该血清池与这四种抗原(29，31，55，and58kDa)的反应性弱，而对照组(组I)与这些抗原反应，但该血清池没有显示与25/26(#19，29)和46kDa(#51)抗原的任何反应性。
含有抗88kDa(GlcB)而不含38kDa抗原的抗体的TB患者血清池(组III)，与18例2-D印记上的分泌抗原反应(表6B)。其中6种抗原与健康对照血清池识别的抗原相同(组I，表6A)。其余12种抗原，其中3个分子量低于30kDa一个是26kDa(#170，MPT51)，它能与mAb IT52反应，而另两个抗原(28kDa，#77；和29/30kDa，#69，59)不与任何所测试的mAbs反应。在30-60kDa范围内，与31kDa(#119，mAb IT-49，Ag85C)和38/42kDa抗原(#11，14，MPT32)的反应性强，而与35kDa抗原的一个异构体反应性低(#66，IT-23，PstS)。49kDa蛋白质(#82)与mAb IT-58反应。分子量为31kDa(#103)、42kDa(#68，80)和48kDa(#24)的抗原不能被任何mAbs所识别。这些抗原对应于1-D印记中30至60kDa范围内的多个带。在65-100kDa范围内，一种85kDa蛋白质(#113，124，IT-42，IT-57)与该血清池反应，但是1-D印记上没有74和76kDa抗原，而这些抗原在2-D印记上可以看到。2-D免疫印记上的85kDa抗原(#113，124)对应于88kDa抗原GlcB(实施例I和实施例III)。该抗原也通过检验分离的LFCFPs与mAbs IT-42和IT-57的反应性而得到确实，通过与两种抗原的反应，鉴定结果都为88kDa带。104kDa蛋白质(#111)对应于1-D印记上的105kDa。在2-D免疫印迹上没有看到与1-D免疫印迹上的112kDa抗原相对应的抗原。
组IV TB患者的血清池识别11/12的与组III血清池反应的抗原(只有28kDa抗原没有被识别，#77；表6B)。然而，组IV血清池与26kDa(#170，MPT51)，31kDa(#119，Ag 85C)，35kDa(#66，PstS)，38/42(#11，14，MPT32)，49kDa(#82；IT-58)，85kDa(#113，124)和104kDa(#111)抗原的反应性比组III血清池的反应性强。组III池只与35kDa抗原(#66，PstS)的一个异构体显示出弱的反应，相反，组IV池与被mAbIT-23所识别的全部四个异构体都发生反应。除了列出的与组III和组IV血清池都反应的11个抗原外(表6B)，后一组还与另外8种抗原反应(表6C)。分子量低于30kDa的抗原是13/14kDa蛋白质(#23，38，IT-12和SA12，GroES)。在30-38kDa范围内，血清池识别四种具有相同的31kDa分子量的新抗原，但pI值不同31kDa(#15，16，22，25)，31kDa(#62)，31kDa(#57)和31kDa(#37)以及第五种抗原38kDa(#32)。其中，只有31kDa(#15，16，22，25)与mAb IT-44反应，而其余4种抗原以前没有描述。在65kDa以上的区域，该池与66/72kDa蛋白质(#65，79，mAb IT-40和IT-41，DnaK)以及未得到鉴定的79kDa抗原反应(#78)。
总之，在被TB血清所识别的26种抗原中，有6个与对照血清反应(表6A)。26种抗原中的12个被组III和组IV血清识别(表6B)。因此，无论早期、无空洞TB患者还是晚期空洞病变患者都具有这些抗原的抗体。这12种抗原中，有5种能被明显识别出，因此，正如本发明所述，它们可以作为早期TB血清诊断检测中的优选抗原。它们是85kDa/88kDa抗原(#113，124；实施例I)、38/42蛋白质(#11，14，MPT32)、31kDa抗原(#119，Ag 85C)、未被表征的49kDa抗原(#82；IT-58)以及26kDa抗原(#170，IT-52)。相反，表6C中所列的另外8种抗原和38kDa蛋白质(#66，PstS；Table 6B)主要被晚期TB患者所识别，因此，其在血清诊断中的价值受到了限制。
讨论复制中的细菌分泌了约200种蛋白质，只有个别亚类可以被TB患者的免疫系统识别从而在患者血清中产生特异性抗体。甚至在亚类范围内，一些抗原可被早期和晚期TB患者所识别，而其它的只被晚期患者识别。鉴于38kDa PstS蛋白质是本领域最成功的血清诊断抗体这一事实(Bothamley etal.，1992，supra；Harboe etal.，1992，Jfect.Dis.，supra)，本发明公开的几种可被体内缺乏抗-38kDa抗体的患者所识别的抗原是非常重要的。正如本发明所述，在前面的实施例中用E.coli抗原通过免疫吸附去除交叉反应抗体可使具有强血清反应性表位的Mtb抗原得到确定。以前，未能成功鉴定在患者体内诱导抗体的Mtb抗原。Verbon et al.(supra)发现患者和对照组血清的反应性不存在差别。Espitia et al.(supra)(还利用未被吸附的血清)只鉴定到38kDa PstS蛋白质。该抗原只与57％的TB血清反应。用E.coli溶解产物免疫吸附血清消除了阻碍血清反应性抗原鉴定的交叉反应性抗体。此外，每种抗原的2-D分析和图谱可以准确鉴定抗原，这似乎是合理设计的血清诊断中的关键，至少5种分泌蛋白质可作为有用的血清诊断试剂。其中一种的抗体，88kDa抗原GlcB的抗体，其在80％的晚期患者中存在，在50％的早期TB患者体内存在。38/42kDa抗原(#11，14，MPT32)也被认为具有血清诊断的潜力(Espitia et al.，1995，supra)，但不是作为早期抗原。其余3种抗原，49kDa(#82；IT-58)、31kDa antigen(#119，Ag85C)和26kDa(#170，IT-52)在本发明之前，从来没有被用来评价患者的血清反应性。
本发明人的实验室对US 6,245,331(12 June 2001)和WO98/29132(published 09 July 1998)中2D凝胶上显示的一些斑点的参考编号做了改动，将数字改为字母标识。还可参见公开物Samanich，KM et al.，J Iyafec.Dis.1781534-1538(1998)，在此全文引用。一些斑点的数字标识与相对应的字母标识在上述公开物图1的图例中已给出，在下面再次给出

*Na＝没有赋值，表中的数字编号基于Sonnenberg et al.，1997，supra，同本发明实施例中所用。
表6各种血清池所识别的抗原

a抗原分子量(MW)，以kDa表示b编号对应于Mtb H37Rv的CFPs 2-D PAGE图谱(实施例III)NR未反应除了前述5种早期抗原以外，还有其它7种抗原也表现了与组III血清池的反应性(1)28kDa(#77)抗原，(2)29/30kDa(#69，59)抗原，(3)31kDa(#103)抗原，(4)35kDa(#66，IT-23)抗原(5)42kDa(#68，80)抗原(6)48kDa(#24)抗原和(7)104kDa(#111)抗原。
因此，将这些抗原或其带有表位的肽或肽的反应性变体中的一种或多种，联合5种早期抗原(或其肽)中的一种或多种用于免疫诊断试剂，可使诊断测试的灵敏度提高。
根据与抗体-阳性TB患者血清(组III和IV)反应比抗体-阴性患者血清和对照血清(组I和II；表6A)反应性显著增强，具有显著的强血清优势表位的其它三种抗原是(a)55kDa(#114，120，谷氨酸盐合成酶)抗原，(b)46kDa蛋白质(#51，IT-58)抗原和(c)31kDa(#149，Ag 85A)抗原。对于Ags 85A(#149)和B(#81)的血清诊断潜力，Van Vooren et al.(supra)通过等电聚焦分离和免疫印迹分析而进行评价。85A成分显示了与TB及非TB血清的反应性，而只有71％的TB血清识别了Ag 85B或C。重要的是，没有提供早期与晚期反应性的比较信息。
本发明的结果揭示了Ag 85A和85B与患者血清的强反应性和与对照血清的弱反应性，而85B与对照血清交叉反应性更强。对于Ag 85成分的研究揭示这些抗原的血清诊断潜力在于其特异性的表位(Wiker et al.，1992，Microbiol.Rev，supra)。该结果为这个结论创建了重要基础，并提供了这种表位的鉴定和检测基础。
最近被评价为血清诊断候选物的另一种蛋白质是MPT64(26kDa，#19，29)(Verbon et al.，1993，supra)，它被报道在约46％的活动期TB患者体内提高灵敏性。然而，2-D分析提示该蛋白尽管与晚期TB患者血清的反应性强，但仍没能区别组III的TB血清(无抗-38kDa抗体)和健康对照组(组I)之间的区别。
本发明所鉴定的早期抗原可能不是Mtb在体内生长时所分泌的仅有的早期抗原。这些抗原可能是由于具有强血清反应表位而得到识别的抗原。在微生物生长在巨噬细胞之间时，Mtb的几种抗原或被上调或被下调。本发明人的观点是，在体内，Mtb微生物在具体条件下产生了生存和生长所必需的蛋白质，这种具体条件与培养介质中生长的必需条件不同。值得注意的是，在早期TB患者体内诱导抗体的几种抗原(根据与组III血清的反应性)提示了其在体内对于引发疾病具有一定作用。因此，Ag 85A，Ag 85C和MPT51都属于分泌蛋白质家族，其与纤连蛋白相结合(Wikeret al.，1992，Scand.J.Imrraunol.，supra))。MPT32与M.Ieprae的一种结合纤连蛋白的蛋白质同源(Schorey，J.S.et al.，1995，Infect.Immun.6326522657)。
值得注目的是，28kDa抗原(#77)与组III而不是组IV血清池反应，暗示了一些抗原在疾病进展的不同阶段的表达也不同(Amara，R.R.et al.，1996，Infect.Immun.643765-3771)。
基于前面的发现，本发明人鉴定了血清反应性抗原，它可用于较早期的TB患者的诊断检测中。正如所预料的，这些抗原与其它分枝杆菌种中的相似蛋白质具有同源性，因此能确定用于血清诊断用途的具有种特异性的表位。
如果没有检测到可检测的抗体(通过ELISA)是由于该抗体在体内形成了免疫复合物(Grange，supra)，那么本发明提供了鉴别这种复合物的方法。
鉴于Mtb在培养液中复制时分泌了大量抗原，这些少量的抗原与TB患者抗体仍具有反应性是很有意义的。为了开发利用Ag 85A、85B和38(或35)kDa抗原的血清诊断方法，本领域人员已经付出了更多的努力。本发明清楚地显示了至少有5种其它的分泌抗原被绝大部分TB患者识别。正如本发明所公开的，这些抗原被用于设计TB的血清诊断测试中。
实施例VITB患者血清与纯化抗原和分泌抗原分离部分的反应性含有LFCFP的患者和对照血清与分离部分10、13和15以及纯化抗原Ag85C和MPT32的反应性在图3、4和表7中给予总结。正如实施例I和II中所讨论的，分离部分10富含38kDa抗原，分离部分13富含MPT32，分离部分15富含88kDa抗原GlcB，结果表明所有具有LFCFP抗体的晚期TB患者可以使用Ag85C或分离组分15中的抗原而得到检测。大部分患者还具有MPT32(分离组分13)和38kDa抗原(分离组分10)的抗体。然而，Ag85C和88kDa蛋质能被大多数患者的免疫系统识别而产生抗体。
所有与LFCFP反应的早期TB患者也与MPT32反应，但都不与38kDa抗原反应。在早期TB组中，与纯化的MPT32反应性(图4)比与部分纯化的抗原(分离组分13)反应性要高(图3)。
这些结果证实了早期TB患者血清能与本发明描述的5种早期抗原中的至少3种发生反应(实施例I)。这些发现证明了利用纯化的早期抗原会提高早期TB患者检测的灵敏度，从而得到改进的快速检测方法。
这些抗原中，只有MPT32在TB血清诊断发展中被考虑过。但是没有任何一种曾经显示出与早期TB患者血清具有反应性。因此，这是第一次建议将这些抗原用于诊断TB早期阶段的方法，这对于无免疫患者诸如HIV感染者尤为重要。
个别血清与抗原的反应性2-D印记上的任何一种单一抗原与血清池的反应可能表现出只与其中的一些个别血清发生反应。为了证实被组III血清池所识别的抗原具有广泛的反应性，测试单个血清是否存在组III血清池所识别的两种抗原的抗体，所述两种抗原是本发明人已经纯化了的Ag 85C和MPT32。还测试了与纯化的38kDa PstS抗原和88kDa抗原GlcB(分离组分15)的反应性。测试了比上面测试还多的TB患者，患者可以归类为空洞性或非空洞性TB。27/34(79％)的空洞性和9/20(45％)的非空洞性患者的血清与88kDa抗原反应(表8)，29/34(85％)的空洞性和9/20(45％)的非空洞性患者的血清与Ag 85C反应(表6)。29/34(85％)的空洞性和5/20(25％)的非空洞性患者的血清与MPT32反应(图4和表8)。相反，18/34(53％)的空洞性和只有1/20(5％)的非空洞性患者与纯化的38kDa抗原反应(表8)。
对于上述结果进行分析，显示了从31/34(91％)的空洞性和12/20(60％)的非空洞性TB患者中可以检测到抗体，其中，将与得到鉴别的3种抗原中的一种或多种的反应性称作阳性反应性。
对所有TB患者进行分析，以确定涂片阳性和检测到纯化抗原的抗体是否可以作为诊断TB的方法而进行比较。表9表明43/54(80％)的所有TB患者通过痰涂片被诊断出，通过ELISA检测也有43/54(80％)被诊断出。
表7患者对于纯化或分离的Mtb抗原的反应性纯化的抗原或抗原分离部分(用稀释的血清)

受试者的定义在实施例I和II中给予。HC＝健康对照。HIV+TB患者包括在TB诊断之前(pre)或之时(at)诊断出的患者。**OD值边界线。
不是所有涂片阳性的患者都具有可检测的抗体，也不是所有抗体阳性的患者其涂片也是阳性，而将涂片和ELISA联用会诊断出50/54(93％)的TB患者。
将TB患者分为空洞和非空洞性，97％(33/34)的空洞性和45％(9/20)的非空洞性TB患者可通过涂片被检测出。抗体检测的灵敏度分别为91％(31/34)和60％(12/20)。
因此，通过这两种方法的联用，会使灵敏度得到增加，空洞性TB增加至<p>比较例1将82重量份的氢氧化镍，5重量份的氧化亚钴，5重量份的石墨以二氧化钛2重量份均匀混合，5重量份的氧化镉，一起混合形成正极干粉。将正极干粉重量的0.7％的羧甲基纤维素钠作为亲水粘结剂。将正极干粉重量的2％聚四氟乙烯乳液作为疏水性粘结剂。将正极干粉、亲水性粘结剂、疏水性粘结剂搅拌得到均一的浆料，然后将浆料涂至镀镍毛刺钢带两侧，厚度控制在干燥碾压后为0.75毫米，冲切成60mm×39.5mm的正极片，并点焊上极耳与镉负极、隔膜组装成碱性镍镉电池，电解液为溶有氢氧化锂的氢氧化钾水溶液，制得电池D。
电池的充放电容量是在800mA(1C电流)下放电确定的；电池的循环性能方式为400mA充电150分钟-ΔV＝-10mV控制充电过程，400mA放电对电池进行充放电循环；同时测定了电池的内阻。电池A、电池B、电池C、电池D的表现如表1。
表1电池A、电池B、电池C、电池D的电化学性能

用超过98％的特异性进行结合，78％的(晚期)TB患者血清和56％的尿样具有抗体，能结合Mtb培养滤液蛋白中的抗原(图5，左)。如果只考虑至少两种体液中的一种存在抗体(血清和/或尿)，则92％的患者具有抗-分枝杆菌抗体。评价相同血清和尿样与纯化的MPT32的反应性(图5，右)，该抗原是用于血清诊断检测早期感染的优选抗原之一。14/23(61％)患者的两种样本中存在抗MPT 32的抗体。再一次，如果只考虑抗MPT 32的抗体存在于至少两种体液中的一种时，83％的患者具有抗MPT 32的抗体。
为了测定被这些尿抗体所识别的培养滤液抗原，将培养滤液蛋白在10％SDS聚丙烯酰胺凝胶上分离，然后进行Western blot分析。用2名晚期TB患者和2名PPD+健康对照组的血清和尿探测斑点。健康对照组的血清和尿样显示了与30-32和65kDa蛋白质的交叉反应性。正如所预料的，涂片阳性的TB患者(＝晚期)的血清样本(以1∶100稀释后测试)与20-120kDa之间的几个蛋白质带发生很强的反应，与88kDa(GIcB)带的反应也可清晰地辨别出。与MPT 51，MPT 32和Ag 85C的反应性却很难在1-D印记上辨别，这是由于还存在几种其它分子量相似的蛋白质。
TB患者的尿样(检测时未稀释)与一些特征相似的抗原反应，但发生反应的孔较少。88kDa蛋白GlcB可被两种尿样所识别，但与MPT 32、Ag 85C和MPT 51的反应性不能在1-D印记上被证实。然而，ELISA结果显示了尿样中存在抗-MPT 32抗体。这就表明尿样中的抗体与血清中的抗体都是针对相同的抗原，只是尿样中的抗体滴度较低而已。这些结果表明(1)相当比例的涂片阳性(晚期)TB患者的尿中存在抗-分枝杆菌抗体，因此，该抗体可作为TB尿液诊断的基础。
(2)对于尿和血清两种体液的抗-分枝杆菌抗体的检测显著提高了诊断检测率。利用两种体液增加了灵敏度，这对于涂片阴性(＝早期)的早期TB患者诊断具有重要意义，其中用现行血清诊断，其抗体检测灵敏度为50％，对于感染HIV的TB患者现行方法的灵敏度为66％。
(3)尿或尿/血清诊断检测TB所使用的抗原同本发明所描述的血清反应中鉴定的Mtb抗原(以及其它抗原)，包括全长蛋白质、聚合蛋白质、肽和肽多聚体。
实施例VIII非人类哺乳动物中的抗-分枝杆菌抗体为了测定分枝杆菌培养滤液中的何种抗原被患有TB的非人类哺乳动物识别，进行了以下实验。血清取自2只几内亚猪，该猪被感染了形成弥散毒性Mtb的4-5个菌落。上述方法感染的几内亚猪在14-15周内形成TB。感染的动物在感染后的第15周出血，血清被用来探测经12％ SDS-PAGE分离后的培养滤液的Western blot分析。2只未被感染的几内亚猪血清作为阴性对照进行培养。将2名人类TB患者的血清进行培养作为比较。健康者血清与Mtb培养滤液中的抗原65kDa和30-32kDa产生交叉反应。感染Mtb的几内亚猪的血清表现出与培养滤液中的几个抗原的强反应性，而这些抗原并未被对照血清所识别。因此，患有结核的动物血清表现出与88kDa蛋白GlcB、42-45kDa蛋白、38kDa蛋白和几个其它蛋白质带产生的强反应性。这种相同的抗原特征被来自人类TB患者的血清所识别。
这些结果显示了患有TB的哺乳动物血清所识别的抗原特征与人类TB患者所识别的特征相同。因此，本发明所定义的能用于人类血清诊断TB或TB疫苗的蛋白质和肽也能作为其它哺乳动物的TB血清诊断测试和疫苗的基础。本发明也可用于兽医医疗体系中。
实施例IX早期Mtb蛋白抗原的血清反应性肽首先设计了一项研究用来预测并检测Mtb 88kDa GlcB蛋白和MPT51蛋白的表位，这些蛋白质表位应该是具抗原性的并能与Mtb-感染者的早期抗体反应，从而使得它们可替代全长天然(或重组)分子而用于早期TB诊断试验中。采用几种不同的算法和方法对氨基酸序列进行分析，这些算法和方法也可以以相同方式广泛地用于检测其它Mtb蛋白质(PCGENE，Hydropathy，etc.)。
Hopp-Woods方法在Hopp，TP &amp; Woods，KR，Proc Natl Acad SciUSA，1981，783824-3828；Hopp &amp; Woods，Mollmmunol，1983 20483-489中描述。该方法是通过分析氨基酸序列确定蛋白质抗原决定簇来找到最大的局部亲水位点。其做法是，给予每种氨基酸一数值(亲水值)，然后将肽链的氨基酸亲水值反复平均。最高局部平均亲水位点始终位于抗原决定簇内或近邻于抗原决定簇。预测成功率由平均基团长度决定，由六肽平均值得到的结果较佳。该方法最初设计时，是采用12个蛋白质，将获得的大量免疫化学信息用于预测抗原决定簇。1983年的出版物描述了一种预测蛋白质抗原决定簇位点的计算方法，该方法只需要氨基酸序列信息。曾用该方法预测B型肝炎表面抗原的主要抗原决定簇，其适用于单机，并以BASIC语言写入，以便具有有限计算机经验和/或知识的研究者能够获得这些信息。这篇文献还阐述了利用流感血凝素确定多个同源系列蛋白质抗原位点的方法。
另一种分析分子“柔性”的方法是Karplus-Stultz方法(Stultz CM，KarplusM.，Proteins 200040258-289)。该方法基于动力学配基设计(DLD)算法，这是一种用于新配基形成的自动方法。该算法将小官能团连接起来，这些官能团是位于靶点分子结合位点的能量优势部位。小官能团的这些位置和取向可以利用多-拷贝同时搜索方法(或试验数据)而确定。一种新的模拟退火方案可被用于优化结合位点上配基的假-势能。
Jameson和其同事的方法是用来预测分子的抗原区域。Jameson BA &amp;WolfH，Comput Appl Biosci 19884181-186引入了一种计算机算法来预测由一级氨基酸序列所构成的蛋白质的拓扑特征。该计算机程序计算出表面可及参数，并将这些数值与区域骨架柔性参数相结合，从而预测二级结构。该算法的输出值，抗原指数被用来形成蛋白质的线性表面轮廓特征。由于大多数，如果不是全部，抗原位点位于蛋白质暴露区域的表面，该程序提供了预测潜在抗原决定簇的可信方法。将该方法用于特征已很了解的蛋白质上，得到的结果在预测的抗原指数与已知结构和生物数据之间具有很强的相关性。出版物Wolf，H.et al.，ComputAppl Biosci 1988，4187-19描述了一套完整的氨基酸序列分析程序。对于序列已知的蛋白质，其准确的三维结构却很少被了解，因此，优选采用一级氨基酸直接预测重要结构参数。该作者引入一种依据广泛的、由使用者所确定的氨基酸序列信息分析方法，它是基于公开的算法、设计得到标准蛋白质数据库、计算亲/疏水性、表面概率和柔性数值而得到预测的二级结构。数据以易读取图表形式输出，几种参数可能是集中在单个图中的多层数据以简化数据解译。该套方法包括用于预测潜在抗原位点的新算法。因此，软件包提供了有利工具，对用于分析抗原位点的氨基酸序列进行分析。这些算法在UWGCG(Univ of Wisconsin GeneticsComputer Group)程序集合中被赋予功能写法。
对于本发明，前述分析是在Macromolecular Resources，Inc.(Sigma/Genosys)的协作下所进行，该公司还合成了下述肽(纯度达95％)。合成了表示几个表位的连接生物素的肽，对这些肽与TB患者、PPD阳性和PPD阴性健康对照者血清的反应性进行评价。每种肽都被不同患者的抗体所识别。
表1088kDa蛋白中，带有早期TB免疫反应性表位肽的鉴定

a PPD+TB患者血清b PPD+对照血清c用MPT51进行了类似研究。对于MPT51*加入N-末端C和G(下划线)；不是天然蛋白质序列的一部分。氨基酸编号(aa 51..，等)表示肽在全长序列中对应的位置。
采用以下方法。用吸量管将封闭缓冲液(7.5％胎牛血清，2.5％ BSA)中的50μl连接生物素的肽加入到包被有抗生物素蛋白链菌素的微滴定板的每个孔中。将50μl的血清加入每个孔中并在室温下培养1个小时。用0.05％PBST清洗板4次。加入100μl抗-人抗体，在室温下培养1个小时。然后用Tris缓冲液清洗板6次，加入底物和扩增剂。在微板读取器上读取490nm时显色反应产物的吸收度。
结果显示在表10中，其中记录了观察到反应的肽。反应性被指定是与TB分离部分显示的阳性反应(吸收度比阴性对照血清＞2.5标准偏差)。测定不同稀释比例肽的血清反应性；以1/5和1/20稀释时，可以检测到应答，但通常以1/10稀释时，可观察到较佳应答。
实施例X用SPOTs技术鉴定Mtb蛋白GlcB中带有表位的肽用SPOTS表位图谱技术(Sigma Genosys)鉴定GlcB蛋白(＝88kDa蛋白)上的其它表位。对于技术详细内容，参见Sigma GenosysCustora SPOTsTechfzical Manual，v.l.l(available at http//www.genosys.com)。
按照发明人的指示，Sigma Genosys合成了13-mer肽的自定义库，有7个氨基酸相互重叠，并与衍生化的纤维素膜共价结合。122肽的序列，形成了如表11所示的全部蛋白质。该膜被用于免疫反应性比色检测中。游离的固定肽被重建后，使用第二种和随后的抗体或抗血清。因此，得到了基于相同肽基体的不同模式的肽，将这些肽用于定量和定性比较中。
为了显示图谱，用甲醇略微冲洗膜，再用Tris-缓冲的盐清洗三次(每次10分钟)。用Sigma Genosys提供的含有酪蛋白的封闭试剂在室温下封闭过夜。封闭后，用含有Tween-20(0.05％)的Tris-缓冲盐清洗膜，再将膜与1∶100稀释的血清池接触，血清池来自6名确诊的、涂片阳性的TB患者。
为了鉴定反应性肽，将重叠肽库与血清池培养4个小时，清洗并用β-半乳糖苷酶偶联的抗-人IgG的Ia∶200稀释液进行探测。培养后，清洗膜，再与β-半乳糖苷酶的底物接触(N，N′-二甲基甲酰胺(DMF)中的X-gal)。用去离子水彻底清洗(30分钟，更换3次)后的膜可再次使用，将膜放入DMF中，然后用缓冲液A(尿素48％w/v，SDS，1％w/v，和β-巯基乙醇，1/1000稀释的纯试剂)和缓冲液B(50％乙醇/10％醋酸(v/v))提取。除去先前沉积的底物，再次封闭膜，并用来自6名PPD皮肤试验阳性健康者的血清对膜进行探测。该血清池也以1∶100稀释。并用这2个相同血清池(TB患者和健康者)以两倍浓度(即1∶50稀释液)进行测试。作为对照，膜被β-半乳糖苷酶偶联的抗-人IgG(在此之前没有与人血清接触)探测以鉴定与二级抗体(或酶)非特异性结合的肽。
基于122重叠肽(序列识别号116-237)与血清池的反应性，以下肽被鉴定为TB患者中的强免疫原序列识别号117；序列识别号126；序列识别号127；序列识别号128；序列识别号134；序列识别号135；序列识别号136；序列识别号137；序列识别号138；序列识别号154；序列识别号155；序列识别号170；序列识别号172；序列识别号191；序列识别号216；和序列识别号217。
这些序列包括明显被识别的表位(2-5x)，它与TB血清池比对照血清具有更强显色。这些序列是早先基于计算机算法所识别的表位以外的序列，并且在患者体内发现具有免疫原性(见实施例IX)。
无论是否被明确引用，上述所引文献都在此引用为参考文献。
经过上述对本发明的详细描述，可以理解，在不背离本发明精神和范围下，本领域技术人员不通过适宜试验也可以在等效参数、浓度和条件的广泛范围内实现相同目的。
表11GlcB重叠肽序列*的分析

*血清反应性肽以黑体和较大字体标出
权利要求
1.一种抗原组合物，该组合物用于结核分支杆菌性疾病或感染的早期检测或用于抗结核分支杆菌的宿主免疫，组合物包括(a)一种肽，其选自(1)CGTDGAEKGPTYNKVRGDK，(序列识别号108)；(2)KIGIMDEERRTTVNLKAC，(序列识别号109)；(3)ELAWAPDEIREEVDNNC，(序列识别号110)；(4)LHRRRREFKARAAEKPAPSDRAG，(序列识别号111)；(5)ARDELQAQIDKWHRRR，(序列识别号112)；(6)LNRDRNYTAPGGGQ，(序列识别号113)；(7)GAPQLGRWKWHDPWV，(序列识别号114)；(8)VGNLRIARVLYDF(序列识别号117)；(9)QAQIDKWHRRRVI(序列识别号126)；(10)WHRRRVIEPIDMD序列识别号127)；(11)IEPIDMDAYRQFL(序列识别号128)；(12)ITTTAGPQLVVPV(序列识别号134)；(13)PQLVVPVLNARFA(序列识别号135)；(14)VLNARFALNAANA(序列识别号136)；(15)ALNAANARWGSLY(序列识别号137)；(16)ARWGSLYDALYGT(序列识别号138)；(17)SVLLINHGLHIEI(序列识别号154)；(18)HGLHIEILIDPES(序列识别号155)；(19)GGQFTLPGRSLMF(序列识别号170)；(20)FVRNVGHLMTNDA(序列识别号172)；(21)DRVVFINTGFLDR(序列识别号191)；(22)NCQSILGYVVRWV(序列识别号216)；以及(23)GYVVRWVDQGVGC(序列识别号217)；前提条件是所述组合物不是具有序列识别号为106或107的序列的全长蛋白质。(b)一种(a)中肽的突变体或功能性衍生物，其具有与所述GlcB或MPT51特异性抗体的反应性；或(c)任何所述(a)中(1)-(23)的肽或所述(b)的突变体或功能性衍生物中的两种或多种混合物。
2.根据权利要求1的抗原组合物，其为融合多肽，包括(a)一种或多种所述肽(1)-(23)或所述突变体，其与(b)相连(b)一种或多种蛋白质，选自序列识别号106，序列识别号107和另一种早期Mtb抗原；其中融合多肽包括一个任选的连接体或多个连接体，该连接体用于连接任何两种或多种所述蛋白质或肽。
3.根据权利要求1的抗原组合物，其为；(a)肽多聚体，具有通式；P1n其中，P1是肽(1)-(23)中的任何一种或其替代突变体，且n＝2-8，(b)肽多聚体，具有通式(P1-Xm)n-P2其中，P1和P2是肽(1)-(23)中的任何一种或其保守性替代突变体，其中(i)P1和P2可以相同或不同；而且，P1-Xm结构中的每个P1可以是与相邻肽不同的肽或突变体；(ii)X是(A)C1-C5烷基、C1-C5烯基、C1-C5炔基、最多含4个氧的C1-C5聚醚、其中m＝0或1，n＝1-7；或(B)Glyz其中z＝1-6，且其中肽多聚体与所述GlcB或MPT51蛋白质的特异性抗体发生反应。
4.根据权利要求1的抗原组合物，其为重组肽多聚体，具有通式(P1-Glyz)n-P2其中，P1和P2是肽(1)-(23)中的任何一种或其保守性替代突变体，并且(a)P1和P2可以相同或不同；而且，P1-Glyz结构中的每个P1可以是与其相邻肽不同的肽或突变体；(b)n＝1-100，z＝0-6；且其中肽多聚体与所述GlcB或MPT51蛋白质的特异性抗体发生反应。
5.一种用于结核分支杆菌性疾病或感染的早期检测的抗原组合物，其包括一种或多种肽，以混合物形式存在、或连接在肽多聚体或融合蛋白质上，所述一种或多种肽是早期结核分枝杆菌抗原片段序列的衍生物或具有该抗原片段序列，并具有以下特征(i)与肺结核患者体内抗体进行反应，该患者所处的阶段早于痰涂片阳性和肺空洞性病变的开始；(ii)与健康对照者或潜伏期的非活动性肺结核健康者的血清不发生反应；所述组合物显著不同于其它结核分枝杆菌蛋白质，这些蛋白质不具有上述所述的结核分枝杆菌抗原的特征。
6.一种对受试者进行分枝杆菌性疾病或感染的早期检测方法，包括检测活动期TB疑似者的生物液样，以检测是否存在权利要求1-5中任一抗原组合物的特异性抗体，其中所述抗体的存在表明具有所述疾病或感染。
7.根据权利要求6的方法，其中，所述抗原组合物是权利要求2的融合蛋白质。
8.根据权利要求6的方法，其中，所述抗原组合物是权利要求3或4的肽多聚体。
9.根据权利要求6-8中的任一方法，其在所述检测之前，进一步包括从受试者中获得生物液样的步骤。
10.根据权利要求6-9的中任一方法，其中所述生物液样取自具有活动期肺结核症状、但在出现晚期肺结核症状之前的受试者中，所述晚期肺结核由下述方法所鉴定(a)痰或其它肺相关液体的抗酸杆菌涂片阳性，(b)空洞肺病变，或(a)和(b)。
11.根据权利要求6-10中的任一方法，在所述检测步骤之前，还包括将存在于结核分枝杆菌和其它菌类中的交叉反应性表位或抗原的特异性抗体从样本中除去。
12.根据权利要求11的方法，其中所述除去是用E.coli抗原对所述样本进行免疫吸附。
13.根据权利要求6-12中的任一方法，其进一步包括检测所述样本是否存在一种或多种其它结核分枝杆菌早期抗原的特异性抗体，所述抗原选自(a)结核分枝杆菌蛋白GlcB蛋白，它具有序列识别号106的氨基酸序列；(b)结核分枝杆菌抗原MPT51，具有序列识别号107的氨基酸序列；(c)一种特征同结核分枝杆菌抗原85C的蛋白质；(d)一种特征同结核分枝杆菌抗原MPT32的糖蛋白；以及(e)包含一种或多种的(a)-(d)的融合蛋白。
14.根据权利要求6-13中的任一方法，其中所述受试者为人类。
15.根据权利要求14的方法，其中所述受试者感染有HIV-1或者为肺结核的高危群体。
16.根据权利要求6-15中的任一方法，其中所述生物液样为血清、尿或唾液。
17.根据权利要求16的方法，其中所述生物液样为尿。
18.根据权利要求6-17中的任一方法，其进一步包括在所述受试者的痰或其它体液的样本中检测分枝杆菌。
19.一种用于结核分枝杆菌早期检测的试剂盒，包括(a)权利要求1-5中的任一种抗原组合物，与(b)用于检测与所述肽相结合的抗体的必要试剂。
19.权利要求18的试剂盒，其进一步包括一种或多种结核分枝杆菌的早期抗原。
20.权利要求19的试剂盒，其中所述一种或多种早期抗原选自(a)结核分枝杆菌蛋白GlcB蛋白，具有序列识别号106的氨基酸序列；(b)结核分枝杆菌MPT51，其具有序列识别号107的氨基酸序列；(c)与结核分枝杆菌抗原85C特征相同的蛋白质；(d)与结核分枝杆菌抗原MPT32特征相同的蛋白质；以及(e)包括一种或多种(a)-(d)的融合蛋白。
全文摘要
根据发展成临床诊断性疾病之前的Mtb感染者体内存在早期抗体，因而鉴定出一些由结核分枝杆菌分泌的蛋白和糖蛋白抗原为“早期”Mtb抗原。鉴定到了这些早期Mtb抗原的含表位的肽片段，尤其是88kDa分泌蛋白、GlcB(序列识别号106)和Mtb抗原MPT51(序列识别号107)。这些肽及其突变体、包括一种或多种肽的两个或多个重复片段的肽多聚体、包括早期Mtb抗原性蛋白质、肽或二者的融合多肽都可用于宿主中早期TB的快速免疫检测中。优选的免疫测定方法是检测宿主尿液中的抗体。本发明还提供了抗原组合物、试剂盒和用于检测早期Mtb抗体的方法。抗原性蛋白质和肽也可用于疫苗组合物中。
文档编号A61K39/00GK1694725SQ02819446
公开日2005年11月9日 申请日期2002年8月2日 优先权日2001年8月2日
发明者休曼·拉洛, 苏珊·佐拉－帕茨纳, 约翰·T·贝利斯勒 申请人:纽约大学, 科洛拉多州大学研究基金会