缺血后白细胞－内皮细胞相互作用的调节的制作方法

专利名称：缺血后白细胞－内皮细胞相互作用的调节的制作方法
本申请要求2001年8月3日递交的序列号60/309,816的美国临时申请的优先权。
背景技术：
中风在美国是死亡率和成年人丧失行动能力的主要原因。根据联邦中风协会(National Stroke Association)的统计，中风是美国第三大死因，导致接近160,000人死亡。在美国每年有大约720,000人患中风，其中超过600,000人是缺血性中风。缺血性中风发生在血凝块阻碍血液流向脑部区域的时候。引发的缺氧或缺血导致细胞死亡。通向大脑受影响区域的血流可自然恢复，或通过用溶栓药物治疗来恢复。血液回流至大脑受影响区域称为再灌注。再灌注经常引发据信导致相当部分的中风相关性脑损伤的急性炎症反应。这种损伤叫做再灌注损伤，主要由嗜中性白细胞引起。
已经有相当多的证据证明白细胞促使短暂缺血后的脑损伤恶化。还有证据表明粘附分子是缺血和再灌注损伤的重要影响因素。众多动物研究证实，调节参与缺血和再灌注损伤的白细胞影响随后的脑损伤程度。已证实白细胞减少在局部性和全身性缺血模型中都提供抗缺血/再灌注损伤的保护(Bendar等，(1991)Stroke2244-50；Dukta等，(1989)Stroke20390-5；Matsuo等，(1994)Brain Research656344-52)。稍后的研究证实，阻断整联蛋白对短暂缺血后的脑损伤程度有影响(Bowes等，(1993)Neurology119215-9；Chopp等，(1994)Stroke25869-75；Jiang等，(1994)Neuroscience ResearchCommunications1585-93；Zhang等，(1994)Neurology441747-51)。
选择蛋白，例如P-选择蛋白、E-选择蛋白和L-选择蛋白，据信通过与靶细胞(例如血小板和淋巴细胞)表面上存在的配体特异性相互作用，介导胞间粘附作用。一般来说，选择蛋白配体至少部分由碳水化合物部分(例如唾液酸LewisX(sLeX)和唾液酸Lewisa(sLea))组成。P-选择蛋白结合含非唾液酸化形式的LewisX血型抗原的碳水化合物，并对唾液酸LewisX具有较高亲和力。P-选择蛋白糖蛋白配体-1(PSGL-1)是一种高亲和力P-选择蛋白配体，它还可以结合E-选择蛋白和L-选择蛋白，它由白细胞表达，并介导白细胞、血小板和内皮细胞类之间的细胞粘附作用(美国专利号5,843,707和美国专利号5,827,817)。
发明概述本发明部分基于发现了P-选择蛋白拮抗剂(例如rPSGL-Ig)阻碍白细胞顺着大脑皮层中的小静脉滚动，并阻碍短暂缺血后白细胞与血小板的粘附。通过例如在缺血前、再关注前或再关注过程中给予患者P-选择蛋白拮抗剂(如rPSGL-Ig)阻断P-选择蛋白与P-选择蛋白配体相互作用，可有效减轻由短暂缺血引起的脑损伤程度，包括脑梗塞范围。
因此，本发明提供用于患者减轻由缺血(例如中风)后再灌注损伤引起的组织或器官(例如脑)损伤的方法和组合物。本发明还提供用于患者减少由缺血后再灌注引起的梗塞(例如皮层梗塞)大小的方法和组合物。其它导致缺血并因此可造成再灌注损伤的缺血性疾病包括例如肠系膜及外周血管疾病、器官移植、循环休克和血栓形成疾病，例如血栓栓塞、深静脉血栓形成、肺栓塞、中风、心肌梗塞、流产、与抗凝血酶III缺乏、C蛋白缺乏、S蛋白缺乏、抗活性C蛋白相关的血栓形成倾向、血纤维蛋白原异常、纤溶病、高胱氨酸尿、妊娠、炎症、骨髓增生性疾病、动脉硬化、心绞痛(例如不稳定型心绞痛)、弥散性血管内凝血、血栓性血小板减少性紫癜、癌转移、镰状细胞病和肾小球肾炎。
本发明至少部分基于发现了通过给予患者P-选择蛋白拮抗剂(包括P-选择蛋白配体分子或其具有P-选择蛋白配体活性的片段，例如可溶性PSGL-1，或可溶性重组PSGL融合蛋白、抗P-选择蛋白抗体和抗P-选择蛋白配体抗体)产生的P-选择蛋白拮抗作用，抑制细胞粘附(例如细胞与细胞的粘附，如白细胞-内皮细胞粘附和白细胞-血小板粘附)以及细胞(例如白细胞)与血管的粘附，并减缓了白细胞在短暂缺血后的大脑表面小静脉中滚动，由此有效减轻由短暂缺血和再灌注引起的脑损伤和梗塞程度。本发明的P-选择蛋白配体分子在本文称为P-选择蛋白糖蛋白配体-1(PSGL-1)分子。
一方面，本发明提供一种预防或减轻患者缺血后再灌注损伤(例如脑)的方法，包括给予有效量的含P-选择蛋白拮抗剂的组合物。在一个实施方案中，所述患者患中风。在另一个实施方案中，所述再灌注损伤为皮层梗塞。在再一个实施方案中，在缺血前给予所述患者P-选择蛋白拮抗剂。在另一个实施方案中，在再灌注过程中给予所述患者P-选择蛋白拮抗剂。在一个优选实施方案中，在再灌注前给予所述患者P-选择蛋白拮抗剂。在再另一个实施方案中，给予所述患者P-选择蛋白拮抗剂连同有效量的一种或多种粘附分子拮抗剂，例如E-选择蛋白、L-选择蛋白、ICAM-1、VCAM-1或CD-18的抑制剂。在再一个实施方案中，给予P-选择蛋白拮抗剂连同溶栓药物(例如组织纤溶酶原激活物(tPA)或链激酶)、抗血小板药物(如阿司匹林或肝素)、抗凝剂(如华法令)或细胞保护剂。
在一个实施方案中，P-选择蛋白拮抗剂为P-选择蛋白配体蛋白。在另一个实施方案中，P-选择蛋白配体蛋白为人P-选择蛋白配体蛋白。在一个优选实施方案中，P-选择蛋白拮抗剂为可溶性P-选择蛋白配体蛋白或其具有P-选择蛋白配体活性的片段，如可溶性PSGL-1或可溶性重组PSGL融合蛋白，例如重组PSGL-Ig。在另一个实施方案中，P-选择蛋白拮抗剂为抗P-选择蛋白抗体或其生物活性片段、或抗P-选择蛋白配体抗体或其生物活性片段。在再另一个实施方案中，所述组合物还包含药用载体。
在一个实施方案中，所述患者为哺乳动物，例如人。在另一个实施方案中，本发明的方法包括给予可溶性P-选择蛋白配体蛋白，包括P-选择蛋白配体蛋白胞外结构域的至少一部分，例如SEQ IDNO2所示氨基酸序列的氨基酸42-60、42-88、42-118、42-189或42-310。在另一个实施方案中，所述蛋白为可溶性P-选择蛋白配体蛋白，包括SEQ ID NO2所示P-选择蛋白配体蛋白的至少胞外结构域。在再一个实施方案中，本发明提供的可溶性蛋白还包含免疫球蛋白(例如人IgG)的Fc部分。在一个相关实施方案中，所述可溶性蛋白为可溶性P-选择蛋白配体蛋白，它包含SEQ ID NO2的氨基酸42至氨基酸60的氨基酸序列，该序列以C末端和免疫球蛋白的Fc部分融合。在一个相关实施方案中，所述可溶性蛋白为可溶性P-选择蛋白配体蛋白，它包含SEQ ID NO2的氨基酸42至氨基酸88的氨基酸序列，该序列以C末端和免疫球蛋白的Fc部分融合。在再一个实施方案中，免疫球蛋白的Fc部分通过连接序列与P-选择蛋白配体蛋白融合。
另一方面，本发明提供一种方法，该方法通过给予一种组合物预防或减轻患者缺血后脑梗塞，所述组合物包含有效量的P-选择蛋白拮抗剂或其具有P-选择蛋白配体活性的片段，例如可溶性PSGL-1或可溶性重组PSGL融合蛋白(如重组PSGL-Ig)、抗P-选择蛋白配体抗体或其生物活性片段、或抗P-选择蛋白抗体或其生物活性片段。再一方面，本发明提供一种方法，该方法通过给予一种组合物预防或减轻患者中风后脑损伤，所述组合物包含有效量的P-选择蛋白拮抗剂或其具有P-选择蛋白配体活性的片段，例如可溶性PSGL-1或可溶性重组PSGL融合蛋白(如重组PSGL-Ig)、抗P-选择蛋白配体抗体或其生物活性片段、或抗P-选择蛋白抗体或其生物活性片段。再另一方面，本发明提供一种方法，该方法通过给予一种组合物抑制患者缺血后细胞与血管粘附，所述组合物包含有效量的P-选择蛋白拮抗剂或其具有P-选择蛋白配体活性的片段，例如可溶性PSGL-1或可溶性重组PSGL融合蛋白(如重组PSGL-Ig)、抗P-选择蛋白配体抗体或其生物活性片段、或抗P-选择蛋白抗体或其生物活性片段。在一个实施方案中，所述血管为患者脑血管。在另一个实施方案中，所述细胞为白细胞。
再另一方面，本发明提供一种方法，该方法通过给予一种组合物抑制患者缺血后细胞与细胞粘附(例如白细胞-血小板粘附)，所述组合物包含有效量的P-选择蛋白拮抗剂或其具有P-选择蛋白配体活性的片段，例如可溶性PSGL-1或可溶性重组PSGL融合蛋白(如重组PSGL-Ig)、抗P-选择蛋白配体抗体或其生物活性片段、或抗P-选择蛋白抗体或其生物活性片段。
再另一方面，本发明提供一种鉴定能够在例如短暂缺血后预防或减轻再灌注损伤和/或减缓白细胞在血管中(例如顺着大脑皮层小静脉)滚动的化合物的方法，其中对所述化合物调节PSGL-1多肽活性的能力进行测定。在一个实施方案中，通过检测细胞粘附(例如胞间粘附(如白细胞-内皮细胞或白细胞-血小板粘附)和细胞(例如血小板或白细胞)与血管粘附)的降低，测定所述化合物调节PSGL-1多肽活性的能力。
由以下的详述和权利要求显见本发明其它的特征和优势。
附图简述

图1图示了rPSGL-Ig在大脑中动脉闭塞30分钟后的再灌注过程中对白细胞在大脑表面小静脉中滚动的影响。
图2图示了rPSGL-Ig在大脑中动脉闭塞120分钟后的再灌注过程中对白细胞在大脑表面小静脉中滚动的影响。
发明详述本发明至少部分基于发现了可溶性P-选择蛋白配体分子在缺血性中风动物模型中调节(例如减缓)短暂缺血后沿着大脑皮层小静脉的白细胞滚动。本文使用的“白细胞滚动”包括白细胞与血管内皮细胞微弱粘附，并且在牢固粘附细胞之前和在白细胞迁移至内皮组织中之前白细胞沿着血管内皮细胞滚动。给予患者可溶性P-选择蛋白配体分子也显著降低由缺血后再灌注造成的皮层梗塞面积。因此，给予可溶性P-选择蛋白配体分子保护患者大脑免受缺血(例如中风)和再灌输损伤引起的损伤。
因此，本发明提供预防和减轻由缺血(例如中风)后再灌注引起的损伤(例如组织或器官(如脑)损伤)的方法和组合物。本发明还提供通过给予P-选择蛋白拮抗剂(例如可溶性P-选择蛋白配体蛋白或其具有P-选择蛋白配体活性的片段(如可溶性PSGL-1或可溶性重组PSGL融合蛋白)、抗P-选择蛋白配体抗体或其生物活性片段、或抗P-选择蛋白抗体或其生物活性片段)调节(例如预防或减轻)体内再灌注损伤的方法和组合物。P-选择蛋白拮抗剂可在缺血前、再灌注前或再灌注过程中给予。用于本发明方法的P-选择蛋白配体蛋白在本文称为P-选择蛋白糖蛋白配体-1(PSGL-1)分子。
本文使用的缺血性疾病是指其中血流被阻塞或中断导致供应任何器官、组织或细胞的血液和氧缺乏的任何疾病。许多医学干预，例如搭桥手术过程中的血流中断，可导致缺血。缺血可由病态心血管组织引起，并可影响心血管组织，例如缺血性心脏病。但缺血可发生在任何遭遇氧供应缺乏的器官。其它导致缺血并因此可导致再灌注损伤的疾病包括例如心肌缺血、肠系膜及外周血管疾病、器官移植、循环休克和血栓形成疾病，例如血栓栓塞、深静脉血栓形成、肺栓塞、心肌梗塞、流产、与抗凝血酶III缺乏、C蛋白缺乏、S蛋白缺乏、抗活性C蛋白相关的血栓形成倾向、血纤维蛋白原异常、纤溶病、高胱氨酸尿、妊娠、炎症、骨髓增生性疾病、动脉硬化、心绞痛(例如不稳定型心绞痛)、弥散性血管内凝血、血栓性血小板减少性紫癜、癌转移、镰状细胞病和肾小球肾炎。
本文使用的“再灌注”包括通向缺血性血管的血流或自然恢复，或通过用溶栓药物(例如组织纤溶酶原激活物(tPA)或链激酶)或其它药物(如抗凝剂或抗血小板药物)诱导恢复。本文使用的“再灌注损伤”包括由可导致组织功能障碍和梗塞(例如皮层梗塞)的缺血和再灌注造成的任何器官、组织(例如血管)或细胞破坏或损伤。再灌注损伤至少部分是由患者的炎症反应引起，包括缺血区域的细胞与细胞粘附(例如白细胞-内皮细胞粘附和白细胞-血小板粘附)和白细胞浸润(白细胞滚动)，推测这部分是因为凝血酶和细胞因子活化血小板和内皮细胞使它们粘附白细胞(Romson等，Circulation 671016-1023，1983)。在白细胞滚动后，这些粘附的白细胞可通过内皮细胞迁移，并在再灌注过程中破坏缺血组织。因此，减缓白细胞滚动使再灌注引起的组织和器官损伤减轻。
本文使用的“P-选择蛋白拮抗剂”包括例如通过抑制P-选择蛋白或E-选择蛋白和P-选择蛋白配体蛋白之间的相互作用、例如通过抑制表达P-选择蛋白或E-选择蛋白的内皮细胞和活化血小板与表达PSGL的白细胞的相互作用，能够拮抗P-选择蛋白和/或E-选择蛋白的任何药物。例如，P-选择蛋白拮抗剂包括P-选择蛋白配体分子或其具有P-选择蛋白配体活性的片段，例如可溶性PSGL-1或可溶性重组PSGL融合蛋白(如PSGL-Ig)，以及小分子、抗P-选择蛋白抗体和抗P-选择蛋白配体抗体。在一个优选实施方案中，所述P-选择蛋白配体是可溶的。
本文交互使用的“P-选择蛋白配体活性”、“PSGL-1活性”、“PSGL-1的生物活性”或“PSGL-1的功能活性”包括按照标准技术在体内或体外测定的由PSGL-1蛋白、多肽或核酸分子施加于PSGL-1反应性细胞(例如血小板、白细胞或内皮细胞)的活性。PSGL-1活性可以是一种直接活性，例如与PSGL-1靶分子(如P-选择蛋白或E-选择蛋白)结合。本文使用的“底物”或“靶分子”或“结合配偶体”是一种分子，例如P-选择蛋白或E-选择蛋白，PSGL-1蛋白与其天然互作或结合，从而获得PSGL-1介导的功能，例如调节细胞迁移或粘附。PSGL-1靶分子可为非PAGL-1分子或PSGL-1蛋白或多肽。所述靶分子的实例包括和PSGL-1蛋白处于相同信号转导途径中的蛋白，例如在参与调节P-选择蛋白结合的途径中在PSGL-1蛋白上游(活性刺激剂和抑制剂都包括在内)或下游起作用的蛋白。或者，PSGL-1活性是一种间接活性，例如由PSGL-1蛋白与PSGL-1靶分子(例如P-选择蛋白或E-选择蛋白)互作介导的细胞信号转导活性。本文描述的PSGL-1生物活性包括例如一种或多种以下活性1)结合或作用于P-选择蛋白或E-选择蛋白；2)调节P-选择蛋白或E-选择蛋白结合；3)调节(例如降低或减弱)细胞粘附，例如胞间粘附(例如白细胞-内皮细胞粘附和白细胞-血小板粘附)和细胞(例如白细胞)与血管(例如脑血管)粘附；4)调节白细胞向血小板和内皮细胞的募集；5)调节细胞(例如白细胞或血小板)迁移；6)调节(例如降低或减弱)例如脑血管中的白细胞滚动；7)调节(例如预防或减轻)缺血后的再灌注损伤；和8)调节(例如降低或减轻)再灌注后例如大脑中的梗塞程度。
可在缺血前、再灌注前或再灌注过程中给予患者P-选择蛋白拮抗剂。在一个优选实施方案中，在缺血后和再灌注前给予P-选择蛋白拮抗剂。P-选择蛋白拮抗剂可在例如再灌注前和再灌注过程中以单剂给予或以特定周期多剂量给予。在一个优选实施方案中，P-选择蛋白拮抗剂静脉给予。
P-选择蛋白拮抗剂可单独给药，或与溶栓药物(例如组织纤溶酶原激活物(tPA)或链激酶)、抗血小板药物(如阿司匹林或肝素)、抗凝剂(如华法令)或细胞保护剂一同给药，或与一种或多种粘附分子抑制剂(例如E-选择蛋白、L-选择蛋白、ICAM-1、VCAM-1或CD-18抑制剂)联合给药。
用于本发明方法的PSGL-1分子描述于美国专利序号5,827,817，其内容通过引用结合到本文中。
用于本发明方法的PSGL-1分子是一种糖蛋白，其可以包含以下的一种或多种末端碳水化合物NeuAcα(2，3)Galβ(1，4)GlcNAc-R|α(1，3)FucNeuAcα(2，3)Galβ(1，4)GlcNAc-R|α(1，4)FucGalβ(1，4)GlcNAc-R|α(1，3)FucGalβ(1，4)GlcNAc-R|α(1，4)Fuc其中R表示碳水化合物链的剩余部分，其或者直接共价连接至P-选择蛋白配体蛋白，或者共价连接至与P-选择蛋白配体蛋白共价连接的脂质部分。用于本发明方法的P-选择蛋白配体糖蛋白又可硫酸化，或者翻译后修饰。当在COS和CHO细胞中表达时，全长P-选择蛋白配体蛋白(SEQ ID NO2的氨基酸1-402)或成熟P-选择蛋白配体蛋白(SEQ ID NO2的氨基酸42-402)为同型二聚体或二价蛋白，其表观分子量据非还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳所示为220kD。
PSGL-1是一种在内皮细胞和血小板上起P-选择蛋白和E-选择蛋白配体作用的糖蛋白。SEQ ID NO1列出了PSGL-1的DNA序列。PSGL-1的完整氨基酸序列，即成熟肽加上前导序列，经鉴定为SEQ ID NO2所示氨基酸序列的氨基酸1至氨基酸402。成熟PSGL-1蛋白经鉴定为SEQ ID NO2所示氨基酸序列的氨基酸42至氨基酸402。
本文使用的“可溶性PSGL-1蛋白”或“可溶性P-选择蛋白配体蛋白”是指可溶性P-选择蛋白配体糖蛋白(例如可溶性PSGL-1)或其具有P-选择蛋白配体活性的片段，包括含sLeX的碳水化合物。用于本发明方法的可溶性P-选择蛋白配体蛋白优选至少包括SEQ IDNO2的约氨基酸18至约氨基酸310的PSGL-1胞外结构域或其生物活性片段。其它可溶形式的P-选择蛋白配体分子经鉴定为SEQ IDNO2所示氨基酸序列的例如氨基酸42至310或其生物活性片段。PSGL-1胞外结构域的生物活性片段包括例如SEQ ID NO2所示氨基酸序列的氨基酸42-60、42-88、42-118和42-189。用于本发明方法的可溶性PSGL-1蛋白优选为单体或二聚体PSGL-1蛋白。
在本发明方法的一个实施方案中，本发明方法的可溶形式的P-选择蛋白配体分子可通过“连接”序列与免疫球蛋白(例如IgG分子)的Fc部分融合，形成融合蛋白。其它免疫球蛋白同种型也可以用于产生所述融合蛋白。
在本发明的另一个实施方案中，所述可溶性P-选择蛋白配体蛋白是一种嵌合分子，其由PSGL-1蛋白分子的胞外结构域(一种含sLeX的碳水化合物)组成，并通过连接序列与人IgG的Fc部分融合。
可通过例如改变PSGL-1的氨基酸序列使SEQ ID NO2位置310的半胱氨酸由丝氨酸或丙氨酸取代，或通过本领域已知的其它方法，生产单体形式的PSGL-1。
在一个优选实施方案中，由成熟PSGL-1的N-末端47个氨基酸生产二聚体PSGL-1(dimPSGL-1)融合蛋白，由此保持对P-选择蛋白的高亲和力，但减弱了与L-选择蛋白和E-选择蛋白的结合。PSGL-1的N-末端47个氨基酸与人免疫球蛋白(IgG1)的Fc部分连接，由此恢复在天然PSGL-1分子中观察到的二价提呈(bivalent presentation)。最后，为禁止Fc受体结合和补体结合作用(效应子)或功能，突变IgG-Fc区的两个氨基酸(参见实施例1)。
本发明的方法包括使用核酸分子，它们由于遗传密码简并性而与SEQ ID NO1所示核苷酸序列不同，并因此与SEQ ID NO1所示核苷酸序列编码相同的PSGL-1蛋白。在另一个实施方案中，包括在本发明方法中的分离核酸分子其核苷酸序列编码具有SEQ IDNO2所示氨基酸序列的蛋白。
本发明方法还包括使用人PSGL-1的等位基因变异体，例如功能性或非功能性等位基因变异体。功能性等位基因变异体是天然存在的人PSGL-1蛋白的氨基酸序列变异体，其保持本文所述的PSGL-1活性，例如结合P-选择蛋白或E-选择蛋白。功能性等位基因变异体一般仅包含SEQ ID NO2的一个或多个氨基酸的保守取代，或者包含所述蛋白非关键区域中非关键残基的取代、缺失或插入。非功能性等位基因变异体是不具有PSGL-1活性的人PSGL-1蛋白的天然氨基酸序列变异体。非功能性等位基因变异体一般包含SEQ ID NO2氨基酸序列的非保守取代、缺失或插入或成熟前截短，或者包含所述蛋白关键残基或关键区域的取代、插入或缺失。
以下小节更详细地描述了本发明的各个方面。
I.用于本发明方法的分离PSGL-1蛋白、抗PSGL-1抗体和抗P-选择蛋白抗体本发明方法包括使用分离的P-选择蛋白配体蛋白(例如PSGL-1蛋白)及其生物活性部分，以及适用作激发抗P-选择蛋白配体抗体的免疫原的多肽片段。在一个实施方案中，可通过使用标准蛋白纯化技术的合适纯化流程由细胞或组织来源中分离天然PSGL-1蛋白。在另一个实施方案中，通过重组DNA技术生产PSGL-1蛋白。作为对重组表达的替代方法，可使用标准肽合成技术化学合成PSGL-1蛋白或多肽。
本文使用的PSGL-1蛋白的“生物活性部分”包括具有PSGL-1活性的PSGL-1蛋白片段。PSGL-1蛋白的生物活性部分包括含与PSGL-1蛋白的氨基酸序列(例如SEQ ID NO2所示氨基酸序列)足够相同或由其衍生的氨基酸序列的肽，它包含的氨基酸比全长PSGL-1蛋白少，并具有至少一种PSGL-1蛋白活性。通常，生物活性部分包含具有至少一种PSGL-1蛋白活性的结构域或基序(例如含PSGL-1胞外结构域的片段或其能够与P-选择蛋白和/或E-选择蛋白互作的片段)。PSGL-1蛋白的生物活性部分可以为例如长度为18、20、22、25、50、75、100、125、150、175、200、250、300或更多个氨基酸的多肽。PSGL-1蛋白的生物活性部分可用作开发PSGL-1活性调节药物的靶点。
在一个优选实施方案中，用于本发明方法的PSGL-1蛋白至少具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的胞外结构域或PSGL-1胞外结构域的P-选择蛋白结合片段或SEQ ID NO2的胞外结构域。在其它实施方案中，PSGL-1蛋白与SEQ ID NO2大致相同，并保有SEQ IDNO2蛋白的功能活性，但由于天然等位基因变异或诱变而在氨基酸序列上有差异，如以下第II小节的详述。因此，在另一个实施方案中，用于本发明方法的PSGL-1蛋白包含的氨基酸序列与SEQ IDNO2至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高相同。
在一个优选实施方案中，用于本发明方法的PSGL-1蛋白是一种可溶性P-选择蛋白配体蛋白。可通过表达修饰的DNA制备编码可溶形式的P-选择蛋白配体蛋白的DNA，在所述修饰的DNA中，编码P-选择蛋白配体配体蛋白跨膜结构域和胞质结构域的区域缺失和/或终止密码子引入至胞外结构域羧基末端氨基酸密码子的3′。例如，疏水性分析预示SEQ ID NO2所示的P-选择蛋白配体蛋白具有由SEQ ID NO2的氨基酸311-332所组成的跨膜结构域和由SEQ IDNO2的氨基酸333-402所组成的胞质结构域。可通过标准分子生物技术(包括本领域已知的定点诱变法)或通过使用合适寡核苷酸引物的聚合酶链反应制备如上所述的修饰DNA。美国专利第5,827,817号提供了各种可溶性P-选择蛋白配体蛋白的几个编码DNA的生产方法，该专利通过引用结合到本文中。
为测定两个氨基酸序列或两个核酸序列的同一性百分率，从对比最佳的目的出发，对这些序列进行比对(例如可将空位引入到第一个和第二个氨基酸或核酸序列的一个或两个中，以便比对最佳，为对比可忽略不相同的序列)。在一个优选实施方案中，用于对比的比对参比序列长度至少是参比序列长度的30％，优选至少40％，更优选至少50％，再更优选至少为60％，再更优选至少为70％、80％或90％(例如当比对第二个序列和具有400个氨基酸残基的SEQ ID NO2的PSGL-1氨基酸序列时，要比对至少280个、优选至少240个、更优选至少200个、再更优选至少160个、再更优选至少120个、80个或40个或更少的氨基酸残基)。然后对比相应的氨基酸位置或核苷酸位置上的氨基酸残基或核苷酸。当第一个序列中的一个位置由与第二个序列相应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，则所述分子在该位置相同(本文使用的氨基酸或核酸“同一性”等同于氨基酸或核酸“同源性”)。两个序列之间的同一性百分比随所述序列共有的相同位置数变化，还要考虑为两个序列最佳比对目的而需要引入的空位数和每个空位的长度。
可使用数学算法完成两个序列之间的序列对比和同一性百分率的测定。在一个优选实施方案中，使用已加入到GCG软件包(可在http//www.gcg.com获得)的GAP程序中的Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48444-453(1970))算法，使用Blosum62矩阵或PAM250矩阵，空位插入罚分为16、14、12、10、8、6或4，空位延长罚分为1、2、3、4、5或6，测定两个氨基酸序列之间的同一性百分率。在再另一个优选实施方案中，使用GCG软件包(可在http//www.gcg.com获得)的GAP程序，使用NWSgapdna.CMP矩阵，空位插入罚分为40、50、60、70或80，空位延长罚分为1、2、3、4、5或6，测定两个核苷酸序列之间的同一性百分率。在另一个实施方案中，使用已加入到ALIGN程序(版本2.0或2.0U)中的E.Meyers和W.Miller(Comput.Appl.Biosci.411-17(1988))算法，使用PAM120权重残基表、空位长度罚分12和空位罚分4，测定两个氨基酸或核苷酸序列之间的同一性百分率。
本发明的方法还可以使用PSGL-1嵌合蛋白或融合蛋白。本文使用的PSGL-1“嵌合蛋白”或“融合蛋白”包含有效连接非PSGL-1多肽的PSGL-1多肽。“PSGL-1多肽”是指具有对应于PSGL-1分子的氨基酸序列的多肽，而“非PSGL-1多肽”是指其氨基酸序列对应于与PSGL-1蛋白基本不同源的蛋白(例如与PSGL-1蛋白不同并来源于相同或不同生物的蛋白)的多肽。在PSGL-1融合蛋白中，PSGL-1多肽可对应于PSGL-1蛋白的全部或一部分。在一个优选实施方案中，PSGL-1融合蛋白包含PSGL-1蛋白的至少一个生物活性部分，例如PSGL-1胞外结构域或其P-选择蛋白结合片段。在另一个优选实施方案中，PSGL-1融合蛋白包含PSGL-1蛋白的至少两个生物活性部分。在融合蛋白中，术语“有效连接”意在表示PSGL-1多肽和非PSGL-1多肽相互按读框融合。非PSGL-1多肽可融合至PSGL-1多肽的N末端或C末端。
例如，在一个实施方案中，所述融合蛋白为重组可溶形式的PSGL-1蛋白，其中所述PSGL-1分子的胞外结构域与人IgG融合，例如可溶性rPSGL-Ig。
在另一个实施方案中，该融合蛋白是在其N端含异源信号序列的PSGL-1蛋白。在某些宿主细胞(例如哺乳动物宿主细胞)中，PSGL-1的表达和/或分泌可通过使用异源信号序列增加。
用于本发明方法的可溶性PSGL-1融合蛋白(例如rPSGL-Ig)可加入到药用组合物中，并体内给予患者。可溶性PSGL-1融合蛋白可用于影响PSGL-1底物(例如P-选择蛋白或E-选择蛋白)的生物利用率。
而且，用于本发明方法的PSGL-1融合蛋白可用作在患者中产生抗P-选择蛋白配体抗体的免疫原、用于纯化P-选择蛋白配体并在筛选测定中用于鉴别抑制P-选择蛋白配体分子与P-选择蛋白分子相互作用的分子。
用于本发明方法的PSGL-1嵌合蛋白或融合蛋白最好通过标准重组DNA技术生产。例如，按照常规技术，例如通过使用用于连接的平端或错口末端、限制酶消化产生合适的末端、填补合适的粘性末端、碱性磷酸酶处理以避免不需要的连接并酶促连接，按读框将编码不同多肽序列的DNA片段连接在一起。在另一个实施方案中，可通过常规技术(包括自动化DNA合成仪)合成融合基因。或者，可使用在两个相邻基因片段之间产生互补性突出端的锚式引物，对基因片段进行PCR扩增，其随后可退火并再扩增，以产生嵌合基因序列(参见例如Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel等编辑，JohnWiley&Sons1992)。而且，许多编码融合部分(例如GST多肽)的表达载体可商购。可将编码PSGL-1的核酸克隆入这样的表达载体，使所述融合部分按读框连接至PSGL-1蛋白。
本发明还涉及使用PSGL-1蛋白的变异体，其或者起PSGL-1激动剂(模拟剂)的作用，或者起PSGL-1拮抗剂的作用。PSGL-1蛋白变异体可通过诱变(例如不连续点突变或截短)PSGL-1蛋白产生。PSGL-1蛋白激动剂可以保留大致相同或一部分的天然形式PSG-1蛋白的生物活性。PSGL-1蛋白拮抗剂可通过例如竞争性调节PSGL-1蛋白的PSGL-1介导活性，抑制天然形式的PSGL-1蛋白的一种或多种活性。因此，可用功能受限的变异体处理激发特定的生物学作用。在一个实施方案中，用具有天然形式PSGL-1蛋白一部分生物活性的变异体治疗患者对患者的副作用比用天然形式的PSGL-1蛋白治疗要小。
在一个实施方案中，可通过筛选PSGL-1蛋白突变体(例如截短突变体)的组合文库的PSGL-1蛋白激动剂或拮抗剂活性，鉴定起PSGL-1激动剂(模拟剂)或PSGL-1拮抗剂作用的PSGL-1蛋白变异体。在一个实施方案中，通过在核酸水平组合诱变产生由多样化(variegated)基因文库编码的PSGL-1变异体多样化文库。可通过例如酶促连接合成寡核苷酸混合物至基因序列，使潜在的PSGL-1序列的简并部分可作为独立多肽表达，或者可作为其中含部分PSGL-1序列的较大融合蛋白(例如用于噬菌体文库)的一部分表达，生产PSGL-1变异体的多样化文库。有各种各样的方法可用于由简并寡核苷酸序列产生潜在PSGL-1变异体的文库。可用自动化DNA合成仪化学合成简并基因序列，然后将合成基因连接至合适的表达载体。简并部分基因的用途是可以在一个混合物中提供潜在PSGL-1序列需要部分的全部编码序列。合成简并寡核苷酸的方法是本领域已知的(参见例如Narang，S.A.(1983)Tetrahedron 393；Itakura等(1984)Annu.Rev.Biochem.53323；Itakura等(1984)Science 1981056；Ike等(1983)Nucleic Acid Res.11477)。
另外，PSGL-1蛋白编码序列片段文库可用于生产PSGL-1片段的多样化群，以筛选并随后选择PSGL-1蛋白变异体。在一个实施方案中，可通过在每一个分子仅切约1次的情况下用核酸酶处理PSGL-1编码序列的双链PCR片段、使双链DNA变性、使DNA复性形成可包括不同切口产物的有义/反义对的双链DNA、通过用S1核酸酶处理去除重新形成的双链体的单链部分，并连接所获得的片段文库至表达载体，生产编码序列片段的文库。利用该方法，可获得编码各种大小的PSGL-1蛋白的N-末端、C-末端和中间片段的表达载体。
本领域已知有几种技术筛选由点突变或截短制备的组合文库的基因产物和筛选cDNA文库中具有选定特性的基因产物。这些技术适用于快速筛选通过组合诱变PSGL-1蛋白生产的基因文库。适合高通量分析并用于筛选大基因文库的最广泛使用的技术通常包括将基因文库克隆入可复制的表达载体，用获得的载体文库转化合适的细胞，在目的活性的检测便于分离检测其产物的基因编码载体的条件下表达组合基因。递归系综诱变(recursive ensemble mutagenesis)(REM)是一种增强文库中功能性突变体频率的技术，可与鉴定PSGL-1变异体的筛选测定联合使用(Arkin和Yourvan(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA897811-7815；Delgrave等(1993)Protein Engineering 6(3)327-331)。
本发明方法还包括使用抗PSGL-1抗体和抗P-选择蛋白抗体。分离的PSGL-1蛋白或P-选择蛋白或其部分或片段，可用作免疫原，以使用标准的多克隆和单克隆抗体制备技术生产结合PSGL-1或P-选择蛋白的抗体。P-选择蛋白配体抗体描述于例如美国专利号5,852,175。P-选择蛋白特异性抗体描述于例如Kurome，T等(1994)J.Biochem.115(3)608-614。
全长PSGL-1蛋白或P-选择蛋白或其抗原性肽片段可用作免疫原(Johnston等(1989)Cell561033-1044)。PSGL-1抗原性肽包括SEQID NO2所示氨基酸序列的至少8个氨基酸残基，并包括PSGL-1表位，使针对所述肽产生的抗体与PSGL-1蛋白形成特异性免疫复合物。所述抗原肽优选包含至少10个氨基酸残基，更优选至少15个氨基酸残基，再更优选至少20个氨基酸残基，最优选至少30个氨基酸残基。
所述抗原肽包含的表位优选为位于所述蛋白表面上的PSGL-1区域，例如亲水区以及高抗原性区。
PSGL-1或P-选择蛋白免疫原通常用于制备抗体，方法是用所述免疫原免疫合适的患者(例如兔、山羊、小鼠或其它哺乳动物)。合适的免疫原性制剂可包括例如重组表达的PSGL-1蛋白或P-选择蛋白或化学合成的PSGL-1或P-选择蛋白多肽。所述制剂还可以包括佐剂，例如弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂或类似的免疫刺激剂。用免疫原性PSGL-1制剂免疫合适的患者诱导多克隆抗PAGL-1或抗P-选择蛋白抗体应答。
本文使用的术语“抗体”是指免疫球蛋白分子及其免疫活性部分，即含与抗原(例如PSGL-1或P-选择蛋白)特异性结合(免疫反应)的抗原结合位点的分子。免疫球蛋白分子的免疫活性部分的实例包括可通过用酶(例如胃蛋白酶)处理抗体产生的F(ab)和F(ab′)2片段。本发明提供结合PSGL-1分子的多克隆和单克隆抗体。本文使用的术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”是指仅含一种能够与PSGL-1特定表位免疫反应的抗原结合位点的抗体分子群。因此单克隆抗体组合物通常显示出对与其免疫反应的特定PSGL-1蛋白或P-选择蛋白的单一结合亲合性。
可如上所述，通过用PSGL-1或P-选择蛋白免疫原免疫合适的患者，制备多克隆抗PSGL-1抗体或P-选择蛋白抗体。可通过标准技术，例如使用固定PSGL-1或P-选择蛋白的酶联免疫吸附测定(ELISA)，即时监测免疫患者的抗PSGL-1抗体或P-选择蛋白抗体滴度。如果有需要，可由哺乳动物(例如血液)中分离直接抗任一种抗原的抗体分子，并再通过众所周知的技术(例如A蛋白层析)纯化，获得IgG组分。在免疫后的合适时间，例如抗体滴度最高时，由所述患者获得生产抗体的细胞，并可通过标准技术，例如由Kohler和Milstein(1975)Nature256495-497最早描述的杂交瘤技术(还参见Brown等(1981)J Immunol.127539-46；Brown等(1980)J Biol.Chem.2554980-83；Yeh等(1976)Proc.Natl.Acad.Sci.USA762927-31；和Yeh等(1982)Int.J.Cancer29269-75)、最近的人B细胞杂交瘤技术(Kozbor等(1983)Immunol Today472)、ENV-杂交瘤技术(Cole等(1985)Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.，77-96页)或三瘤技术，用其制备单克隆抗体。生产单克隆抗体杂交瘤的技术众所周知(一般参见Kenneth，R.H.载于单克隆抗体生物分析新尺度，Plenum Publishing Corp.，New York，New York(1980)；Lerner，E.A.(1981)Yale J. Biol.Med. 54387-402；Gefter，M.L.等(1977)Somatic CellGenet.3231-36)。简单地说，将无限增殖细胞系(通常为骨髓瘤)与用如上所述的免疫原免疫的哺乳动物的淋巴细胞(通常为脾细胞)融合，筛选获得的杂交瘤细胞的培养上清液，鉴定生产结合PSGL-1或P-选择蛋白的单克隆抗体的杂交瘤。
可使用众多广为人知的用于融合淋巴细胞和无限增殖细胞系的方法中的任一种生产抗PSGL-1或P-选择蛋白单克隆抗体(参见例如G.Galfre等(1977)Nature266550-52；Geffer等(1977)同上；Lerner(1981)同上；和Kenneth(1980)同上)。而且，一般技术人员就能意识到，所述方法有许多也应有用的变化。通常，无限增殖细胞系(例如骨髓瘤细胞系)来源于和淋巴细胞相同的哺乳动物物种。例如，可通过使本发明免疫制剂免疫小鼠的淋巴细胞与无限增殖小鼠细胞系融合制备鼠杂交瘤。优选的无限增殖细胞系为对含次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶的培养基(“HAT培养基”)敏感的小鼠骨髓瘤细胞系。按照标准技术，可使用众多骨髓瘤细胞系中的任一种作为融合配偶体，例如P3-NS1/1-Ag4-1、P3-x63-Ag8.653或Sp2/O-Ag14骨髓瘤细胞系。这些骨髓瘤细胞系可得自ATCC。通常，使用聚乙二醇(PEG)使HAT敏感性小鼠骨髓瘤细胞和小鼠脾细胞融合。然后使用HAT培养基选择融合产生的杂交瘤细胞，HAT培养基可杀死未融合的骨髓瘤细胞和不能复制的融合骨髓瘤细胞(未融合的脾细胞将在几天后死亡，因为它们没有转化)。通过例如使用标准ELISA测定，筛选杂交瘤培养上清液中结合PSGL-1或P-选择蛋白的抗体的情况，检测生产本发明单克隆抗体的杂交瘤细胞。
作为制备分泌单克隆抗体的杂交瘤的替代性方法，可通过分别用PSGL-1或P-选择蛋白筛选重组组合免疫球蛋白文库(例如抗体噬菌体展示文库)，由此分离出结合PSGL-1或P-选择蛋白的免疫球蛋白文库成员，鉴定和分离单克隆抗PSGL-1或抗P-选择蛋白抗体。生产和筛选噬菌体展示文库的试剂盒可商购(例如Pharmacia重组噬菌体抗体系统，目录号27-9400-01；和Stratagene SurfZAPTM噬菌体展示试剂盒，目录号240612)。另外，特别适用于生产和筛选抗体展示文库的方法和试剂的实例可见于例如Ladner等，美国专利第5,223,409号；Kang等，PCT国际公开号WO92/18619；Dower等，PCT国际公开号WO91/17271；Winter等，PCT国际公开号WO92/20791；Markland等，PCT国际公开号WO92/15679；Breitling等，PCT国际公开号WO93/01288；McCafferty等，PCT国际公开号WO92/01047；Garrard等，PCT国际公开号WO92/09690；Ladner等，PCT国际公开号WO90/02809；Fuchs等(1991)Bio/Technology 91370-1372；Hay等(1992)Hum.Antibod.Hybridomas381-85；Huse等(1989)Science2461275-1281；Griffiths等(1993)EMBO J 12725-734；Hawkins等(1992)J.Mol.Biol.226889-896；Clarkson等(1991)Nature352624-628；Gram等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA893576-3580；Garrad等(1991)Bio/Technology91373-1377；Hoogenboom等(1991)Nuc.Acid Res.194133-4137；Barbas等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 887978-7982；和McCafferty等(1990)Nature 348552-554。
另外，可使用标准重组DNA技术制备重组抗PSGL-1或抗P-选择蛋白抗体，例如同时包含人和非人部分的嵌合和人源化单克隆抗体，这些抗体也属于本发明方法的范围。可通过本领域已知的重组DNA技术，例如使用Robinson等，国际申请号PCT/US86/02269；Akira等，欧洲专利申请184,187；Taniguchi，M.，欧洲专利申请171,496；Morrison等，欧洲专利申请173,494；Neuberger等，PCT国际公开号WO86/01533；Cabilly等，美国专利号4,816,567；Cabilly等，欧洲专利申请125,023；Better等(1988)Science2401041-1043；Liu等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA843439-3443；Liu等(1987)J.Immunol.1393521-3526；Sun等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84214-218；Nishimura等(1987)Canc.Res.47999-1005；Wood等(1985)Nature314446-449；Shaw等(1988)J.Natl.Cancer Inst.801553-1559；Morrison-S.L.(1985)Science2291202-1207；Oi等(1986)BioTechniques4214；Winter美国专利5,225,539；Jones等(1986)Nature321552-525；Verhoeyan等(1988)Science2391534；和Beidler等(1988)J.Immunol.1414053-4060描述的方法生产所述嵌合和人源化单克隆抗体。
本文所述抗体可用于检测(例如细胞裂解物或细胞上清液中的)PSGL-1蛋白或P-选择蛋白，以便评价蛋白表达的丰度和模式。所述抗体例如可诊断性用于监测组织蛋白水平，作为临床试验方法的一部分，以便例如判断特定治疗方案的功效。通过偶联(即物理连接)所述抗体和可检测物质可便于检测。可检测物质的实例包括各种酶辅基、荧光物质、发光物质、生物发光物质和放射性物质。合适酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适辅基复合物的实例包括链霉抗生物素蛋白/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合适荧光物质的实例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光物质的实例包括鲁米诺；生物发光物质的实例包括荧光素酶、荧光素和水母发光蛋白，而合适放射性物质的实例包括125I、131I、35S或3H。
II.用于本发明方法的分离核酸分子SEQ ID NO1和2分别显示了分离的人PSGL-1 cDNA编码序列和人PSGL-1多肽的氨基酸序列。美国专利序号5,827,817和5,843,707也描述了PSGL-1序列，这些专利的内容通过引用结合到本文中。
本发明方法包括使用编码PSGL-1蛋白或其生物活性部分的分离核酸分子，以及足以用作鉴定PSGL-1编码核酸分子(例如PSGL-1mRNA)的杂交探针的核酸片段和用作PSGL-1核酸分子扩增或突变的PCR引物的片段。本文使用的术语“核酸分子”包括DNA分子(例如cDNA或基因组DNA)和RNA分子(例如mRNA)，以及使用核苷酸类似物产生的DNA或RNA类似物。核酸分子可以为单链或双链DNA，但优选为双链DNA。
可使用标准分子生物学技术和本文提供的序列信息分离用于本发明方法的核酸分子，例如具有SEQ ID NO1的核苷酸序列的核酸分子或其部分。使用SEQ ID NO1的全部或部分核酸序列作为杂交探针，使用标准杂交和克隆技术(例如Sambrook，J.，Fritsh，E.F.，和Maniatis，T.Molecular CloningA Laboratory Manual，第2版，ColdSpring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，NY，1989)，可分离PSGL-1核酸分子。
此外，可使用基于SEQ ID NO1序列设计的合成寡核苷酸引物，使用聚合酶链反应(PCR)分离包含全部或部分SEQ ID NO1的核酸分子。
可使用cDNA、mRNA或基因组DNA作为模板，使用合适的寡核苷酸引物，按照标准的PCR扩增技术，扩增用于本发明方法的核酸。而且，可通过标准合成技术(例如使用自动化合成仪)，制备对应于PSGL-1核苷酸序列的寡核苷酸。
在一个优选实施方案中，用于本发明方法的分离核酸分子包含示于SEQ ID NO1的核苷酸序列、示于SEQ ID NO1的核苷酸序列的互补序列或这些核苷酸序列中任一个的部分序列。与示于SEQ IDNO1的核苷酸序列互补的核酸分子是这样一种分子其与示于SEQID NO1的核苷酸序列足够互补，使其可与示于SEQ ID NO1的核苷酸序列杂交，由此形成稳定双链体。
在再另一个优选的实施方案中，用于本发明方法的分离核酸分子包含与示于SEQ ID NO1的全长核苷酸序列至少约为55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高相同的核苷酸序列或这些序列任一个的一部分。
而且，用于本发明方法的核酸分子可仅包含SEQ ID NO1核酸序列的一部分，例如可用作探针或引物的片段或编码部分PSGL-1蛋白(如PSGL-1蛋白的生物活性部分)的片段。所述探针/引物通常包含大致纯化的寡核苷酸。所述寡核苷酸通常包含这样的核苷酸序列区域在严格条件下，其与SEQ ID NO1的有义序列、反义序列或天然等位基因变异体或突变体的至少约12或15，优选约20或25，更优选约30、35、40、45、50、55、60、65或75个连续核苷酸杂交。在一个实施方案中，用于本发明方法的核酸分子含有的核苷酸序列长度超过100、100-200、200-300、300-400、400-500、500-600、600-700、700-800、800-900、900-1000、1000-1100、1100-1200、1200-1300、1300-1400、1400-1500、1500-1600或更多的核苷酸，并在严格杂交条件下与SEQ ID NO1的核酸分子杂交。
本文使用的术语“在严格条件下杂交”用于描述杂交和洗涤条件，在该条件下，互相之间显著相同或同源的核苷酸序列相互杂交。所述条件使互相之间优选至少约70％、更优选至少约80％、再更优选至少约85％或90％相同的序列相互杂交。这样的严格条件是本领域技术人员熟知的，可见于Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel等编辑，John Wiley&Sons，Inc.(1995)的第2、4和6节。其它的严格条件可见于Molecular CloningA Laboratory Manual，Sambrook等，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY(1989)的第7、9和11章。严格杂交条件的优选非限制性实例包括在4X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中于约65-70℃杂交(或在4X SSC加50％甲酰胺中于约42-50℃杂交)，然后以1X SSC于约65-70℃洗涤1次或数次。高严格杂交条件的优选非限制性实例包括在1X SSC中于约65-70℃杂交(或在1X SSC加50％甲酰胺中于约42-50℃杂交)，然后以0.3XSSC于约65-70℃洗涤1次或数次。还原性严格杂交条件的优选非限制性实例包括在4X SSC中于约50-60℃杂交(或在6X SSC加50％甲酰胺中于约40-45℃杂交)，然后以2X SSC于约50-60℃洗涤1次或数次。本发明还包括介于以上提及的值(例如于65-70℃或42-50℃)之间的中间值。SSPE(1xSSPE为0.15M NaCl、10mM NaH2PO4和1.25mM EDTA，pH7.4)可代替杂交和洗涤缓冲液中的SSC(1xSSC为0.15M NaCl和15mM柠檬酸钠)；杂交完成后进行洗涤，每次15分钟。预计长度小于50个碱基对的杂交物的杂交温度应比杂交物的解链温度(Tm)低5-10℃，其中Tm按照以下方程确定。对于长度小于18个碱基对的杂交物，Tm(℃)＝2(A+T碱基的数量)+4(G+C碱基的数量)。对于长度在18-49个碱基对之间的杂交物，Tm(℃)＝81.5+16.6(log10[Na+])+0.41(％G+C)-(600/N)，其中N是杂交物中碱基的数量，而[Na+]是杂交缓冲液中钠离子的浓度(1xSSC的[Na+]＝0.165M)。熟练操作者还应认识到，可向杂交和/或洗涤缓冲液中加入其它试剂，以降低核酸分子与膜(例如硝酸纤维素膜和尼龙膜)的非特异性杂交，所述试剂包括但不限于封闭剂(例如BSA、鲑鱼或鲱鱼精载体DNA)、去污剂(例如SDS)、鳌合剂(例如EDTA)、Ficoll、PVP等。具体地说，当使用尼龙膜时，严格杂交条件的其它优选非限制性实例为在0.25-0.5M NaH2PO4、7％SDS中于约65℃杂交，接着用0.02M NaH2PO4、1％SDS于65℃洗涤1次或数次，参见例如Church和Gilbert(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA811991-1995，(或0.2X SSC、1％SDS)。
在严格条件下与SEQ ID NO1的序列杂交的本发明分离核酸分子优选对应于天然核酸分子。本文使用的“天然”核酸分子是指具有天然存在的核苷酸序列(例如编码天然蛋白)的RNA或DNA分子。
在优选实施方案中，所述探针还包含与其连接的标记基团，例如，所述标记基团可以是放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子。所述探针可用作诊断测试试剂盒的一部分，例如通过检测患者细胞样品中编码PSGL-1的核酸的水平，如检测PSGL-1 mRNA水平或测定基因组PSGL-1基因是否突变或缺失，鉴定异常表达PSGL-1蛋白的细胞或组织。
本发明的方法可使用人PSGL-1蛋白的非人直向同源物。人PSGL-1蛋白的直向同源物为分离自非人生物并具有相同PSGL-1活性的蛋白。
本发明方法还包括使用含SEQ ID NO1核苷酸序列或其引入突变的部分的核酸分子。突变可导致“非必需”氨基酸残基或“必需”氨基酸残基的氨基酸取代。“非必需”氨基酸残基是野生型PSGL-1序列(例如SEQ ID NO2的序列)中可改变而不改变生物活性的残基，而“必需”氨基酸残基是生物活性必须的。例如，能够与P-选择蛋白互作或能够抑制P-选择蛋白介导的细胞粘附或细胞迁移的片段所包含的氨基酸残基不大可能适于改变。
可通过标准技术(例如定点诱变或PCR介导诱变)将突变引入到SEQ ID NO1中。优选对一个或多个预测非必须氨基酸残基进行保守氨基酸取代。“保守氨基酸取代”是指氨基酸残基由具有相似侧链的氨基酸残基替换。本领域已定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括碱性侧链氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸)、不带电极性侧链氨基酸(例如天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链氨基酸(例如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-支链侧链氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，PSGL-1中的预测非必需氨基酸残基优选由相同侧链家族的另一个氨基酸残基替换。或者，在另一个实施方案中，例如通过饱和诱变，可顺着全部或部分PSGL-1编码序列将突变随机引入，并可筛选所获突变体的PSGL-1生物活性，以鉴定保留活性的突变体。在诱变SEQ ID NO1之后，可重组表达编码蛋白，并可使用本文描述的测定测定蛋白活性。
已知本文公开的PSGL-1编码序列的编码链，则可按照Watson和Crick碱基配对原则设计本发明的反义核酸。所述反义核酸分子可与PSGL-1 mRNA的完整编码区互补，但更优选为与PSGL-1 mRNA的仅一部分编码或非编码区反义的寡核苷酸。例如，所述反义寡核苷酸可与PSGL-1 mRNA翻译起始位点周围的区域互补。反义寡核苷酸长度可为例如约5、10、1 5、20、25、30、35、40、45或50个核苷酸。本发明的反义核酸可使用化学合成构建，并使用本领域已知的方法酶连反应。例如，可使用天然核苷酸或用来增加分子生物稳定性或增加反义和有义核酸形成的双链体的物理稳定性的各种修饰核苷酸化学合成反义核酸(例如反义寡核苷酸)，例如可以使用硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸。可用于产生所述反义核酸的修饰核苷酸的实例包括5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧羟甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿核苷、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖Q核苷(beta-D-galactosylqueosine)、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖Q核苷(beta-D-mannossylqueosine)、5′-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲基硫代-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、wybutoxosine、假尿嘧啶、Q核苷(queosine)、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶、(acp3)w和2，6-二氨基嘌呤。或者，可使用核酸以反义方向亚克隆入其中的表达载体生物生产反义核酸(即由插入核酸转录的RNA为目的靶核酸的反义方向，下一小节进一步详述)。
在再另一个实施方案中，用于本发明方法的PSGL-1核酸分子可在碱基部分、糖部分或磷酸主链进行修改，以提升分子的例如稳定性、杂交能力或溶解性。例如，可修饰核酸分子的脱氧核糖磷酸主链，以产生肽核酸(参见Hyrup B等(1996)Bioorganic&MedicinalChemistry4(1)5-23)。本文使用的术语“肽核酸”或“PNA”是指其中脱氧核糖磷酸主链由假肽主链取代并仅保留四种天然核碱基的核酸模拟物，例如DNA模拟物。已经表明，PNA的中性主链允许在低离子强度条件下与DNA和RNA特异性杂交。可使用Hyrup B等(1996)同上；Perry-O′Keefe等(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.9314670-675描述的标准固相肽合成方法进行PNA寡聚物合成。
PSGL-1核酸分子的PNA可用于本文所述的治疗和诊断用途。例如，PNA可通过例如诱导转录或翻译中止或抑制复制，用作序列特异性调节基因表达的反义或反基因药物。PSGL-1核酸分子的PNA还可用于分析基因中的单碱基对突变(例如通过PNA定点型PCR锁止法(PNA-directed PCR clamping))；当与其它酶(例如S1核酸酶(HyrupB等(1996)同上))联合使用时用作‘人工限制酶’；或用作DNA测序或杂交的探针或引物(Hyrup B等(1996)同上；Perry-O′Keefe等(1996)同上)。
在另一个实施方案中，可通过连接亲脂或其它辅助基团至PNA、形成PNA-DNA嵌合体或使用脂质体或本领域已知的其它药物传递技术修饰PSGL-1的PNA，(例如增强其稳定性或细胞吸收)。例如，可生产PSGL-1核酸分子的PNA-DNA嵌合体，其兼具PNA和DNA的优势特性。这样的嵌合体可使DNA识别酶(例如RNA酶H和DNA聚合酶)与DNA部分互作，而PNA部分将提供高结合亲合性和特异性。可使用根据碱基堆积、核碱基之间的键数量和方向选择的合适长度的连接体连接PNA-DNA嵌合体(Hyrup B等(1996)同上)。可如Hyrup B等(1996)同上和Finn P.J.等(1996)Nucleic Acids Res.24(17)3357-63所述合成PNA-DNA嵌合体。例如，可使用标准亚磷酰胺偶联化学法在固相支持体上合成DNA链，并可在PNA和DNA5′末端之间使用修饰的核苷酸类似物，例如5′-(4-甲氧基三苯甲基)氨基-5′-脱氧-胸腺嘧啶亚磷酰胺(Mag，M.等(1989)Nucleic Acids Res.175973-88)。PNA单体然后以逐个方式偶联，产生具有5′PNA节段和3′DNA节段的嵌合分子(Finn P.J.等(1996)同上)。或者，可用5′PNA节段和3′DNA节段合成嵌合分子(Peterser，K.H.等(1975)BioorganieMed.Chem.Lett.51119-11124)。
在另一个实施方案中，用于本发明方法的寡核苷酸可包括其它附加基团，例如肽(如用于体内靶向宿主细胞受体)或便于穿过细胞膜(参见例如Letsinger等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA866553-6556；Lemaitre等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84648-652；PCT公开号WO88/09810)或血脑屏障(参见例如PCT公开号WO89/10134)转运的物质。另外，可用杂交-引发裂解剂(参见例如Krol等(1988)Bio-Techniques6958-976)或插入剂(参见例如Zon(1988)Pharm.Res.5539-549)修饰寡核苷酸。为此，可将寡核苷酸与另一个分子(例如肽、杂交引发交联剂、转运剂或杂交引发裂解剂)缀合。
可通过表达其中全长序列部分已缺失或改变的修饰DNA，制备编码用于本发明方法的P-选择蛋白配体蛋白的其它片段或改变形式的DNA。可使P-选择蛋白配体蛋白序列大量缺失，同时保留P-选择蛋白配体蛋白活性。例如，含SEQ ID NO2的氨基酸42至氨基酸189的序列、SEQ ID NO2的氨基酸42至氨基酸118的序列或SEQID NO2的氨基酸42至氨基酸89的序列的P-选择蛋白配体蛋白每个都保留了P-选择蛋白结合活性和结合E-选择蛋白的能力。其中一个或多个N-联糖基化位点(例如SEQ ID NO2的氨基酸65、111和292的位点)已改变为其它氨基酸或缺失的P-选择蛋白配体蛋白也保留了P-选择蛋白结合活性和结合E-选择蛋白的能力。含SEQ ID NO2的氨基酸42至氨基酸60(包含SEQ ID NO2的氨基酸45至氨基酸58的蛋白高阴离子区)的P-选择蛋白配体蛋白也保有P-选择蛋白配体蛋白活性，但该序列限定的P-选择蛋白配体蛋白不结合E-选择蛋白。优选P-选择蛋白配体蛋白保留至少一个(更优选至少两个或最优选全部三个)位于SEQ ID NO2的氨基酸46、48和51的酪氨酸残基，这些残基的硫酸化可影响P-选择蛋白配体蛋白活性。可按照本领域技术人员已知的方法构建编码这些P-选择蛋白配体蛋白和其它活性片段或改变形式的DNA。
用于本发明方法的分离DNA可与表达控制序列(例如Kaufinan等，Nucleic Acid Res.19，4485-4490(1991)公开的pMT2或pED表达载体)有效连接，以便重组生产P-选择蛋白配体。本领域已知许多合适的表达控制序列。表达重组蛋白的一般方法也是已知的，其实例参见R.Kaufman，Methods in Enzymology.185，537-566(1990)。本文定义的“有效连接”是指酶连接或化学连接，以在本发明的分离DNA和表达控制序列之间形成共价键，以此方式由用连接的DNA/表达控制序列转化(转染)的宿主细胞表达P-选择蛋白配体蛋白。
已知几种内切蛋白水解酶在成对氨基酸序列的羧基侧切割前体肽(例如-Lys-Arg-和-Arg-Arg-)，以产生成熟蛋白。这些酶一般称为成对碱性氨基酸转化酶或PACE，其在重组生产成熟肽中的用途在WO92/09698和美国申请序号07/885,972中详尽公开，这两个文献都通过引用结合到本文中。PACE家族酶已知增加重组宿主细胞中前体多肽蛋白水解加工的效率。在某些实施方案中，本发明的P-选择蛋白配体蛋白包含这样的PACE切割位点。
可由含本文所述的任何可溶性P-选择蛋白配体蛋白编码DNA序列和WO92/09698与美国申请序号07/885,972(通过引用结合到本文中)描述的PACE编码DNA序列的宿主细胞生产用于本发明方法的可溶性成熟P-选择蛋白配体蛋白。这样的宿主细胞可含有由分别含可溶性P-选择蛋白配体蛋白DNA和PACE DNA的单独表达载体共转化或序贯转化产生的DNA。编码3/4FT的第三个DNA也可以与P-选择蛋白配体蛋白和PACE编码DNA共转化。或者，宿主细胞可包含由同时含有可溶性P-选择蛋白配体蛋白DNA和PACE DNA的单个表达载体转化而产生的DNA。所述表达载体的构建在分子生物学普通技术人员的水平之内。共转化和转化的方法也是已知的。
许多PACE编码DNA序列是已知的。例如，A.M.W.van denOuweland等，Nucl.Acids Res.18，664(1990)公开了一种称为弗林蛋白酶(furin)的PACE的编码DNA，该文献通过引用结合到本文中。可溶形式的PACE的编码eDNA称为PACESOL。还存在其它形式PACE的编码DNA，可使用任何所述PACE编码DNA生产本发明的可溶性成熟P-选择蛋白配体蛋白，只要所述PACE能够切割P-选择蛋白配体蛋白的氨基酸38-41。可溶形式PACE的编码DNA优选用于生产本发明的可溶性成熟P-选择蛋白配体蛋白。
编码可溶形式P-选择蛋白配体蛋白和PACE的DNA可单独或一起有效连接至例如以上论述的pMT2或pED表达载体中含有的表达控制序列，以便重组生产PACE切割的可溶性P-选择蛋白配体。其它合适的表达控制序列也是本领域已知的。
III.用于本发明方法的重组表达载体和宿主细胞本发明方法(例如本文描述的筛选测定)包括使用含PSGL-1蛋白(或其部分)的编码核酸的载体，优选为表达载体。本文使用的术语“载体”是指能够转运与其连接的另一种核酸的核酸分子。一类载体是“质粒”，是指另外的DNA节段可连入其中的环形双链DNA环。另一类载体是病毒载体，其中另外的DNA节段可连入病毒基因组。某些载体能够在其导入的宿主细胞中自发复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体和游离型哺乳动物载体)。其它载体(例如非游离型哺乳动物载体)在导入宿主细胞时整合入宿主细胞基因组，由此和宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够控制与其有效连接的基因表达。所述载体本文称为“表达载体”。一般来说，重组DNA技术中应用的表达载体通常为质粒形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可交互使用，因为质粒是最常使用形式的载体。但是，本发明包括起相同功能的所述其它形式的表达载体，例如病毒载体(例如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)。
用于本发明方法的重组表达载体包含的本发明核酸其形式适于在宿主细胞中表达，这意味着所述重组表达载体包含一个或多个根据用于表达的宿主细胞选择的调节序列，其与要表达的核酸序列有效连接。对于重组表达载体，“有效连接”意指目的核苷酸序列以其可表达的形式(例如在体外转录/翻译系统中或当载体导入宿主细胞中时在宿主细胞中)与一个或多个调节序列连接。术语“调节序列”包括启动子、增强子和其它表达控制元件(例如聚腺苷酸化信号)。这样的调节序列描述于例如Goeddel(1990)Methods Enzymol.1853-7。调节序列包括在许多类型的宿主细胞中控制核苷酸序列组成型表达的序列以及仅在某些宿主细胞中控制核苷酸序列表达的序列(例如组织特异性调节序列)。本领域技术人员会意识到可根据以下因素设计表达载体转化宿主细胞的选择、需要的蛋白表达水平等。本发明的表达载体可导入宿主细胞中，由此生产由本文所述核酸编码的蛋白或肽，包括融合蛋白或肽(例如PSGL-1蛋白、突变形式的PSGL-1蛋白、融合蛋白等)。
用于本发明方法的重组表达载体可用来在原核细胞或真核细胞中表达P-选择蛋白配体蛋白。例如，可在细菌细胞(如大肠杆菌)、昆虫细胞(使用杆状病毒表达载体)、酵母细胞或哺乳动物细胞中表达PSGL-1蛋白。Goeddel(1990)同上也讨论了适合的宿主细胞。或者，所述重组表达载体可体内转录和翻译，例如使用T7启动子调节序列和T7聚合酶。
以原核细胞表达蛋白最常用载体在大肠杆菌中进行，其中所述载体含控制融合或非融合蛋白表达的组成型或诱导型启动子。融合载体向其编码蛋白中加入许多氨基酸，通常加入到重组蛋白的氨基末端。所述融合载体通常有三个目的1)增加重组蛋白的表达；2)增加重组蛋白的溶解性；和3)有助于通过在亲和层析中作为配体纯化重组蛋白。通常，在融合表达载体中，在融合部分和重组蛋白的接合处引入蛋白酶切割位点，以能够在纯化融合蛋白后分离融合部分和重组蛋白。所述酶及其关连识别序列包括Xa因子、凝血酶和肠激酶。典型的融合表达载体包括pGEX(Pharmacia Biotech Inc；Smith，D.B.和Johnson，K.S.(1988)Gene6731-40)、pMAL(New England Biolabs，Beverly，MA)和pRIT5(Pharmacia，Piscataway，NJ)，它们分别使谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白或A蛋白与靶重组蛋白融合。
纯化的融合蛋白可用于PSGL-1活性测定(例如以下详述的直接测定或竞争性测定)或用于生产PSGL-1蛋白特异性抗体。
在另一个实施方案中，使用哺乳动物表达载体在哺乳动物细胞中表达本发明核酸。哺乳动物表达载体的实例包括pCDM8(Seed，B.(1987)Nature329840)和pMT2PC(Kauftnan等(1987)EMBO J.6187-195)。当在哺乳动物中使用时，表达载体的控制功能经常由病毒调节元件提供。例如，通常使用的启动子来源于多瘤病毒、腺病毒2、巨细胞病毒和猿猴病毒40。关于其它同时适用于原核细胞和真核细胞的表达系统，参见Sambrook，J.等，Molecular CloningA LaboratoryManual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989中的第16章和第17章。
在另一个实施方案中，重组哺乳动物表达载体能够控制核酸优先在特定细胞类型中表达(例如使用组织特异性调节元件表达所述核酸)。
本发明方法还可使用含本发明DNA分子的重组表达载体，其中所述本发明DNA分子以反义方向克隆入表达载体。即，所述DNA分子以允许与PSGL-1 mRNA反义的RNA分子表达(通过DNA分子转录)的方式与调节序列有效连接。可以选择控制所述反义RNA分子在各种细胞类型中连续表达的调节序列，例如病毒启动子和/或增强子，其与以反义方向克隆的核酸有效连接，或者可选择控制反义RNA组成型表达、组织特异性表达或细胞类型特异性表达的调节序列。反义表达载体可以为重组质粒、噬菌粒或减毒病毒形式，其中反义核酸在高效调节区控制下生产，其活性可根据导入载体的细胞类型确定。关于使用反义基因调节基因表达的论述，参见Weintraub，H.等，反义RNA作为遗传分析的分子工具，Reviews-Trends in Genetics，1(1)卷1986。
本发明另一方面涉及使用本发明的PSGL-1核酸分子导入其中的宿主细胞，例如重组表达载体含有的PSGL-1核酸分子或允许其同源重组入宿主细胞特定位点含PSGL-1核酸分子的序列。术语“宿主细胞”或“重组宿主细胞”在本文交互使用。应当理解，所述术语不仅指特定的题述细胞，而且指该细胞的后代或潜在后代。因为在传代过程中由于突变或环境影响可能发生某些变化，这样的后代实际上可能与母细胞不一样，但仍包括在本文使用的该术语范围内。
宿主细胞可以为任何原核细胞或真核细胞，例如PSGL-1蛋白可以在细菌细胞(例如大肠杆菌)、昆虫细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞(例如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或COS细胞)中表达。其它合适的宿主细胞是本领域技术人员已知的。
许多类型的细胞都可作为适于表达P-选择蛋白配体蛋白的宿主细胞。适合的宿主细胞能够连上功能性P-选择蛋白配体蛋白特有的碳水化合物侧链。这种能力可借助于宿主细胞中存在的合适的糖基化酶产生，无论所述糖基化酶是天然存在、化学诱变诱导产生还是用合适的表达质粒(含所述糖基化酶编码DNA序列)转染宿主细胞获得。宿主细胞包括例如猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、人肾293细胞、人表皮A431细胞、人Colo205细胞、3T3细胞、CV-1细胞、其它转化的灵长类细胞系、正常二倍体细胞、衍生于原代组织体外培养物的细胞株、原代移植物、Hela细胞、小鼠L细胞、BHK、HL-60、U937或Hak细胞。
还可以通过将本发明的分离DNA和一个或多个合适糖基化酶的编码DNA与一个或多个昆虫表达载体中的合适控制序列有效连接，并使用昆虫表达系统，生产P-选择蛋白配体蛋白。用于杆状病毒/昆虫细胞表达系统的材料和方法可以试剂盒的形式由例如Invitrogen，SanDigeo，California，U.S.A.商购(MaxBac试剂盒)，并且所述方法在本领域众所周知，描述于例如Summers和SmithTexas AgriculturalExperiment station Bulletin，No.1555(1987)，该文献通过引用结合到本文中。还可以使用上述合适的分离DNA在昆虫细胞中生产可溶形式的P-选择蛋白配体蛋白。一种PACE的编码DNA还可在昆虫宿主细胞中共表达，以生产PACE切割形式的P-选择蛋白配体蛋白。
或者，可以在低等真核细胞(例如酵母)或在原核细胞(例如细菌)中生产P-选择蛋白配体蛋白。潜在合适的酵母菌株包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、克鲁维酵母菌属菌株(Kluyveromyces)、假丝酵母菌属(Candida)或任何能够表达异源蛋白的酵母菌株。潜在合适的细菌菌株包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)或任何能够表达异源蛋白的细菌菌株。如果用酵母或细菌生产P-选择蛋白配体蛋白，则必须将合适的碳水化合物共价连接至蛋白部分上的合适部位，以便获得糖基化P-选择蛋白配体蛋白。这样的共价连接可使用已知的化学或酶法实现。
可通过常规转化或转染技术将载体DNA引入到原核或真核细胞中。本文使用的术语“转化”或“转染”意指本领域公知的各种将外源核酸(例如DNA)导入宿主细胞中的技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质体转染或电穿孔。合适的转化或转染宿主细胞的方法可见于Sambrook等(Molecular CloningA Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989)和其它实验室指南。
用于本发明方法的宿主细胞，例如培养的原核或真核宿主细胞，可用于生产(即表达)PSGL-1蛋白。因此，本发明还提供使用本发明宿主细胞生产PSGL-1蛋白的方法。在一个实施方案中，所述方法包括在合适的培养基中培养本发明宿主细胞(编码PSGL-1蛋白的重组表达载体已导入其中)，以生产PSGL-1蛋白。在另一个实施方案中，所述方法还包括由培养基或宿主细胞中分离PSGL-1蛋白。
IV.使用方法本发明同时提供治疗、预防或减轻有缺血性疾病和/或再灌注损伤(包括中风)风险或易患此类疾病的患者(例如人)组织损伤的预防和治疗方法。关于治疗的预防和治疗方法，所述治疗可根据由药物基因组领域获得的知识特别调整或修改。本文使用的“治疗”定义为以治疗、治愈、缓解、减轻、变更、减轻、改善、改进或影响疾病、症状或素因为目的，向患病、症状或素因的患者施用或给予治疗药物，或向其离体组织或细胞系施用或给予治疗药物。
本文使用的“药物基因组”是指对临床开发或上市药物使用基因组技术，例如基因测序、统计遗传学和基因表达分析。更具体地说，该术语指研究患者基因如何决定其对药物的反应(例如患者的“药物反应表型”或“药物反应基因型”)。
因此，本发明另一方面提供按照个体的药物反应基因型，对患者的预防或治疗性治疗(治疗采用本发明的P-选择蛋白拮抗剂或P-选择蛋白配体调节剂)进行个体化的方法。药物基因组学使临床医生或医师可将诊断或治疗性治疗定位于将由该治疗获得最大利益的患者，并避免治疗患者遭受毒性药物相关的副作用。
A.预防和治疗方法P-选择蛋白具有几个与血管损伤和血栓形成有关的功能，包括介导白细胞在血管内皮上滚动；促进血小板与白细胞互相作用，导致白细胞活化，并由这些活化细胞释放组织因子丰富的微粒或释放促炎介导物，进一步活化内皮细胞，促使更多白细胞捕获；捕获凝块和内皮上的白细胞源微粒，促进凝块增长；以及堵塞微血管，扩大了缺血区域。P-选择蛋白特异性抑制剂与其配体PSGL-1相互作用，预期将明显减少这些事件。对于rPSGL-Ig，该可溶性配体构建物预计结合内皮细胞和血小板上表达的P-选择蛋白，因此降低白细胞或白细胞源微粒表面上的天然PSGL-1的结合能力。在导致P-选择蛋白/PSGL-1相互作用增加的情况下，rPSGL-Ig存在的作用就是减轻炎症和血栓形成反应。
抑制P-选择蛋白/PSGL-1相互作用对血栓性中风特别有用。用rPSGL-Ig减少活化血小板/白细胞复合物的形成通过减少由于P-选择蛋白/PSGL-1相互作用形成的血小板/白细胞复合物引起的血管堵塞，可提升血管堵塞下游的微血管流量。这可减小脑栓塞增长，因此减轻长期脑损伤的程度。纤溶剂治疗限于中风初始临床症状后的3小时，这主要是因为出血的风险较高，且对较长的中风后阶段没有明显的疗效。因为rPSGL-Ig没有明显促进出血趋势，但可通过其对组织因子途径和凝块增加的作用促进溶解提升，所以rPSGL-Ig与纤溶剂组合治疗可能有利于加速溶解反应。另外，通过减小白细胞/内皮细胞滚动，rPSGL-Ig可减轻凝块溶解后的再灌注损伤程度，因此明显减小梗塞面积。最后，中风后的脑水肿可能是缓慢发展的血管炎症事件的结果，这些事件由选择蛋白介导，并导致微血管完整性损坏。rPSGL-Ig通过抑制这些长期事件可减缓出现水肿的趋势。水肿减轻可明显降低与血栓性中风相关的患病率和死亡率。
使用rPSGL-Ig还可能有利于治疗出血性中风患者。与rPSGL-Ig相关的出血少至无应使早期给药的中风患者相对安全。已知出血通过由激活血细胞和/或凝结途径释放的炎症介导物(包括血清素、凝血酶和白三烯C4)，促进组织炎症。这些药物已知促进血小板和内皮细胞上的P-选择蛋白表达。通过用选择蛋白拮抗剂进行早期干预降低这些次级炎症反应，可以证明对减轻与出血性中风相关的患病率和死亡率非常有效。
一方面，本发明提供一种方法通过给予患者一种组合物，调节(例如治疗、预防或减轻)所述患者由缺血(例如中风)后再灌注损伤引起的器官或组织损伤(例如脑损伤)，其中所述组合物包含调节PSGL-1表达或PSGL-1活性(例如调节P-选择蛋白或E-选择蛋白结合、调节细胞粘附(例如大脑中的细胞与细胞粘附，如白细胞-内皮细胞粘附和白细胞-血小板粘附)和细胞(例如白细胞)与血管的粘附以及调节例如大脑小静脉中白细胞滚动)的物质。可通过例如本文描述的或本领域技术人员已知的诊断或预后测定中的任一种或组合鉴别有缺血和/或再灌注损伤风险的患者。
将患者置于由缺血和再灌注引起的组织或器官损伤风险之中并使其成为本发明P-选择蛋白拮抗剂治疗目标的缺血性疾病包括例如中风、肠系膜及外周血管疾病、器官移植、循环休克和血栓形成疾病，如血栓栓塞、深静脉血栓形成、肺栓塞、中风、心肌梗塞、流产、与抗凝血酶III缺乏、C蛋白缺乏、S蛋白缺乏、抗活性C蛋白相关的血栓形成倾向、血纤维蛋白原异常、纤溶病、高胱氨酸尿、妊娠、炎症、骨髓增生性疾病、动脉硬化、心绞痛(如不稳定型心绞痛)、弥散性血管内凝血、血栓性血小板减少性紫癜、癌转移、镰状细胞病和肾小球肾炎。
可在再灌注前给予预防或治疗剂，例如P-选择蛋白配体分子或其具有P-选择蛋白配体活性的片段(如可溶性PSGL-1或可溶性重组PSGL融合蛋白(例如rPSGL-Ig))、抗P-选择蛋白抗体或其生物活性片段、或抗P-选择蛋白配体抗体或其生物活性片段，使组织和器官(如脑)损伤和梗塞体积受到抑制或减轻。
给予患者P-选择蛋白拮抗剂(例如抗P-选择蛋白抗体、抗P-选择蛋白配体抗体、可溶性P-选择蛋白配体、可溶性PSGL-1或其片段、或可溶性rPSGL-Ig)以治疗、预防或减轻缺血和/或再灌注后的器官或组织损伤的方法包括但不限于以下方法。
给予患者的本发明可溶性P-选择蛋白拮抗剂为适于所述给予的药用组合物形式。所述组合物通常包含有效量的活性药物(例如蛋白或抗体)和药用载体。本文使用的词语“药用载体”包括任何和所有与药物给予相容的溶剂、分散介质、包衣剂、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。这些介质和物质对药用活性物质的用途本领域众所周知。除非任一常规介质或物质与活性药物不相容，否则还考虑其在组合物中的用途。组合物中还可以加入其它活性化合物。
用于本发明治疗方法的药用组合物要配制得与其要给予的途径相匹配。
给药途径的实例包括胃肠外(例如静脉、皮内、皮下)、口服(例如吸入)、经皮(局部)、粘膜和直肠给药。用于胃肠外、皮内或皮下给药的溶液或悬浮液可包含以下组分无菌稀释剂，例如注射用水、盐溶液、不挥发性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗菌剂，例如苄醇或羟苯甲酸甲酯；抗氧化剂，例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，例如乙二胺四乙酸；缓冲剂，例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及调节渗透压的物质，例如氯化钠和葡萄糖。pH可用酸或碱调节，例如盐酸或氢氧化钠。胃肠外制剂可封装入安瓿、一次性注射器或玻璃或塑料制的多剂量小瓶。
适于注射用的药用组合物包括无菌水溶液(水溶性的)或分散剂和用无菌可注射溶液或分散剂即时配制的无菌粉剂。对于静脉内给药，适合的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor ELTTM(BASF，Parsippany，NJ)或磷酸缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，所述组合物必须无菌，并应当是达到易注射程度的液体。其在生产和储存条件下必须稳定，必须防腐以防微生物(例如细菌和真菌)污染。所述载体可以是包括例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液态聚乙二醇等)的溶剂或分散介质及其合适混合物。例如通过使用包衣剂(例如卵磷脂)、在分散剂情况下通过维持需要的颗粒大小和通过使用表面活性剂，可以维持适宜的流动性。可通过各种抗菌剂和抗真菌剂(例如羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等)达到防止微生物的作用。在许多情况下，组合物中优选包括等渗剂，例如糖、多元醇(如甘露醇、山梨糖醇)和氯化钠。组合物中包含延迟吸收物质(如一硬脂酸铝和明胶)可使注射性组合物的延长吸收。
可通过在合适溶剂中加入需要量的调节PSGL-1活性的药物(例如可溶性PSGL-1蛋白片段)以及根据需要加入上述成分中的一种或组合，然后除菌过滤，制备无菌注射溶液。一般来说，通过在含有基本分散介质和需要的上述其它成分的无菌溶媒中加入活性化合物制备分散剂。对于用于制备无菌注射溶液的无菌粉剂，优选的制备方法是真空干燥和冻干，由其先前除菌过滤溶液产生活性成分以及任何其它所需成分的粉末。
口服组合物一般包括惰性稀释剂或可食用的载体。它们可以封装入明胶胶囊或压成片剂。为口服治疗给药，活性化合物可加入赋形剂，并以片剂、锭剂、胶囊形式使用。还可以使用液态载体制备用作漱口药的口服组合物，其中在液态载体中的化合物口用嗽口，然后吐出或吞咽。可包含药学上相容的结合剂和/或佐剂物质作为所述组合物的一部分。片剂、丸剂、胶囊、锭剂等可包含任何以下组分或类似性质的化合物结合剂，例如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂，例如淀粉或乳糖；崩解剂，例如褐藻酸、Primogel或玉米淀粉；润滑剂，如硬脂酸镁或Sterotes；助流剂，例如胶质二氧化硅；甜味剂，例如蔗糖或糖精；或调味剂，例如薄荷油、水杨酸甲酯或橙味调味剂。
对于吸入给药，由含合适喷射剂(例如二氧化碳之类的气体)的压力容器或分配器或喷雾器传递气溶胶喷物形式的所述化合物。
还可以通过经粘膜或经皮方法全身给药。对于经粘膜或经皮给药，在制剂中使用适于穿透屏障的渗透剂。这样的渗透剂一般是本领域已知的，包括例如用于经粘膜给药的去污剂、胆汁酸盐和梭链孢酸衍生物。经粘膜给药可通过使用鼻喷雾剂或栓剂实现。对于经皮给药，可将活性化合物配制为本领域周知的软膏剂、油膏剂、凝胶剂或乳膏剂。
还可以制备栓剂(例如用常规栓剂基质，例如可可油和其它甘油酯)或保留灌肠形式的调节PSGL-1活性的药物，用于直肠传递。
在一个实施方案中，用保护化合物免从机体快速清除的载体制备调节PSGL-1活性的药物，例如控释制剂，包括植入剂和微囊化传递系统。可以使用生物可降解、生物可相容聚合物，例如乙烯基乙二酸二乙酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。制备这些制剂的方法对本领域技术人员来说是显而易见的。这些物质也可以由Alza Corporation和Nova Pharmaceuticals，Inc.商购。也可以使用脂质体悬浮液(包括用抗病毒抗原单克隆抗体的靶向感染细胞的脂质体)作为药用载体。这些物质可按照本领域技术人员已知的方法制备，例如美国专利第4,522,811号描述的方法。
配制单位剂量形式的口服或胃肠外组合物特别有利，因为易于给予且剂量均一。本文使用的单位剂量形式是指适于作为要治疗患者单一剂量的物理分散单位；每单位包含预定量的活性化合物，目的在于产生与需要的药用载体相关的理想疗效。PSGL-1活性调节药物的独有特征和要达到的特定疗效以及本领域配制所述患者治疗药物的固有限制决定并直接决定了本发明剂量单位形式的规格。
可通过标准药学细胞培养或实验室动物方法测定所述药物的毒性和疗效，例如，测定LD50(群体50％致死的剂量)和ED50(群体50％治疗有效的剂量)。毒性和疗效之间的剂量比率是治疗指数，可表示为LD50/ED50比率。优选治疗指数大的药物。尽管可使用具有毒副作用的药物，但应小心设计将所述药物靶向染病组织部位的传递系统，以便使对未感染细胞的潜在损伤最小，由此降低副作用。
由细胞培养测定和动物研究获得的数据可用于配制一系列人用剂量。所述PSGL-1调节药物的剂量优选处于循环浓度(包含ED50但几乎没有或没有毒性)范围内。剂量可根据使用的剂型和使用的给药途径在此范围内变化。对于用于本发明治疗方法的任一药物，开始可由细胞培养测定评价治疗有效剂量。可根据细胞培养的测定，用动物模型配制达到循环血浆浓度范围(包含IC50，即测试化合物浓度达到症状最大抑制的一半)的剂量。此信息可用于更精确地测定人中的有效剂量。例如可通过高效液相层析检测血浆水平。
本文定义的蛋白或多肽的治疗有效量(即有效剂量)范围为约0.001-30mg/kg体重，优选约0.01-25mg/kg体重，更优选约0.1-20mg/kg体重，再更优选约1-10mg/kg体重、2-9mg/kg体重、3-8mg/kg体重、4-7mg/kg体重或5-6mg/kg体重。技术人员将认识到，某些因素可能影响有效治疗患者所需的剂量，这些因素包括但不限于疾病的严重性、先前的治疗、患者的一般健康情况和/或年龄以及所患的其它疾病。此外，用治疗有效量的蛋白、多肽或抗体治疗患者可包括单独治疗，或者优选可包括一系列的治疗。
在一个优选实施方案中，用抗体、蛋白或多肽治疗患者，其剂量范围为约0.1-20mg/kg体重，每周一次，大约1-10周，优选2-8周，更优选约3-7周，再更优选约4、5、或6周。还应认识到，用于治疗的抗体、蛋白或多肽的有效剂量在具体治疗中可增加或降低。根据本文描述的诊断测定的结果可改变剂量，而是显而易见。
本发明包括调节表达或活性的药物。药物例如可以是小分子。例如，所述小分子包括但不限于肽、肽模拟物、氨基酸、氨基酸类似物、多核苷酸、多核苷酸类似物、核苷酸、核苷酸类似物、分子量小于10,000g/mol的有机或无机化合物(即包括杂原子有机化合物(heteroorganic compound)和有机金属化合物)、分子量小于5000g/mol的有机或无机化合物、分子量小于1,000g/mol的有机或无机化合物、分子量小于5,00g/mol的有机或无机化合物以及所述化合物的盐、酯和其它药用形式。应当理解的是，小分子药物的合适剂量取决于很多因素，这些因素在一般医生、兽医或研究者的知识范围内。所述小分子的剂量例如可根据要治疗患者或处理样本的身份、外形和状况而改变，如果适用的话，还可根据所述组合物的给予途径改变，还可根据执业医师希望所述小分子所具有的对本发明核酸或多肽的作用而改变。
代表剂量包括mg或μg量/kg患者或样本重量的所述小分子(例如约1μg/kg至约500mg/kg、约100μg/kg至约5mg/kg或约1μg/kg至约50mg/kg)。还要理解的是，小分子的合适剂量取决于小分子调节表达或活性的潜力。可使用本文所述测定确定所述合适剂量。当将一种或多种这些小分子给予动物(例如人)以便调节本发明多肽或核酸的表达或活性时，医生、兽医或研究者例如可首先开相对较低剂量的处方，随后增加剂量，直至获得合适的反应。另外，应当理解，对于任一具体动物患者的特定剂量水平取决于多种因素，包括使用的具体化合物的活性、患者的年龄、体重、一般健康情况、性别和饮食状况、给药时间、给药途径、排泄速率、任何药物组合以及表达或活性要调节的程度。
此外，抗体(或其片段)可缀合至治疗部分，例如治疗剂或放射性金属离子。治疗药物包括但不限于抗代谢物(例如氨甲喋呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、氮烯唑胺(decarbazine))、烷化剂(例如氮芥、thioepa苯丁酸氮芥、苯丙氨酸氮芥、卡氮芥(BSNU)和环己亚硝脲(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲菌素、丝裂霉素C和顺-二氯二胺铂(II)(DDP)、顺铂)、蒽环类(例如柔红霉素(以前称为道诺霉素)和阿霉素)、抗生素(例如更生霉素(以前称为放线菌素)、博来霉素、光神霉素和氨茴霉素(AMC))和抗有丝分裂剂(例如长春新碱和长春花碱)。
本发明的缀合物可用于改进某种已知生物反应，不能将药物部分理解为限于经典化学治疗剂。例如，药物部分可以是具有需要生物活性的蛋白或多肽。这样的蛋白可包括例如毒素，如相思豆毒蛋白、篦麻毒素A、假单胞菌外毒素或白喉毒素；蛋白，例如肿瘤坏死因子、α-干扰素、β-干扰素、神经生长因子、血小板衍生生长因子、组织纤溶酶源激活物；或生物反应改进剂，例如淋巴因子、白介素-1(“IL-1”)、白介素-2(“IL-2”)、白介素-6(“IL-6”)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(“GM-CSF”)、粒细胞集落刺激因子(“G-CSF”)或其它生长因子。
使所述治疗部分与抗体缀合的技术是众所周知的，参见例如Arnon等，“癌症治疗中用于药物免疫靶向的单克隆抗体”，载于Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy，Reisfeld等(编辑)，第243-56页(Alan R.Liss，Inc.1985)；Hellstrom等“用于药物传递的抗体”，载于Controlled Drug Delivery(第2版)，Robinson等(编辑)，第623-53页(Marcel Dekker，Inc.1987)；Thorpe，“癌症治疗中细胞毒性剂的抗体载体综述”，载于Monoclonal Antibodies′84Biological AndClinical Applications，Pinchera等(编辑)，第475-506页(1985)；“放射性标记抗体在癌症治疗中的治疗用途的分析、结果和未来展望”，载于Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy，Baldwin等(编辑)，第303-16页(Academic Press 1985)和Thorpe等，“抗体-毒素缀合物的制备和细胞毒性特征”，Immunol.Rev.，62119-58(1982)。或者，可将抗体缀合至二抗，以形成Segal在美国专利第4,6776,980号所述的抗体复共轭对配合物(heteroconjugate)。
用于本发明方法的核酸分子可插入到载体中，并可用作基因治疗载体。基因治疗载体可通过例如静脉注射、局部给药(参见美国专利5,328,470)或定向注射(参见例如Chen等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA913054-3057)传递给患者。基因治疗载体的药物制剂可包括基因治疗载体的药用稀释剂溶液，或者可包含其中嵌入基因传递载体的缓释基质。或者，可由重组细胞完整地生产整个基因传递载体，例如逆转录病毒载体，药物制剂可包含生产基因传递系统的一种或多种细胞。
B.药物基因组学可考虑将药物基因组学(即研究患者基因型与患者对外来化合物或药物的反应之间的关系)与本发明治疗方法相结合。治疗药物的代谢差异可通过改变药学活性药物的剂量和血液浓度之间的关系而导致严重的毒性或治疗失败。因此，医师或临床医生可考虑应用由相关药物基因组学研究获得的知识决定是否给予P-选择蛋白拮抗剂(例如可溶性PSGL-1)以及具体确定PSGL-1活性调节药物的治疗剂量和/或治疗方案。
药物基因组学涉及由于药物处置改变和染病个体的不正常反应而产生的药物反应中的临床显著性固有偏差。参见例如Eichelbaum，M.等(1996)Clin.Exp.Pharmacol.Physiol.23(10-11)983-985和Linder，M.W.等(1997)Clin.Chem.43(2)254-266。一般来说，能够区别两类药物遗传因素。
遗传因素以改变药物作用于机体(改变药物作用)的单因素传递，或者遗传因素以改变机体作用于药物(改变药物代谢)的单因素传递。这些药物遗传因素或者可以罕有的遗传缺陷出现，或者可以天然的多态性出现。例如，葡萄糖-6-磷酸氨基肽酶缺陷(G6PD)是一种常见遗传性酶病，其重要临床并发症是在摄入氧化药物(抗疟药、磺胺、镇痛药、硝基呋喃)和食用蚕豆后出现溶血。
一种鉴定预测药物反应的基因的药物基因组方法称为“全基因组相关”，主要依靠由已知基因相关标记组成的高分辨率人类基因组图谱(例如由人类基因组上60,000-100,000个多态或可变位点组成的“双等位”基因标记图谱，它们每个都具有两个变异体)。这种高分辨率基因图谱可与参与II/III期药物实验的统计学上数量显著的患者每一个的基因组图谱对比，以鉴定与观察到的特定药物反应或副作用相关的标记。或者，这种高分辨率图谱可产生自人类基因组中几千万已知单核苷酸多态性(SNP)的组合。本文使用的“SNP”是一种常见的发生在DNA主链中的单个核苷酸碱基改变。例如，每1000个DNA碱基可出现一个SNP。SNP可能参与疾病进程，但绝大多数可能与疾病无关。给定基于出现所述SNP的基因图谱，可根据其各个基因组中SNP的具体模式将个体分类为多个遗传类别。按照这种方式，考虑到遗传相似不同个体共同特征，对这些不同类型的遗传相似个体制定不同治疗方案。
或者，可使用一种称为“候选基因方案”的方法鉴别预测药物反应的基因。按照此方法，如果已知编码药物靶(例如本发明的PSGL-1蛋白)的基因，则可相当轻易的鉴定出人群中该基因的所有常见变异体，并可判定一种基因相对于另一种基因是否与特定药物反应相关。
作为一个说明性的实施方案，药物代谢酶的活性是药物作用的强度和长度的主要决定因素。药物代谢酶(例如N-乙酰转移酶2(NAT2)和细胞色素P450酶CYP2D6和CYP2C19)遗传多态性的发现解释了某些患者为什么没有获得预期的药效或在摄入标准和安全剂量药物后显示出过大药物反应和严重毒性。这些多态性在人群中表现为两种表型强代谢者(EM)和弱代谢者(PM)。PM率在不同人群存在差异。例如，编码CYP2D6的基因高度多态性，已在PM中鉴定出几种突变，这些突变都导致功能性CYP2D6缺失。CYP2D6和CYP2C19的弱代谢者在接受标准剂量时相当频繁地经历过大药物反应和副作用。如果代谢物是活性治疗部分，则根据对其CYP2D6形成的代谢物吗啡介导的可待因止痛作用证实，PM没有显示出治疗反应。另一极端是所谓的超强代谢者，它们对标准剂量没反应。近来，已识别出超强代谢的分子基础是源于CYP2D6基因扩增。
或者，可使用一种称为“基因表达模式”的方法鉴定预测药物反应的基因。例如，给药(例如本发明的PSGL-1分子或P-选择蛋白拮抗剂)动物的基因表达可给出一种指示，即与毒性相关的基因途径是否已经开启。
由一种以上的上述药物基因组方案产生的信息可用于确定用于预防或治疗性治疗患者的合适剂量和治疗方案。这种知识当应用于给药和药物选择时可避免副反应或治疗失败，因此在用P-选择蛋白活性调节药物治疗、预防或减轻由缺血和/或再灌注损伤引起的组织或器官损伤时增强了治疗和预防效率。
V.筛选测定本发明提供鉴定调节剂的方法(本文也称为“筛选测定”)，即鉴定结合PSGL-1蛋白的侯选物或测试化合物或药物(例如肽、肽类似物、小分子、核酶或PSGL-1反义分子)对PSGL-1表达或PSGL-1活性具有刺激或抑制作用，或者对PSGL-1靶分子(例如P-选择蛋白或E-选择蛋白)的表达或活性具有刺激或抑制作用，或者对表达PSGL-1靶分子的细胞(例如内皮细胞和活化血小板)有作用(例如抑制细胞迁移或粘附)。使用本文所述测定鉴定的化合物可有效治疗、预防或减轻由缺血后再灌注引起的组织或器官损伤。
侯选/测试化合物包括例如1)肽，例如可溶性肽，包括Ig-尾融合肽和随机肽文库成员(参见例如Lau，K.S.等(1991)Nature35482-84；Houghten，R.等(1991)Nature 35484-86)和由D-和/或L-构型氨基酸组成的组合化学衍生分子文库；2)磷酸肽(例如随机和部分简并性定向磷酸肽文库成员，参见例如Songyang，Z.等(1993)Cell72767-778)；3)抗体(例如多克隆、单克隆、人源化、抗独特型、嵌合和单链抗体以及抗体的Fab、F(ab′)2、Fab表达文库片段和表位结合片段)；和4)小有机和无机分子(例如得自组合和天然产物文库的分子)。
可使用本领域已知组合文库方法中众多方案的任一种获得本发明的测试化合物，这些方案包括生物文库、空间可寻址并行固相或溶液相文库、需要重叠合法的合成文库法；‘一珠一化合物’文库法和使用亲和层析选择的合成文库法。生物文库法限于肽文库，而其它4种方案适用于肽、非肽寡聚物或小分子化合物文库(Lan，K.S.(1997)Anticancer Drug Des.12145)。
分子文库合成方法的实例在本领域可见于例如DeWitt等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A906909；Erb等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA9111422；Zuckermann等(1994)J.Med.Chem.372678；Cho等(1993)Science2611303；Carrell等(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.332059；Carrell等(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.332061；和Gallop等(1994)J.Med.Chem.371233。
化合物文库可存在于溶液中(例如Houghten(1992)Biotechnoques13412-421)或在珠上(Lam(1991)Nature35482-84)、芯片(Fodor(1993)Nature364555-556)、细菌(Lander USP5,223,409)、孢子(LadnerUSP′409)、质粒(Cull等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 891865-1869)或噬菌体(Scott和Smith(1990)Science249386-390；Devlin(1990)Science249404-406；Cwirla等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA876378-6382；Felici(1991)J.Mol.Biol.222301-310；Ladner同上)当中。
可用于鉴定PSGL-1活性或P-选择蛋白活性调节化合物的测定包括使用51Cr-标记细胞(例如白细胞)的细胞粘附测定(如例如Kennedy等(2000)Br J Pharmacology 130(1)95所述)以及细胞迁移测定，例如血小板、嗜中性粒细胞和白细胞迁移(如例如Kogaki等(1999)Cardiovascular Res43(4)968)和Bengtsson等(1999)Scand J Clin LabInvest59(6)439所述)。
一方面，一种测定是细胞型测定，其中表达PSGL-1蛋白或其生物活性部分的细胞据认为涉及P-选择蛋白(例如SEQ ID NO2的氨基酸残基42-60)或E-选择蛋白的结合，使该细胞与测试化合物接触，测定测试化合物调节PSGL-1活性的能力。在一个优选实施方案中，PSGL-1蛋白的生物活性部分包括能够与P-选择蛋白相互作用或抑制P-选择蛋白介导的细胞粘附的结构域或基序。可通过监测例如细胞粘附或细胞迁移测定测试化合物调节PSGL-1活性的能力。所述细胞例如可以是哺乳动物来源，例如内皮细胞或白细胞。
还可以测定测试化合物调节PSGL-1结合底物的能力或测试化合物结合PSGL-1的能力。例如可通过使PSGL-1底物与放射性同位素或酶标记偶联，使得PSGL-1底物与PSGL-1的结合可通过检测复合物中标记的PSGL-1底物测定，来测定测试化合物调节PSGL-1结合底物的能力。或者，可使PSGL-1偶联放射性同位素或酶标记，以监测测试化合物调节复合物中PSGL-1与PSGL-1底物结合的能力。例如可通过使测试化合物与放射性同位素或酶标记偶合，使得测试化合物与PSGL-1的结合可通过检测复合物中标记的PSGL-1化合物测定，来测定测试化合物结合PSGL-1的能力。例如，可用125I、35S、14C或3H直接或间接标记PSGL-1底物，通过直接记数放射性发射或通过闪烁记数检测同位素。或者，可用例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或荧光素酶酶标记化合物，并通过测定合适底物向产物的转化检测酶标记。
测定化合物与PSGL-1相互作用的能力而不标记任何作用物也属于本发明的范围。例如，可使用微生理功能测定仪检测化合物与PSGL-1的相互作用，而不标记化合物或PSGL-1(McConnell，H.M.等(1992)Science2571906-1912)。本文使用的“微生理功能测定仪”(例如细胞传感器)是一种分析仪器，使用光寻址电位传感器(LAPS)检测细胞酸化其环境的速率。酸化速率的改变可用于指示化合物与PSGL-1之间的相互作用。
在再另一个实施方案中，本发明的测定是一种无细胞测定，其中PSGL-1蛋白或其生物活性部分(例如能够结合P-选择蛋白的PSGL-1蛋白片段)与测试化合物接触，并测定测试化合物结合PSGL-1或其生物活性部分的能力或调节(例如刺激或抑制)其活性的能力。优选用于本发明测定的PSGL-1蛋白的生物活性部分包括参与和非PSGL-1分子相互作用的片段，例如具有高表面概率得分的片段。可如上所述直接或间接测定测试化合物与PSGL-1蛋白的结合。还可以使用实时生物分子相互作用分析(BIA)(Sjolander，S.和Urbaniczky，C.(1991)Anal.Chem.632338-2345；Szabo等(1995)Curr.Opin.Struct.Biol.5699-705)之类的技术测定PSGL-1蛋白结合测试化合物的能力。本文使用的“BIA”是一种实时研究生物特异性反应的技术，没有对任何反应物进行标记(例如BIAcore)。表面胞质共振(SPR)光学现象的改变可用于指示生物分子间的实时反应。
在本发明上述测定方法的一个以上的实施方案中，对PSGL-1或P-选择蛋白进行固定化可能比较理想，便于分离复合与未复合形式的一种或两种蛋白，以及便于该测定的自动化。可在任何适于包含反应物的容器中完成测试化合物与PSGL-1蛋白的结合或在有或没有测试化合物的情况下PSGL-1蛋白与P-选择蛋白的相互作用。所述容器的实例包括微量滴定板、试管和微量离心管。在一个实施方案中，可提供加入结构域以允许一种或两种蛋白结合基质的融合蛋白。例如，谷胱甘肽-S-转移酶/PSGL-1融合蛋白或谷胱甘肽-S-转移酶/靶融合蛋白可吸附到谷胱甘肽琼脂糖珠(Sigma Chemical，St.Louis，MO)或谷胱甘肽衍化微量滴定板上，然后与测试化合物混合或测试化合物和未吸附靶蛋白或PSGL-1蛋白混合，混合物在有助于形成复合物的条件下(例如在生理条件的盐和pH下)温育。温育后，洗涤所述珠或微量滴定板，以去除任何未结合的组分，对于珠来说基质是固定的，例如如上所述直接或间接测定形成的复合物。或者，可将复合物由基质上解离下来，使用标准技术测定PSGL-1结合水平或活性水平。
还可以在本发明的筛选测定中使用其它在基质上固定蛋白的技术。例如，可使用生物素和链霉抗生物素缀合物固定PSGL-1蛋白或P-选择蛋白分子。可使用本领域已知的技术(例如生物素化试剂盒，Pierce Chemicals，Rockford，IL)由生物素-NHS(N-羟基-琥珀酰亚胺)制备生物素化PSGL-1蛋白或P-选择蛋白，并固定在包被链霉抗生物素的96孔板(Pierce Chemicals)的孔中。或者，可将与PSGL-1蛋白或P-选择蛋白反应但不阻碍PSGL-1蛋白与其靶分子结合的抗体衍生化至板的孔中，通过抗体缀合捕获孔中的未结合靶蛋白或PSGL-1蛋白。除了上述那些用于GST固定化复合物的方法以外，检测所述复合物的方法还包括使用与PSGL-1蛋白或P-选择蛋白反应的抗体免疫检测复合物，以及依靠检测与PSGL-1蛋白或P-选择蛋白相关的酶活性的酶联测定。
本发明的再另一方面，PSGL-1蛋白或其片段(例如能够结合P-选择蛋白或E-选择蛋白的片段)可在双杂交测定或三杂交测定中用作“饵蛋白”(参见例如美国专利第5,283,317号；Zervos等(1993)Cell72223-232；Madura等(1993)J.Biol.Chem.26812046-12054；Bartel等(1993)Biotechniques14920-924；Iwabuchi等(1993)Oncogene81693-1696；和Brent WO94/10300)，以鉴定其它结合或作用于PSGL-1并影响PSGL-1活性的蛋白(“PSGL-1结合蛋白”或“PSGL-1-bp”)的蛋白。所述PSGL-1结合蛋白还有可能作为例如PSGL-1介导的信号转导途径的下游元件参与由PSGL-1蛋白或PSGL-1靶蛋白传播的信号。或者，所述PSGL-1结合蛋白可能为PSGL-1抑制剂。
双杂交系统基于大多数由分开的DNA结合结构域和活化结构域组成的转录因子的模块化特性。简单来说，所述测定利用两种不同的DNA构建物。在一个构建物中，编码PSGL-1蛋白的基因与编码已知转录因子的DNA结合结构域的基因(例如GAL-4)融合。在另一个构建物中，来自DNA序列文库的编码未知蛋白(“捕获物”或“样品”)的DNA序列融合编码已知转录因子活化结构域的基因。如果“饵”和“捕获物”蛋白能够在体内相互作用形成PSGL-1依赖性复合物，则所述转录因子的DNA结合结构域和活化结构域紧密相邻。这种靠近使得与转录因子反应性转录调节位点有效连接的报告基因(例如LacZ)转录。可以检测报告基因的表达，并可分离包含功能性转录因子的细胞集落，用其获得编码PSGL-1蛋白互作蛋白的克隆基因。
另一方面，本发明涉及本文所述的两个或多个测定的组合。例如，可使用细胞型测定或无细胞测定鉴定调节药物，并例如可用动物模型(例如缺血动物模型，如中风动物模型)体内证实所述药物调节P-选择蛋白配体拮抗剂活性的能力。缺血和再灌注动物模型包括本文描述的那些模型，以及至少例如Sarabi等(2001)Exp.Neurol.170(2)283-9；Descheerder等(2001)J.Am.Soc.Echocardiogr14(7)691-7；Ohara等(2001)Gene Trer.8(11)837；和Dammers等(2001)Br.J.Surg.88(6)816-24描述的那些模型。
而且，如本文描述鉴定的PSGL-1调节剂(例如反义PSGL-1核酸分子、PSGL-1特异性抗体或小分子)可在动物模型中用于测定用所述调节剂治疗的效力、毒性或副作用。或者，如本文描述鉴定的PSGL-1调节剂可在动物模型中用于测定所述调节剂的作用机制。
本发明由以下的实施例进一步阐述，这些实施例不构成限制作用。整个本申请中提及的所有参考文献、专利和已公开专利申请的内容以及附图和序列表都通过引用结合到本文中。
实施例实施例1P-选择蛋白配体蛋白融合该实施例描述了二聚体P-选择蛋白配体融合蛋白(本文也称为rPSGL-Ig)的生产。构建编码信号肽、PACE切割位点和成熟P-选择蛋白配体序列的前47个氨基酸的cDNA，其中所述成熟P-选择蛋白配体序列与人IgG1的成熟Fc区在天然Fc序列的His224融合。cDNA构建物的序列以SEQ ID NO3公告。融合点是位于核苷酸261的新NotI位点。由所述cDNA构建物编码的氨基酸序列以SEQ ID NO4公告。编码的融合蛋白的成熟氨基酸序始于SEQ ID NO4的氨基酸42开始。Fc区部分的突变是天然Fc序列的Leu234和Gly237变为Ala。
实施例2可溶性P-选择蛋白拮抗剂(RPSGL-IG)对减轻缺血/再灌注脑损伤的有效性该实施例描述了检测可溶性重组P-选择蛋白拮抗剂(rPSGL-Ig)在缺血动物模型中对减轻缺血/再灌注脑损伤的有效性的研究结果。该动物模型的结果有可能预示在人类中的结果。
材料和方法在250-300克重的Sprague-Dawley大鼠头盖嵌入透明窗。在开窗当日，用戊巴比妥(40mg/kg，腹膜注射)麻醉大鼠。在诱导缺血前使大鼠恢复至少4天。所有大鼠在缺血前的晚上都禁食。用氯胺酮(100mg/ml.)和甲苯噻嗪(20mg/ml)的1∶1混合物以0.1ml/100g体重的剂量肌肉注射诱发麻醉。使用由Koizumi等开发的技术(由Belayev，L等(1996)Stroke 27(9)1616-22描述的用于大脑中动脉短暂梗塞的方法改进)产生局部缺血。将缝线经颈外动脉引入内颈动脉中。缝线保持在该处达30或120分钟，然后拆除。为确保每个大鼠的大脑中动脉都完全梗塞，在放置缝线前后监测体感诱发电位(SSEP)。仅选取缝线处于原位时表现出诱发反应丧失的大鼠。大脑温度保持在37℃。
每个研究中大鼠都分为治疗和未治疗两组。在第一个研究中，治疗动物在拆除大脑中动脉的缝线前1分钟静脉给予rPSGL-Ig(1mg/kg)。在第二个研究中，它们在缺血前接受4mg/kg的所述药物。未治疗动物静脉接受等体积的载体代替所述药物。使用上照显微镜活体内显微检测头盖表面。使用中密度滤光片降低光强度和避免光毒性。使用连接Genisyl影像增强器的CCD照相机将微血管床视频影像传送至磁带录像机。使用影像增强器使我们记录视频影像，同时组织接触的光强度低。光照强度直接影响白细胞滚动和粘附。使用20X水浸没式透镜放大微血管床。选择20-45μm的毛细血管后微静脉进行观察。在血管分支点下游200μm获得检测结果。分析录下的小静脉的白细胞滚动和粘附情况。
在研究结束时，用戊巴比妥麻醉大鼠并去头。快速取下大脑并放置于冷(4℃)盐水中，以便于切片。制作5个冠状切片。然后将每个冠状切片浸入2％的2，3，5-三苯基盐酸四唑鎓盐酸盐溶液中。于黑暗中用该溶液温育切片(37℃30分钟)，然后在10％磷酸缓冲的甲醛中固定。固定后的切片放置在解剖显微镜下并拍照。5个切片的每一个都对喙部和尾侧拍照。图象由Seattle Filmworks(Seattle，WA，USA)进行数字化处理，用计算机分析梗塞面积。
结果结果显示，rPSGL-Ig趋向于减弱短暂缺血后大脑表面上小静脉中白细胞的滚动。小静脉中白细胞的滚动在大脑中动脉梗塞30分钟后的再灌注过程中选定用于检测的全部时间段都趋向于下降(参见图1)。梗塞120分钟后，再灌注60分钟后滚动趋向于下降(参见图2)。这至少部分是由于剪切率的差别。
梗塞的30分钟持续时间不足以对大脑产生确实的梗死。大脑中动脉梗塞120分钟在未治疗大鼠中引起大约32％的同侧大脑半球梗塞。通过在再灌注前1分钟给予rPSGL-Ig明显降低了这种梗塞的面积(达到大约26％的同侧大脑半球)。在一个单独的大鼠组别中，在梗塞前以4次剂量给予rPSGL-Ig。尽管这些大鼠的梗塞面积比再灌注过程中接受较低剂量的大鼠稍微低一些(22％)，但结果没有显著不同。
这些结果表明，P-选择蛋白的表达对缺血和/或再灌注损伤是一个重要影响因素。这些结果还表明，rPSGL-Ig干扰白细胞在短暂缺血后顺着大脑皮层小静脉滚动。用P-选择蛋白拮抗剂(例如rPSGL-Ig)在缺血前或再灌注过程中封闭P-选择蛋白有效降低由短暂缺血引起的脑损伤程度。
本领域技术人员能识别或仅仅使用常规实验能够确定许多与本文描述的本发明具体实施方案等同的方案。这些等同方案包含在以下的权利要求书中。
序列表<110>Genetics Institute，LLCTemple University<120>缺血后白细胞-内皮细胞相互作用的调节<130>8702.0099-00304<140>未指定<141>
<150>60/309,816<151>2001-08-03<160>4<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1649<212>DNA<213>人<400>1gccacttctt ctgggcccac gaggcagctg tcccatgctc tgctgagcac ggtggtgcca 60tgcctctgca actcctcctg ttgctgatcc tactgggccc tggcaacagc ttgcagctgt 120gggacacctg ggcagatgaa gccgagaaag ccttgggtcc cctgcttgcc cgggaccgga 180gacaggccac cgaatatgag tacctagatt atgatttcct gccagaaacg gagcctccag 240aaatgctgag gaacagcact gacaccactc ctctgactgg gcctggaacc cctgagtcta 300ccactgtgga gcctgctgca aggcgttcta ctggcctgga tgcaggaggg gcagtcacag 360agctgaccac ggagctggcc aacatgggga acctgtccac ggattcagca gctatggaga 420tacagaccac tcaaccagca gccacggagg cacagaccac tccactggca gccacagagg 480cacagacaac tcgactgacg gccacggagg cacagaccac tccactggca gccacagagg 540cacagaccac tccaccagca gccacggaag cacagaccac tcaacccaca ggcctggagg 600cacagaccac tgcaccagca gccatggagg cacagaccac tgcaccagca gccatggaag 660cacagaccac tccaccagca gccatggagg cacagaccac tcaaaccaca gccatggagg 720cacagaccac tgcaccagaa gccacggagg cacagaccac tcaacccaca gccacggagg 780cacagaccac tccactggca gccatggagg ccctgtccac agaacccagt gccacagagg 840ccctgtccat ggaacctact accaaaagag gtctgttcat acccttttct gtgtcctctg 900ttactcacaa gggcattccc atggcagcca gcaatttgtc cgtcaactac ccagtggggg 960ccccagacca catctctgtg aagcagtgcc tgctggccat cctaatcttg gcgctggtgg 1020
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权利要求
1.一种预防或减轻患者脑缺血后再灌注损伤的方法，该方法包括给予有效量的一种组合物，该组合物含有P-选择蛋白拮抗剂或其具有P-选择蛋白配体活性的片段。
2.权利要求1的方法，其中所述患者患中风。
3.权利要求1的方法，其中所述再灌注损伤为皮质梗塞。
4.权利要求1的方法，其中所述P-选择蛋白拮抗剂为抗P-选择蛋白配体抗体或其片段。
5.权利要求1的方法，其中所述P-选择蛋白拮抗剂为可溶性PSGL-1蛋白或其具有P-选择蛋白配体活性的片段。
6.权利要求5的方法，其中所述可溶性PSGL-1蛋白为人PSGL-1。
7.权利要求5的方法，其中所述可溶性PSGL-1蛋白为重组蛋白。
8.权利要求5的方法，其中所述可溶性PSGL-1蛋白包含免疫球蛋白的Fc部分。
9.权利要求8的方法，其中所述免疫球蛋白为人IgG1。
10.权利要求5的方法，其中所述可溶性PSGL-1蛋白为重组人PSGL-Ig融合蛋白。
11.权利要求10的方法，其中所述片段包含SEQ ID NO2所示氨基酸序列的氨基酸42至氨基酸60。
12.权利要求10的方法，其中所述片段包含SEQ ID NO2所示氨基酸序列的氨基酸42至氨基酸88。
13.权利要求10的方法，其中所述片段包含SEQ ID NO2所示氨基酸序列的氨基酸42至氨基酸118。
14.权利要求10的方法，其中所述片段包含SEQ ID NO2所示氨基酸序列的氨基酸42至氨基酸189。
15.权利要求10的方法，其中所述片段包含SEQ ID NO2所示氨基酸序列的氨基酸42至氨基酸310。
16.权利要求4的方法，其中所述可溶性PSGL-1蛋白包含SEQID NO2的氨基酸42至氨基酸88的氨基酸序列，该序列以其C末端和免疫球蛋白的Fc部分融合。
17.权利要求1的方法，其中所述可溶性PSGL-1蛋白还包含免疫球蛋白的Fc部分。
18.权利要求1的方法，其中所述患者为人。
19.权利要求1的方法，其中所述P-选择蛋白拮抗剂在再灌注前给予患者。
20.权利要求1的方法，其中所述P-选择蛋白拮抗剂与有效量的一种或多种粘附分子抑制剂联合给予患者。
21.权利要求1的方法，其中所述P-选择蛋白拮抗剂在再灌注过程中给予患者。
22.权利要求1的方法，其中所述P-选择蛋白拮抗剂与有效量的一种或多种粘附分子抑制剂联合给予患者。
23.一种预防或减轻患者脑缺血后梗塞的方法，该方法包括给予有效量的一种组合物，该组合物含有P-选择蛋白拮抗剂或其具有P-选择蛋白配体活性的片段。
24.一种预防或减轻患者中风后脑损伤的方法，该方法包括给予有效量的一种组合物，该组合物含有P-选择蛋白拮抗剂或其具有P-选择蛋白配体活性的片段。
25.一种抑制患者大脑再灌注后细胞与血管粘附的方法，该方法包括给予有效量的一种组合物，该组合物含有P-选择蛋白拮抗剂或其具有P-选择蛋白配体活性的片段。
26.权利要求25的方法，其中所述细胞为白细胞。
27.一种抑制患者大脑再灌注后细胞与细胞粘附的方法，该方法包括给予有效量的一种组合物，该组合物含有P-选择蛋白拮抗剂或其具有P-选择蛋白配体活性的片段。
28.权利要求27的方法，其中所述细胞为白细胞和血小板。
全文摘要
本发明涉及减轻或预防由缺血(例如中风)后再灌注引起的组织或器官(例如大脑)损伤的方法和组合物。本发明还提供通过给予P－选择蛋白拮抗剂在患者中降低由缺血和/或再灌注引起的梗塞面积的方法和组合物。本发明还提供通过给予可溶性P－选择蛋白配体或其片段、抗P－选择蛋白配体抗体或抗P－选择蛋白抗体调节(例如减弱)患者中的白细胞滚动、胞间粘附和细胞与血管粘附的方法。本发明还提供鉴定能够减轻或预防由缺血性疾病和再灌注损伤引起的组织或器官损伤的化合物的方法。
文档编号A61P9/00GK1561225SQ02819345
公开日2005年1月5日 申请日期2002年7月26日 优先权日2001年8月3日
发明者M·J·埃皮希默, R·G·肖布, R·图马 申请人:遗传研究所公司, 联邦高等教育系统坦普尔大学