在疏水性相互作用位点内引入了静电相互作用的蛋白及其制备方法
【专利说明】在疏水性相互作用位点内引入了静电相互作用的蛋白及其 制备方法 【技术领域】
[0001] 本发明设及具有高纯度的异源双特异性抗体度sAb)或双特异性融合蛋白 度3巧）。 【【背景技术】】
[0002] 大多数双特异性抗体度sAb)均通过人工制造W同时结合两个不同的祀标，而不 是通常在自然界中产生。双重祀向能力为BsAb提供了新的尚未被单特异性抗体（MsAb)设 足的应用领域。对治疗性目的的特别关注是引人深思的可能性，W使得BsAb(I)可靠地将 免疫细胞募集到祀细胞附近，（2)抑制或激活祀细胞中两个相隔较远的信号传导通路W产 生协同效应，W及（3)W特异性和调控方式递送福射诱导的治疗性物质、药品、毒素或信号 传导分子。
[000引 BsAb通常用于W非M肥依赖性方式将T细胞递送到肿瘤细胞中，从而介导肿瘤细 胞的细胞表面抗原与细胞毒性T细胞的CD3-TCR复合物之间的联系（图1)。图1中的卡妥 索单抗(民6皿>^純?)(大鼠-小鼠混合单克隆抗体）用于治疗恶性腹水，其称为功能抗 体"。
[0004] 完整的链缔合应在两个不同的水平上发生，W便产生修饰最少的全长IgG样的 BsAb,而无任何链缔合问题。（1)两条重链应为异源双特异性的，并且（2)两条轻链化C)应 与其相应的重链正确配对。
[0005] 链缔合问题应加W解决W按值得信赖的方法产生BsAb。如图2中所示，两条重链 和两条轻链的组合生成了 10个不同形式的抗体嵌合体。在它们之中，仅有一个是正确的 BsAb,而其余的是无价值的嵌合体。该链缔合问题在工业领域中将正确的BsAb的产率降低 至至少10倍，并导致难W将BsAb与其他嵌合体分离的各种问题。因此，许多制药公司花费 了大量的资源并努力开发和获得W直接且可靠的方式产生BsAb的技术。
[0006] 已开发了多种多样的BsAb相关技术（45种不同的形式）。运些技术基于结构而 被分成4类。第一，通过包括称为Knob-into-Hole或简称为KiH的结构互补性、静电指向 效应或C册结构域混编（称为SE邸bodyTM)的各种方法对重链进行的异源双特异化；第二， 各种抗体片段形式，诸如Di油odyTM、BiTETM和DARTTM;第S，使用与完整抗体相结合的一 个或多个功能性结构域的技术，诸如ModularAntibodyTM、ZybodyTM、dAbsTM和DVD-IGTM; 第四，采用全长IgG类似方案的技术，如DuobodyTM(F油-ArmExchange)、CrossMabTM、 AzymetricTM和klbodyTM,已得到开发。
[0007] 在它们之中，Zymeworks通过美国专利申请第2013-892198号（对在Fe结构域中 具有突变的异源多聚体免疫球蛋白链的结构专利提出了权利要求）表明异源多聚体结构 的抗体可通过用带电荷的氨基酸对二硫键中设及的半脫氨酸残基进行修饰而制备。
[0008] 然而，W上任何专利均未公开运样一种技术：选自疏水性相互作用部分的修饰氨 基酸对通过静电相互作用而引起与彼此选择性偶合。本发明人已通过确认W下方面而完成 了本发明：当将疏水性相互作用中设及的一对氨基酸分别修饰成酸性氨基酸和碱性氨基酸 时，异源双特异化更具选择性地发生。 【
【发明内容】
】
[000引【技术问题】
[0010] 本发明的目的在于提供具有优异的异源双特异化的双特异性抗体（异源二聚 体）。
[0011] 本发明的另一个目的在于提供一种通过将疏水性相互作用中的一对氨基酸改变 成彼此相反的电荷而制造异源双特异化很好地发生的蛋白的方法。
[001引【技术方案】
[0013] 对于W上目标，本发明的第一方面是提供通过上述负电荷和上述正电荷而引入了 静电相互作用的蛋白，其中一对疏水性氨基酸选自蛋白的疏水性相互作用的一部分，将一 个疏水性氨基酸改变成正电荷，并将另一个疏水性氨基酸改变成负电荷。带有正电荷的材 料可W是碱性氨基酸但不限于此，带有负电荷的材料可W是酸性氨基酸但不限于此。
[0014] 疏水性氨基酸是选自甘氨酸、丙氨酸、鄉氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨 酸和苯丙氨酸中的任一种氨基酸，并且酸性氨基酸是选自天冬氨酸或谷氨酸的任一种氨基 酸。
[0015] 从两个不同的肥/LC对来组装全长IgG类似的双特异性抗体通过两个链缔合过程 进行。换句话讲，HC异源双特异化和富有成效的HC/LC配对，及其在两条重链之间的成功 率取决于区分重链与轻链的效率。
[0016] 为了找到适当的变异位点，已关注了抗体的链之间的疏水性界面上的氨基酸残 基，因为疏水性相互作用是蛋白折叠和结合的主要驱动力。为了选择如同疏水性相互作用 一样强大的适当类型的修饰（因为其提供解决双特异性抗体的链缔合问题所必需的蛋白 鉴别力），已选择了静电相互作用。
[0017] 据设想，此类链之间的区别通过在两条结合链之间的界面处引入结构修饰的互补 配对而解决。一个或多个疏水性氨基酸被突变的带电荷的氨基酸替换W与对应物配对。运 样的变化在下文中称为S册CAP(将疏水性置换成带相反电荷的氨基酸对）。两条重链的Fc 结构域中的甜OCAP生成带正电和带负电的重链（各自称为化和化）。运些静电相互作用 比重链的同源双特异化（同源二聚化）更偏向于异源双特异化（异源二聚化）。W相同的 方式，通过S册CAP对两个Fab结构域的修饰形成带正电和带负电的轻链（分别称为La和 化），并且与重链的带相反电荷的Fab结构域的静电相互作用提高了正确HC/LC配对的概 率。
[0018]为了在无任何链缔合问题的情况下产生BsAb，将两个独立的修饰引入天然存在的 抗体中。一个针对Fc结构域的异源双特异化，而另一个针对重链与轻链的正确配对。
[0019] 在本发明中，Fc结构域的异源双特异化（异源二聚化）在抗体的Fc结构域中的 一个或多个疏水性相互作用转化成静电对相互作用（例如，第407位残基处的两个酪氨酸 的疏水性相互作用灯407:Y407)转化成第407位残基处天冬氨酸和赖氨酸的静电对相互作 用值407:K407))时可靠且积极地发生。
[0020] 当F油结构域的主要疏水性残基被置换时（例如，第128位残基的亮氨酸和第118 位残基的苯丙氨酸化128:F118)置换成第128位残基的赖氨酸和第118位残基的天冬氨酸 化128:0118))时，使用甜OCAP技术可较为容易地区分两条重链（重链）和两条轻链（轻 链）。因此，IgG类似的双特异性抗体可通过将甜OCAP技术应用于抗体的Fc和F油结构域 而生成。
[0021] 本发明的第二方面是提供运样的抗体，其中已通过将一个疏水性氨基酸突变成带 正电的氨基酸并将另一个突变成带负电的氨基酸而将静电相互作用引入了疏水性相互作 用区。W上正电荷可W是碱性的但不限于此，并且W上负电荷可W是酸性的但不限于此。
[0022] 具体地，抗体因W下两者之间的静电相互作用而具有结合力：任一个氨基酸突变 成选自天冬氨酸或谷氨酸的酸性氨基酸，而另一个突变成选自赖氨酸、精氨酸或组氨酸的 碱性氨基酸，其中，突变被引入选自W下的一个或多个氨基酸对：CH3结构域中的351亮氨 酸和351亮氨酸疏水性相互作用对、395脯氨酸和397鄉氨酸疏水性相互作用对、395脯氨 酸和395脯氨酸疏水性相互作用对、407酪氨酸和407酪氨酸疏水性相互作用对；W及人抗 体的CHl结构域与化结构域之间的128亮氨酸和118苯丙氨酸对、128亮氨酸和133鄉氨 酸对、141丙氨酸和116苯丙氨酸对、141丙氨酸和135亮氨酸对、145亮氨酸和133鄉氨酸 对、170苯丙氨酸和135亮氨酸对、185鄉氨酸和118苯丙氨酸对W及185鄉氨酸和135亮 氨酸对。更具体地，抗体被表征为在选自表4中的ZO至Z14的一组组合上发生突变。抗 体可带有一对具有一对功能的胞外域。胞外域可在癌症和信号传导中发挥作用，并且该毒 素可用于治疗通过另一种特异性抗体结合的与细胞死亡相关的癌症。胞外域可W是选自 TNR2、Her3、Tie2、TGFbRU BMPbRU Il-12R-bl、IL-4Ra、ITGA4、ITGA2B、INFAR1、IL-12A、 IL-4、InFa、BMP2、IL-lRlL、IL-17RA、n^-17AJas、FltD2、Herl、Tiel、TGFbR2、n^-12R-b2、 比-13Ral、IT