-PAGE凝胶中形成60kDHPW及50kDHN和25kDLP。
[0112]B.对称和不对称设计
[0113]W两种不同的设计进行了修饰。两个F油结构域中的电荷分布模式可W是对称的 或不对称的（参见图19)。
[0114]C.肥/LC配对的变体
[0115] 单独地或W组合方式，将整个21个疏水性残基修饰成静电相互作用对残基，并在 21组变体中缔合（参见表7)。
[0116]【表7】
[0119] 通过之前所述的肥/LC配对分析方法测量了变体组中正确的肥/LC配对的程度。
[0120]SDS-PAGE分析
[0121] 在21组中将V3W1组选择为导致修饰成正确的肥/LC配对的最佳变体（参见图 20)。
【主权项】
1. 一种在疏水性相互作用位点中引入了静电相互作用的蛋白，其中所述静电相互作用 在正电荷与负电荷之间发生，并且所述正电荷通过在选自蛋白疏水性相互作用位点的疏水 性相互作用位点的一对氨基酸中将一个疏水性氨基酸修饰成带正电的材料而引入，并且所 述负电荷通过在所述一对氨基酸中将另一个疏水性氨基酸修饰成带负电的材料而引入。2. 根据权利要求1所述的在疏水性相互作用位点中引入了静电相互作用的蛋白，其特 征在于，所述带正电的材料为碱性氨基酸。3. 根据权利要求1所述的在疏水性相互作用位点中引入了静电相互作用的蛋白，其特 征在于，所述带负电的材料为酸性氨基酸。4. 根据权利要求1所述的在疏水性相互作用位点中引入了静电相互作用的蛋白，其特 征在于，所述带正电的材料为碱性氨基酸并且所述带负电的材料为酸性氨基酸。5. 根据权利要求1-4中任一项所述的在疏水性相互作用位点中引入了静电相互作用 的蛋白，其特征在于，所述疏水性氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲 硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸和色氨酸。6. 根据权利要求4所述的在疏水性相互作用位点中引入了静电相互作用的蛋白，其特 征在于，所述酸性氨基酸为天冬氨酸或谷氨酸，并且所述碱性氨基酸选自赖氨酸、精氨酸和 组氨酸。7. -种在疏水性相互作用位点中引入了静电相互作用的抗体，其中所述静电相互作用 在正电荷与负电荷之间发生，并且所述正电荷通过在选自抗体疏水性相互作用位点的疏水 性相互作用位点的一对氨基酸中将一个疏水性氨基酸修饰成带正电的材料而引入，并且所 述负电荷通过在所述一对氨基酸中将另一个疏水性氨基酸修饰成带负电的材料而引入。8. 根据权利要求7所述的在疏水性相互作用位点中引入了静电相互作用的抗体，其特 征在于，所述带正电的材料为碱性氨基酸。9. 根据权利要求7所述的在疏水性相互作用位点中引入了静电相互作用的抗体，其特 征在于，所述带负电的材料为酸性氨基酸。10. 根据权利要求7所述的在疏水性相互作用位点中引入了静电相互作用的抗体，其 特征在于，所述带正电的材料为碱性氨基酸并且所述带负电的材料为酸性氨基酸。11. 根据权利要求7-10中任一项所述的在疏水性相互作用位点中引入了静电相互作 用的抗体，其特征在于，所述疏水性氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、 甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸和色氨酸。12. 根据权利要求10所述的在疏水性相互作用位点中引入了静电相互作用的抗体，其 特征在于，所述酸性氨基酸为天冬氨酸或谷氨酸，并且所述碱性氨基酸选自赖氨酸、精氨酸 和组氨酸。13. -种制备具有增加的链选择性的蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括以下步 骤： (a) 在多肽链与多肽链之间的疏水性相互作用中选择一对氨基酸； (b) 在所选的一对氨基酸中将其中的一个疏水性氨基酸修饰成带正电的材料，并将另 一个疏水性氨基酸修饰成带负电的材料；以及 (c) 通过所述带正电的材料与所述带负电的材料之间的接触而以静电相互作用结合。14. 根据权利要求13所述的制备具有增加的链选择性的蛋白的方法，其特征在于，所 述带正电的材料为碱性氨基酸。15. 根据权利要求13所述的制备具有增加的链选择性的蛋白的方法，其特征在于，所 述带负电的材料为酸性氨基酸。16. 根据权利要求13所述的制备具有增加的链选择性的蛋白的方法，其特征在于，所 述带正电的材料为碱性氨基酸并且所述带负电的材料为酸性氨基酸。17. 根据权利要求13-16中任一项所述的制备具有增加的链选择性的蛋白的方法，其 特征在于，所述疏水性氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯 氨酸、苯丙氨酸和色氨酸。18. 根据权利要求16所述的制备具有增加的链选择性的蛋白的方法，其特征在于，所 述酸性氨基酸为天冬氨酸或谷氨酸，并且所述碱性氨基酸选自赖氨酸、精氨酸和组氨酸。19. 一种通过突变的氨基酸之间的静电相互作用而具有结合力的抗体，其中所述静电 相互作用在选自以下氨基酸对的一对或多对氨基酸中的突变氨基酸之间发生：CH3结构域 中的351亮氨酸和351亮氨酸疏水性相互作用对、395脯氨酸和397缬氨酸疏水性相互作用 对、395脯氨酸和395脯氨酸疏水性相互作用对、407酪氨酸和407酪氨酸疏水性相互作用 对；以及人抗体的CHl结构域与CL结构域之间的128亮氨酸和118苯丙氨酸对、128亮氨 酸和133缬氨酸对、141丙氨酸和116苯丙氨酸对、141丙氨酸和135亮氨酸对、145亮氨酸 和133缬氨酸对、170苯丙氨酸和135亮氨酸对、185缬氨酸和118苯丙氨酸对以及185缬 氨酸和135亮氨酸对，并且所述突变的氨基酸通过使所选的氨基酸对中的一个氨基酸突变 成选自天冬氨酸或谷氨酸的酸性氨基酸，以及使所选的氨基酸对的另一个氨基酸突变成选 自赖氨酸、精氨酸和组氨酸的碱性氨基酸而产生。20. 根据权利要求19所述的抗体，其特征在于，所述突变的氨基酸对选自包括表4的 ZO至Z14的组合的组。21. 根据权利要求19所述的抗体，其中所述抗体是通过组合一对选自TNR2、Her3、 Tie2、TGFbRl、BMPbRl、Il-12R-bl、IL-4Ra、ITGA4、ITGA2B、INFAR1、IL-12A、IL-4、InFa、 BMP2、IL-1R1L、IL-17RA、IL-17A、Fas、FltD2、Herl、Tiel、TGFbR2、IL-12R-b2、IL-13Ral、 ITGB1、ITGB3、INFAR2、IL-12B、IL-13、INFb、BMP7、IL-1RAP、IL-17RC和IL-17F的胞外域而 形成的融合抗体。22. 根据权利要求21所述的抗体，其中所述抗体是具有选自Her2/FltD2组合、Herl/ Her3组合和Tie/Tie2组合的胞外域组合的融合抗体。23. 根据权利要求19所述的抗体，其中所述抗体是双特异性抗体，其具有通过Z14的组 合而突变的重链，以及包含甲型流感病毒的4D9胞外域和乙型流感病毒的2B9胞外域的共 同轻链。24. -种通过使用根据权利要求23所述的抗体测量双特异性抗体的重链与轻链之间 的偶合程度的方法。25. -种在由选自表7的重正链（HP)、重负链（HN)、轻正链（LP)和轻负链（LN)的乂1-V5、Wl-W8、V2p、V3p、W4p、V3W4、W4v3、V3V1组合组成的重链与轻链之间增加了偶合程度的 抗体。26. 根据权利要求25所述的在重链与轻链之间增加了偶合程度的抗体，其中一个重链 中的103色氨酸突变成赖氨酸；另一条重链中的128赖氨酸突变成天冬氨酸；其中一个轻 链中的118苯丙氨酸突变成赖氨酸；并且另一条轻链中的44脯氨酸突变成天冬氨酸。
【专利摘要】本发明提供了一种蛋白或抗体，其中，在选自所述蛋白的疏水性相互作用位点内的一对疏水性氨基酸之中，一个疏水性氨基酸转化成带有正电荷的物质，而另一个疏水性氨基酸转化成带有负电荷的物质，并且借助所述正电荷和所述负电荷而在所述蛋白的所述疏水性相互作用位点内引入静电相互作用。本发明还提供了一种制备所述蛋白或抗体的方法，以及一种使用所述抗体测量重链与轻链之间的偶合程度的方法。根据本发明的所述蛋白或抗体受到同源二聚体或单体的污染较低，并因此能以高纯度得到异源二聚体。
【IPC分类】C07K19/00, C07K16/46
【公开号】CN105229036
【申请号】CN201480027216
【发明人】金秀恩
【申请人】伊班绰斯有限责任公司
【公开日】2016年1月6日
【申请日】2014年3月13日
【公告号】CA2918328A1, EP2975061A1, US20160152726, WO2014142591A1