可溶性t细胞受体的制作方法

专利名称：可溶性t细胞受体的制作方法
技术领域：
本发明涉及可溶性T细胞受体(TCRs)。
如在WO 99/60120中所描述的，TCRs介导T细胞对特异的主要组织相容性复合体(MHC)-肽复合体的识别，并由此对免疫系统的细胞免疫功能至关重要。
抗体和TCRs是以特异性方式识别抗原的仅有的两类分子，且因此TCR为呈现在MHC上的特定肽抗原的唯一受体，处源肽通常为细胞内异常性的唯一指征。T细胞识别发生于T细胞和抗原呈递细胞(APC)出现直接的物理接触时，并由抗原特异的TCRs与pMHC复合体的结合启动。
TCR为免疫球蛋白超家族的异源二聚体细胞表面蛋白质，所述超家族与参与介导信号转导的CD3复合体的恒定蛋白质有关。TCRs以αβ和γδ形式存在，这两种形式受体的结构类似，但表达它们的T细胞具有截然不同的解剖学定位且功能也可能不同。受体的胞外部分由两个近膜的恒定结构域和两个远膜的可变结构域组成，所述可变结构域具有与抗体的互补决定区(CDRs)类似的多态性环。正是这些环形成了TCR分子的结合位点并决定肽特异性。MHC I类和II类配体也为免疫球蛋白超家族蛋白质，但其特异用于抗原呈递，具有的多态性肽结合位点使其可在APC细胞表面呈递不同排列的短肽片段。
可溶性TCRs不仅可用于研究特异的TCR-pMHC相互作用，也可用作检测感染或检测自身免疫性疾病标志的潜在诊断工具。可溶性TCRs也可用于染色，例如将细胞染色以确定在MHC中呈现的特异肽抗原的存在。类似地，可溶性TCRs可用于将治疗剂如细胞毒素化合物或免疫刺激性化合物递送到呈递特异抗原的细胞。可溶性TCRs也可用于抑制T细胞，例如，抑制那些与自身免疫性肽抗原反应的细胞。
由于在许多情形下，蛋白质的跨膜区域稳定蛋白质，因此可能很难以可溶形式生成由多于一个多肽亚单位组成且具有跨膜结构域的蛋白质。对TCR而言也是如此，这在科学文献中有所体现，所述文献描述了截短形式的TCR，其仅含有胞外结构域或含有胞外结构域和胞浆结构域，可被TCR特异的抗体识别(表明由抗体识别的重组TCR部分已正确折叠)，但其不能以高产量生成且在低浓度时不稳定和/或不能识别MHC-肽复合体。WO99/60120对此文献进行了评述。
许多论文描述了具有连接各亚单位的天然二硫桥的TCR异源二聚体的产生(Garboczi等，(1996)，自然(Nature)384(6605)134-41；Garboczi等，(1996)，免疫学杂志(J Immunol)157(12)5403-10；Chang等，(1994)，PNAS USA 9111408-11412；Davodeau等，(1993)，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)268(21)15455-15460；Golden等，(1997)，免疫学方法杂志(J.Imm.Meth.)206163-169；美国专利6080840号)。但是，尽管此类TCRs可由TCR特异的抗体识别，但其仅能在相对高的浓度下显示出对天然配体的识别且/或不稳定。
在WO 99/60120中，描述的可溶性TCR经过正确折叠以使其能够识别其天然配体，经过一段时间后仍稳定，且可以可观的数量产生。该TCR包含的TCRα或γ链的胞外结构域分别与TCRβ或δ链的胞外结构域二聚化，所述二聚化通过一对C-末端二聚化肽例如亮氨酸拉链实现。生成TCRs的该策略通常可应用于所有TCRs中。
Reiter等，免疫学(Immunity)，1995，2281-287中详细说明了包含二硫键稳定的TCRα和β可变结构域的可溶性分子的构建，其中的一个可变结构域与截短形式的假单胞菌外毒素(PE38)连接。产生该分子的一个原因是为了克服单链TCRs固有的不稳定性。TCR可变结构域内已前期导入的新二硫键的位置通过与抗体可变结构域的同源性得以鉴定(例如参见Brinkmann等(1993)，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)907538-7542，和Reiter等(1994)生物化学(Biochemistry)335451-5459)。但是，由于在抗体恒定结构域和TCR恒定结构域间不存在此类同源性，该技术不能用于鉴定TCR恒定结构域间新链间二硫键的合适位点。
鉴于可溶性TCRs的重要性，需要提供产生该分子的备选方法。
根据第一方面，本发明提供了可溶性T细胞受体(sTCR)，其包含(i)除其跨膜结构域外的全部或部分的TCRα链，以及(ii)除其跨膜结构域外的全部或部分的TCRβ链，其中(i)和(ii)中的每一链均包含TCR链的一功能性可变结构域和至少一部分的恒定结构域，并通过不存在于天然TCR的恒定结构域残基间的二硫键进行连接。
另一方面，本发明提供了可溶性αβ形式的T细胞受体(sTCR)，其中免疫球蛋白区α链恒定结构域的残基与免疫球蛋白区β链恒定结构域的残基通过共价二硫键连接。
本发明sTCRs的优点在于其不含异源多肽，所述异源多肽可能具有免疫原性或可导致TCR从体内快速清除。此外，本发明的TCRs的三维结构与其来源的天然TCRs结构非常类似，由于该结构类似性，本发明的TCRs产生免疫原性的可能性较低。根据本发明的sTCRs可用于识别I类MHC-肽复合体或II类MHC-肽复合体。
本发明的TCRs为可溶性。在此申请的上下文中，溶解性定义为TCR以1mg/ml浓度在磷酸盐缓冲液(PBS)(KCL 2.7mM、KH2PO41.5mM、NaCl137mM及Na2PO48mM，pH7.1-7.5.Life Technologies，Gibco BRL)中纯化为单分散二聚体形式的能力，且在25℃孵育1个小时后＞90％的该TCR仍保持为单分散二聚体形式。为评估TCR的溶解性，首先如实施例2中的描述进行纯化。纯化后，100μg的TCR通过分析用大小排阻色谱法进行分析，例如应用PBS平衡的Pharmacia Superdex 75 HR柱进行分析。另将100μg的TCR在25℃孵育1小时然后用如前的大小排阻色谱进行分析。然后通过积分法分析大小排阻图并比较与单分散异源二聚体对应的峰下面积。通过与已知分子量的蛋白质标准的洗脱位置进行比较可对相关峰进行鉴定。单分散异源二聚可溶性TCR的分子量约为50kDa。如以上所提及，本发明的TCRs为可溶的。但是，如在以下详细解释的，TCRs可与另一分子偶联以使产生的复合体为不溶的，或可呈现在不溶性固体支持物的表面。
此处应用的TCR氨基酸编号方式按照，T Cell Receptor Factsbook，2001，LeFranc & LeFranc，Academic Press一书中描述的IMGT系统。在此系统中，α链恒定结构域具有以下的符号TRAC*01，其中“TR”表示T细胞受体基因；“A”表示α链基因；C表示恒定区；且“*01”表示等位基因1。β链恒定结构域具有以下的符号TRBC1*01。在此例子中，存在两个可能的恒定区基因“C1”和“C2”。由每一等位基因编码而翻译的结构域可由来自几个外显子的遗传密码组成；因此它们也是特异的。根据其存在的特定结构域的外显子对氨基酸进行编号。
天然TCR的胞外部分由两条多肽(αβ或γδ)组成，每一条多肽均具有一近膜恒定结构域和一远膜可变结构域(参见

图1)。每一恒定和可变结构域均包括一链内二硫键。可变结构域包含类似于抗体互补决定区(CDRs)的高度多态性环。TCR的CDR3与MHC呈递的肽相互作用，且CDRs1和2与肽和MHC相互作用。TCR序列的多样性通过连接的可变基因(V)、多样性基因(D)、连接基因(J)和恒定基因的体细胞重排得以产生。经重排的V-J-C区形成功能性α链多肽，而β链由V-D-J-C区组成。胞外恒定结构域具有一近膜区和一免疫球蛋白区。近膜区由跨膜结构域和近膜的半胱氨酸残基间的氨基酸组成。恒定免疫球蛋白结构域由其余的恒定结构域氨基酸残基组成，其从近膜的半胱氨酸延伸至连接区的起始，且其特征在于存在免疫球蛋白型的折叠。存在一单独的α链恒定结构域，称作Cα1或TRAC*01，以及两个不同的β恒定结构域，称作Cβ1或TRBC1*01以及Cβ2或TRBC2*01。这些不同β恒定结构域间的差异与外显子1的4、5和37位氨基酸残基有关。因此，TRBC1*01在其外显子1中具有4N、5K和37，且TRBC2*01在其外显子1中具有4K、5N和37Y。每一TCR胞外结构域长度均存在一定程度的变化。
在本发明中，在位于各条链恒定结构域(或其部分)内的残基间导入二硫键。TCR的各条链中包含足够的能与pMHC复合体相互作用的可变结构域。此类相互作用可应用BIAcore 3000TM或BIAcore 2000TM仪器进行测定，如在此处的实施例3或在WO 99/6120中分别描述的。
在一实施方案中，本发明sTCR的各条链也包含其链内二硫键。本发明的TCR可包含各条TCR链的所有胞外恒定Ig区，且优选地包含各条链的所有胞外结构域，即包括近膜区。在天然TCR中，存在连接各条链的保守近膜区的二硫键。在本发明的一个实施方中，不存在该二硫键。可通过将适宜的半胱氨酸残基(分别来自TRAC*01基因外显子2的第4位氨基酸以及来自TRBC1*01和TRBC2*01基因的第2位氨基酸)突变为另一氨基酸或通过将相应链截短以使其不包括半胱氨酸残基来达到缺失二硫键的目的。根据本发明优选的可溶性TCR包含C末端截短的天然α和βTCR链，这样其不含可形成天然链间二硫键的半胱氨酸残基，即，在距半胱氨酸残基N末端1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个残基处截短。但应当指出，天然链间二硫键可存在于本发明的TCRs中，并且在某些实施例中，仅一条TCR链具有形成天然链间二硫键的天然半胱氨酸残基。该半胱氨酸用于将另外的分子与TCR连接。
但是，各条TCR链可更短。由于恒定结构域并不直接参与与肽-MHC配体的接触，因此可改变C末端的截短位点而基本不丧失其功能。
备选地，恒定结构域可存在大于此处优选的片段，即不需在紧挨着形成链间二硫键的半胱氨酸前截短恒定结构域。例如，可包括除跨膜结构域外的完整恒定结构域(即胞外和胞质结构域)。在此情况下将细胞TCR中形成链间二硫键的一个或多个半胱氨酸残基突变为不参与二硫键形成的另一氨基酸残基，或将这些残基中的一个或多个进行缺失，可能也是有利的。
如果在原核细胞(例如大肠杆菌)中表达可溶性TCR，可省略信号肽，这是因为信号肽在成熟TCR中对其配体结合能力不行使任何功能，并在一些情况下可阻止功能性可溶TCR的形成。多数情况下，信号肽从成熟TCR链移除的切割位点为预测得出而不是经实验确认的。对表达的TCR链进行操作，以使其在N末端具有略长或略短的氨基酸(例如约10个氨基酸)，这样的操作对可溶性TCR的功能(即识别pMHC的能力)并无显著的影响。可加入在原始蛋白质序列中并不存在的某些序列。例如，可加入有助于纯化TCR链的短标签序列，条件是该序列并不干扰TCR抗原结合位点的正确结构及正确折叠。
在大肠杆菌中表达时，可将蛋氨酸残基加到预测的成熟蛋白质序列的N末端起始位点，以启动翻译。
并非TCR链可变结构域中所有残基均对抗原特异性和功能性至关重要。因此，可在此结构域导入相当数量的突变而不影响抗原特异性和功能性。并非TCR链恒定结构域中所有残基均对抗原特异性和功能性至关重要。因此，可在此区域导入相当数量的突变而不影响抗原特异性。
TCRβ链含有一个在细胞或天然TCR中不配对的半胱氨酸残基。如果将此半胱氨酸残基移除或突变成另一残基以避免不正确的链内或链间配对时为优选。该半胱氨酸残基替换成另一残基，例如替换成丝氨酸或丙氨酸，可对体外折叠效率产生显著的正面影响。
可将各条链上的非半胱氨酸残基突变为半胱氨酸并引起突变残基间可形成二硫键。在天然TCR中，其相应β碳相距约6(0.6nm)或更小，且优选地在3.5(0.35nm)到5.9(0.59nm)范围内的残基是优选的，这样代替天然残基而导入的半胱氨酸残基间可形成二硫键。如果二硫键位于免疫球蛋白恒定区的残基间时为优选，尽管该键可能位于近膜区的残基间。可将半胱氨酸导入以形成二硫键的优选位点为以下TCRα链TRAC*01外显子1中的残基以及TCRβ链TRBC1*01或TRBC2*01中的残基TCRα链TCRβ链 天然β碳间隔(nm)Thr48 Ser570.473Thr45 Ser770.533Tyr10 Ser170.359Thr45 Asp590.560Ser15 Glu150.59本发明的一个sTCR源自A6 Tax TCR(Garboczi等，自然(Nature)，1996，384(6605)134-141)。在一实施方案中，sTCR包含的完整TCRα链为外显子2的N端、TRAC*01的残基4(根据Garboczi等应用的编号方式为α链的1-182位氨基酸残基)且包含的完整TCRβ链为外显子2的N端、TRBC1*01及TRBC2*01的残基2(根据Garboczi等应用的编号方式为β链的1-210位氨基酸残基)。为形成二硫键，TRAC*01外显子1的48位苏氨酸(根据Garboczi等应用的编号方式为α链的158位苏氨酸)以及TRBC1*01和TRBC2*01二者中外显子1的57位丝氨酸(根据Garboczi等应用的编号方式为β链的172位丝氨酸)可各自突变为半胱氨酸。这些氨基酸分别位于α和βTCR链恒定结构域的β链D。
需指出的是，图3a和3b中的残基1(根据Garboczi等应用的编号方式)分别为K和N。N末端蛋氨酸残基并不存在于天然A6 Tax TCR中，且如上所提及，当相关链在细菌表达系统中产生时有时可存在N末端蛋氨酸残基。
由于已鉴定出人类TCRs中可突变成半胱氨酸残基用以形成新链间二硫键的残基，本领域内的技术人员将能够以相同的方法突变任何的TCR以产生具有新链间二硫键的该TCR的可溶性形式。在人类，技术人员仅需要在相应TCR链中寻找以下的基序以确定出待突变的残基(阴影处的残基为用以突变成半胱氨酸的残基)α链Thr 48DSDVYITDK VLDMRSMDFK(TRAC*01基因外显子1的39-58位氨基酸)α链Thr45QSKDSDVYI DKTVLDMRSM(TRAC*01基因外显子1的36-55位氨基酸)α链Tyr10DIQNPDPAV QLRDSKSSDK(TRAC*01基因外显子1的1-20位氨基酸)α链Ser15DPAVYQLRD KSSDKSVCLF(TRAC*01基因外显子1的6-25位氨基酸)β链Ser57NGKEVHSGV TDPQPLKEQP(TRBC1*01和TRBC2*01基因外显子1的48-67位氨基酸)
β链Ser77ALNDSRYAL SRLRVSATFW(TRBC1*01和TRBC2*01基因外显子1的68-87位氨基酸)β链Ser17PPEVAVFEP EAEISHTQKA(TRBC1*01和TRBC2*01基因外显子1的8-27位氨基酸)β链Asp59KEVHSGVST PQPLKEQPAL(TRBC1*01和TRBC2*01基因外显子1的50-69位氨基酸)β链Glu15VFPPEVAVF PSEAEISHTQ(TRBC1*01和TRBC2*01基因外显子1的6-25位氨基酸)在其他物种中，TCR链可能并不具有与以上基序100％相同的区域。但是，本领域内的技术人员将能够应用以上的基序鉴定出TCRα或β链的等同部分并因此鉴定出待突变成半胱氨酸的残基。比对技术可用于此方面。例如，可在欧洲生物信息学学院网站(http//www.ebi.ac.uk/index.html)获得的ClustalW可用于将以上的基序与特定TCR链序列进行比较以定位用于TCR序列突变的相应部分。
本发明在其范围内包括人的二硫键连接的αβTCRs，以及其他哺乳动物的二硫键连接的αβTCRs，所述其他哺乳动物包括但不限于小鼠、大鼠、猪、山羊和绵羊。如以上所提及，本领域内的技术人员将能够确定与以上描述的人的位点相当的可导入半胱氨酸残基以形成链间二硫键的位点。例如，以下显示了小鼠Cα和Cβ可溶性结构域的氨基酸序列，以及显示了具有与以上提及的人的残基相当的鼠残基的基序，所述鼠残基可突变为半胱氨酸以形成TCR链间二硫键(其中相关残基以阴影显示)小鼠Cα可溶性结构域PYIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKTVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVP小鼠Cβ可溶性结构域EDLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGREVHSGVSTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRAD
人α链Thr48的鼠等同物ESGTFITDK VLDMKAMDSK人α链Thr45的鼠等同物KTMESGTFI DKTVLDMKAM人α链Tyr10的鼠等同物YIQNPEPAV QLKDPRSQDS人α链Ser15的鼠等同物AVYQLKDPR QDSTLCLFTD人β链Ser57的鼠等同物NGREVHSGV TDPQAYKESN人β链Ser77的鼠等同物KESNYSYCL SRLRVSATFW人β链Ser17的鼠等同物PPKVSLFEP KAEIANKQKA人β链Asp59的鼠等同物REVHSGVST PQAYKESNYS人β链Glu15的鼠等同物VTPPKVSLF PSKAEIANKQ在本发明优选的实施方案中，TCR的(i)和(ii)的每一链包含的第一TCR的功能可变结构域与第二TCR的全部或部分的恒定结构域融合，其中所述第一和第二TCRs来自相同物种且链间二硫键存在于该相关的全部或部分恒定结构域的残基间而不存在于天然TCR中。在一实施方案中，第一和第二TCRs来自人类。换言之，二硫键连接的恒定结构域充当可变结构域与之融合的构架。产生的TCR与第一TCR来源的天然TCR基本相同。该系统使得任何功能可变结构域可在稳定的恒定结构域构架上容易地进行表达。
以上描述的A6 Tax sTCR的恒定结构域，或甚至具有以上描述的新链间二硫键的任何突变αβTCRs的恒定结构域，均可用作异源可变结构域的融合构架。如果融合蛋白质保留尽可能多的异源可变结构域的构象为优选。因此，优选地，异源可变结构域在对恒定结构域导入的半胱氨酸残基和恒定结构域N末端间的任何位点与恒定结构域连接。对于A6 Tax TCR，α和β链上导入的半胱氨酸残基优选地分别位于TRAC*01外显子1的48位苏氨酸(根据Garboczi等应用的编号方式为α链的158位苏氨酸)及TRBC1*01和TRBC2*01两者的外显子1的57位丝氨酸(根据Garboczi等应用的编号方式为β链的172位丝氨酸)。因此如果异源α和β链可变结构域连接位点分别位于α或β恒定结构域的48位残基(根据Garboczi等应用的编号方式为159位)或58位残基(根据Garboczi等应用的编号方式为173位)和α和β恒定结构域的N末端之间为优选。
可通过序列同源性鉴定出异源α和β链的恒定结构域中与A6 Tax TCR中连接位点对应的残基。构建的融合蛋白质优选地包括从N末端到连接点的所有异源序列。
如在以下更为详细说明的，本发明的sTCR可在其C或N末端与另外的分子衍生化或融合。优选地为C末端，因为其位于结合结构域的远端。在一实施方案中，一条或两条TCR链在其C和/或N末端具有可与该另一分子融合的半胱氨酸残基。
本发明的可溶性TCR(优选地为人)可以相当纯化的形式提供，或以纯化的或分离的制备物提供。例如，可以基本不含其他蛋白质的形式提供。
本发明的多个可溶性TCRs可以多价复合体的形式提供。因此，本发明的一个方面中提供了多价T细胞受体(TCR)复合体，其包含此处描述的多个可溶性T细胞受体。优选地多个可溶性TCRs中的每一个均相同。
在另一方面，本发明提供了用于检测MHC-肽复合体的方法，该方法包括(i)提供如此处描述的可溶性T细胞受体或多价T细胞受体复合体；(ii)将可溶性T细胞受体或多价TCR复合体与MHC-肽复合体接触；以及(iii)检测可溶性T细胞受体或TCR复合体与MHC-肽复合体的结合。
在本发明的多价复合体中，TCRs可为多聚体形式，和/或可呈现在脂双分子层上或与之相连，所述脂双分子层如脂质体。
在其最简单的形式中，根据本发明的多价TCR复合体包含两个、三个、四个或更多个与另一分子相连的T细胞受体分子(例如共价或其他形式连接)，所述相连优选地通过接头分子实现。适宜的接头分子包括但不限于多价连接分子，例如亲和素、链亲和素、neutravidin和extravidin，其中的每一个均具有四个生物素结合位点。这样，生物素化TCR分子可用于形成具有多个TCR结合位点的T细胞受体多聚体。多聚体中TCR分子的数目将取决于与用于形成多聚体的连接分子数量相关的TCR的数量，并且也取决于任何其他生物素化分子的存在或缺失。优选的多聚体为二聚体、三聚体或四聚体TCR复合体。
较TCR四聚体大出许多的结构可用于跟踪或靶向表达特异MHC-肽复合体的细胞。优选地，所述结构的直径在10nm到10μm的范围内。每一结构可在足够远的距离间隔呈现多个TCR分子，其中所述间隔使结构上的两个或更多的TCR分子同时与细胞上的两个或更多的MHC-肽复合体结合，并因此提高了多聚体结合部分与细胞的亲和力。
用于本发明的适宜结构包括膜结构(例如脂质体)和固体结构，所述固体结构优选地为颗粒如珠，例如乳胶珠。可在外表包被有T细胞受体分子的其他结构也是适宜的。优选地，所述结构包被以T细胞受体多聚体而不是单个的T细胞受体分子。
在为脂质体的情况下，T细胞受体分子或其多聚体可吸附到或连接到膜上。用于此的技术为本领域内的技术人员公知。
标记或另一分子，例如毒性的或治疗性的部分，可包括在本发明的多价TCR复合体中。例如，标记或其他部分可包括在混合的分子多聚体内。该多聚体分子的实例为含三个TCR分子和一个过氧化物酶分子的四聚体。可通过将TCR和酶以3∶1的摩尔比混合以产生四聚体复合体，并将所需的复合体从不含正确比例分子的任何复合体中分离出来而获得该四聚体。如果位阻未妨碍或未显著妨碍分子所需的功能，这些混合分子可含有分子的任何组合。链亲和素分子上结合位点的定位适于混合的四聚体，这是由于其不大可能产生位阻。
生物素化TCR的备选方法也是可能的。例如可应用化学生物素化。可应用备选的生物素化标签，尽管生物素标签序列中的某些氨基酸是必需的(Schatz，(1993).Biotechnology N Y 11(10)1138-43)。用于生物素化混合物也是多样的。酶需要Mg-ATP和低离子强度，尽管这两个条件均可改变，例如应用较高的离子强度和较长的反应时间也是可能的。也可应用亲和素或链亲和素之外的分子来形成TCR的多聚体。以多价形式结合生物素的任何分子均是适宜的。备选地，可设计完全不同的连接，例如多聚组氨酸标签与镍离子螯合的连接(Quiagen产品指南1999(Quiagen Product Guide1999)，第3章，“蛋白质表达、纯化、检测和试验”(“Protein Expression，Purification，Detection and Assay”)，35-37页)。优选地，标签定位于接近蛋白质的C末端以在与肽-MHC复合体相互作用时将位阻程度减至最小。
TCR链的一条或两条可用可检测标记物进行标记，例如用适于诊断目的的标记物标记。这样，本发明提供了用于检测MHC-肽复合体的方法，该方法包括将MHC-肽复合体与MHC-肽复合体特异的本发明TCR或多聚体TCR接触；以及检测TCR或多聚体TCR复合体与MHC-肽复合体的结合。在应用生物素化异源二聚体形成的四聚体TCR中，可应用荧光链亲和素(可商业提供)以提供可检测的标记物。荧光标记的四聚体适用于FACS分析，例如用来检测携带TCR特异的肽的抗原呈递细胞。
可检测本发明可溶性TCRs的另一方法是应用TCR特异的抗体，特别是单克隆抗体。有许多商售的抗TCR抗体，例如分别识别α和β链恒定区的αF1和βF1。
本发明的TCR(或其多价复合体)可备选地或另外地与治疗剂或免疫刺激剂连接(例如以共价或以其他形式连接)，所述治疗剂为如用于杀伤细胞的有毒部分，所述免疫刺激剂如白细胞介素或细胞因子。与非多聚体的T细胞受体异源二聚体相比，本发明的多价TCR复合体也可提高对pMHC的结合能力。因此，本发明的多价TCR复合体特别用于示踪或靶向体外或体内呈递特定抗原的细胞，且也用作产生具有此功用的进一步的多价TCR复合体的中间体。因此TCR或多价TCR复合体可以体内应用的可药用制剂形式提供。
本发明也提供了用于将治疗剂递送到靶细胞的方法，该方法包括将潜在靶细胞与本发明的TCR或多价TCR复合体在允许TCR或多价TCR复合体与靶细胞结合的条件下进行接触，其中所述TCR或多价TCR复合体为MHC-肽复合体特异的并具有与其相连的治疗剂。
特别是，可溶性TCR或多价TCR复合体也可用于将治疗剂递送到呈递特定抗原的细胞所在的位置。这可用于多种情形，且特别地用于抗肿瘤。可递送治疗剂，这样使治疗剂不仅仅是作用于与其结合的细胞而且可在局部发挥作用。这样，一个具体的策略正是设计为将抗肿瘤分子与肿瘤抗原特异的T细胞受体或多价TCR复合体连接。
许多治疗剂可用于此用途，例如放射性化合物、酶(例如穿孔素)或化疗剂(例如顺铂)。为确保毒性作用仅在所需的位置发生，可将毒素包括在与链亲和素连接的脂质体内以使化合物缓慢释放。这样可防止在体内运输过程中的破坏作用并保证TCR与相关的抗原呈递细胞结合后毒素具有最大的功效。
其他的治疗剂包括●小分子细胞毒试剂，即具有杀伤哺乳动物细胞能力且分子量小于700道尔顿的化合物。此类化合物也可含有具有细胞毒作用的有毒金属。此外，应理解这些小分子细胞毒剂也包括前体药物，即，在生理条件下分解或转化以释放细胞毒剂的化合物。此类细胞毒剂的示例包括顺铂、美登素衍生物、rachelmycin、卡奇霉素(calicheamicin)、泰索帝(docetaxel)、依托泊苷、吉西他滨(gemcitabine)、异环磷酰胺、伊立替康(irinotecan)、苯丙氨酸氮芥、米托蒽醌、卟吩姆钠(sorfimer sodium)(光敏素II)、替莫唑胺(temozolmide)、托泊替堪、曲美沙特葡糖醛酸、auristatin E、长春新碱和阿霉素；●肽细胞毒素，即具有杀伤哺乳动物细胞能力的蛋白质或其片段。示例包括蓖麻毒素、白喉毒素、假单胞菌外毒素A、DNAase和RNAase；●放射性核素，即，同时放射一种或多种α或β粒子或γ射线而衰减的元素的不稳定同位素。示例包括碘131、铼186、铟111、钇90、铋210和213、锕225和砹213；●前体药物，例如抗体定向的酶前体药物；●免疫刺激物，即，刺激免疫反应的分子。示例包括细胞因子如IL-2、趋化因子如IL-8、血小板因子4、黑素瘤生长刺激蛋白等、抗体或其片段、补体活化剂、异基因蛋白结构域、同种异体蛋白结构域、病毒/细菌蛋白结构域和病毒/细菌肽。
本发明的可溶性TCRs或多价TCR复合体可与能够将前体药物转化为药物的酶连接。这样前体药物仅在需要其的位点(即由sTCR靶向)转化为药物。
本发明TCR的适宜MHC-多肽靶的示例包括但不限于病毒抗原表位，例如HTLV-1表位(例如HLA-A2限制的Tax肽；HTLV-1与白血病有关)、HIV表位、EBV表位、CMV表位；黑素瘤表位(例如MAGE-1 HLA-A1限制性的表位)和其他癌症特异的表位(例如HLA-A2限制的肾细胞癌相关抗原G250)；以及与自身免疫紊乱例如类风湿性关节炎有关的表位。适用于本发明的其它疾病相关的pMHC靶在HLA Factbook(Barclay(编辑)Academic Press)中列出，且其他的许多靶正在进行鉴定。
通过可溶性TCRs的特异性将药物定位可潜在地提高多种疾病的治疗效果。
对于已存在药物的病毒性疾病，例如HIV、SIV、EBV、CMV，药物在感染细胞区域附近释放或激活也是有益的。对于癌症，定位于肿瘤或转移癌的附近可提高毒素或免疫刺激物的效果。在自身免疫病中，可缓慢释放免疫抑制药，使其在更长的时间范围内产生更多的局部效果而对受试者的整体免疫能力的影响减至最小。在防止移植排斥中，可以同样的方式优化免疫抑制药的作用。对于疫苗递送，可将疫苗抗原定位在抗原呈递细胞附近，由此提高抗原的功效。本方法也可用于成象目的。
本发明的可溶性TCRs可用于调节T细胞激活，前者通过结合特异的pMHC并由此抑制T细胞活化。涉及T细胞介导的炎症和/或组织损伤的自身免疫病可适于此方法，例如I型糖尿病。用于此应用时需要知道由相关pMHC呈递的特异肽表位。
根据本发明的药物通常以无菌药物组合物的部分提供，一般包括可药用载体。该药物组合物可为任何的适宜形式，(依赖于给患者施用所需的方法)。可以单位剂型提供，通常在密封的容器内提供且可为药盒的一部分提供。此类药盒一般(尽管并非必需)包括使用说明书。药盒可包括多个该剂量单位形式。
药物组合物可适合任何适宜的施用途径，例如经口(包括口腔或舌下)、直肠、鼻腔、局部(包括口腔、舌下或经皮)、阴道或肠胃外(包括皮下、肌肉、静脉内或皮内)途径。此类组合物可通过制药领域已知的任何方法制备，例如通过在无菌条件下将活性成分与载体或赋形剂混合而制备。
适于经口施用的药物组合物可以分立的单位剂型提供，例如胶囊剂或片剂；粉剂或颗粒剂；溶液、糖浆或悬液(在含水或不含水溶液中；或可食用泡沫；或乳剂)。片剂或硬明胶胶囊的适宜赋形剂包括乳糖、玉米淀粉或其衍生物、硬脂酸或其盐。用于软明胶胶囊的适宜赋形剂包括植物油、蜡、脂肪、半固态或液态多元醇等。
制备溶液和糖浆时，可应用的赋形剂包括如水、多元醇和糖。制备悬液时，可应用油(例如植物油)以提供水包油或油包水悬液。适合经皮施用的药物组合物可为分开的贴剂，意在保持与接受者表皮长时间密切接触。例如，可通过离子电渗法从贴剂递送活性成分，基本如在药物研究(Pharmaceutical Research)，3(6)318(1986)中描述的。适合局部施用的药物组合物可以制剂为药膏、霜剂、悬液、洗液、粉剂、溶液剂、糊剂、凝胶剂、喷雾剂、气雾剂或油。用于眼或其他外部组织例如口或皮肤的感染时，组合物优选地以药膏或霜剂形式局部施用。当以药膏形式制剂时，活性成分可用石蜡或水混溶的药膏基质进行施用。备选地，活性成分可用水包油基质或油包水基质制成霜剂。适合眼局部施用的药物组合物包括眼药滴，其中活性成分溶解或悬浮在适宜的载体内，特别是在含水溶剂中。适合口的局部施用的药物组合物包括糖锭、锭剂和洗口液。
适合直肠施用的药物组合物可以栓剂或灌肠剂形式呈现。载体为固体的适合鼻腔施用的药物组合物包括例如粒度在20到500μm范围内的粗粉，其施用以吸气方式进行，即通过接近鼻的药粉容器通过鼻通道快速吸入。载体为液体的例如以鼻喷雾剂或滴鼻剂施用的适宜组合物包括活性成分的水性或油性溶液。适合吸入施用的药物组合物包括细粒粉末或雾，所述粉末或雾可通过多种类型的计量剂量的加压气雾器、喷雾器或粉末喷射器产生。适合阴道施用的药物组合物可以阴道栓剂、棉塞、霜剂、凝胶、糊剂、泡沫或喷雾剂形式呈现。适合肠胃外施用的药物组合物包括水性和非水性无菌注射液，所述注射液可包含抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂和使制剂与目的接受患者的血液基本等渗的溶质；以及水性和非水性无菌悬液，其可包括悬浮剂和增稠剂。可用于注射液的赋形剂包括，例如水、醇类、多元醇、甘油和植物油。组合物可以单剂量或多剂量的容器呈现，例如密封的安瓿和小瓶，且可以冷冻干燥(冻干)状况储存，在使用前仅需要加入无菌液体例如立即加入水用于注射。可用无菌粉末、颗粒和片剂制备临时注射液和悬液。
药物组合物可含有防腐剂、增溶剂、稳定剂、加湿剂、乳化剂、甜味剂、着色剂、增味剂、盐(本发明的物质自身可以可药用盐的形式提供)、缓冲剂、包衣剂或抗氧化剂。除了本发明的物质，组合物也可含治疗活性剂。
本发明物质的剂量可根据治疗的疾病或紊乱、待治疗个体的年龄和状况等在很宽的范围内变化，且医生将最终决定应用的适宜剂量。可根据需要重复使用剂量。根据常规临床实践，如出现副作用，可减少剂量的数量和/或频率。
可应用基因克隆技术提供本发明的sTCR，所述sTCR优选地为相当纯的形式。已公开了这些技术，如J.Sambrook等，分子克隆(MolecularCloning)，第二版，冷泉港出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)(1989)。因此，在进一步的方面中，本发明提供了包含编码本发明可溶性TCR链的序列或其互补序列的核酸分子。可通过从T细胞克隆中分离编码TCR的核酸并进行适宜的突变(通过插入、缺失或替换)获得该核酸序列。
核酸分子可为分离或重组形式。核酸分子可导入载体且载体可导入宿主细胞。而该载体和适宜宿主构成了本发明进一步的方面。
本发明也提供了用于获得TCR链的方法，该方法包含将宿主细胞在导致TCR链表达的条件下孵育以及随后对多肽的纯化。
可通过在细菌如大肠杆菌中以包涵体形式表达以及随后的体外重折叠来获得本发明的可溶性TCRs。
TCR链的重折叠可在适宜的重折叠条件下于体外进行。在一特定实施方案中，通过在重折叠缓冲液中重折叠溶解的TCR链获得具有正确构象的TCR，所述缓冲液包含溶解剂如尿素。有利地是，尿素的浓度可为至少0.1M、至少1M、至少2.5M或约5M。可应用的备选溶解剂为胍，其浓度在0.1M和8M之间，优选地为至少1M或至少2.5M。在重折叠前优选地应用还原剂以保证半胱氨酸残基彻底还原。如需要可应用进一步的变性剂如DTT和胍。重折叠步骤前可应用不同的变性和还原试剂(例如尿素、β-巯基乙醇)。在重折叠过程中可应用备选的氧化还原偶，例如胱胺/半胱胺氧化还原偶、DTT或β-巯基乙醇/大气氧以及以还原和氧化形式的半胱氨酸。
通过将某些其它蛋白质成分(例如伴侣蛋白)加入到重折叠混合物中也可提高折叠效率。将蛋白质通过固定有小伴侣分子的柱可获得折叠效率的提高(Altamirano等(1999)自然生物技术(Nature Biotechnology)17187-191；Altamirano等(1997)美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad Sci USA)94(8)3576-8)。
备选地，可通过在真核细胞系统中表达以获得本发明的可溶性TCR，所述细胞如昆虫细胞。
可通过多种不同的方法对TCR进行纯化。可应用离子交换的备选模式，或可应用蛋白质纯化的其他模式，例如凝胶过滤层析或亲和层析。
本发明的可溶性TCRs和多价TCR复合体也可用于筛选具有抑制TCR与其pMHC复合体结合的能力的试剂，例如小化学化合物。这样，在一进一步的方面中，本发明提供了用于筛选抑制T细胞受体与肽-MHC复合体结合的试剂的方法，其包括监测在试剂存在条件下本发明可溶性T细胞受体与肽-MHC复合体的结合，以及选择抑制该结合的试剂。
用于此筛选方法的适宜技术包括在WO 01/22084中描述的基于表面胞质共振的方法。可构成该筛选方法基础的其他公知技术为闪烁邻近分析(SPA)和扩大发光邻近试验(Amplified Luminescent Proximity Assay)。
通过本发明筛选方法选择的试剂可用作药物，或可用作药物开发计划的基础，通过修饰或其他改进以使其获得更适于作为药物施用的特征。该药物可用于治疗这样的疾病，所述疾病包括不需要的T细胞反应组份。所述疾病包括癌症(例如肾癌、卵巢癌、头和颈癌、睾丸癌、肺癌、胃癌、子宫颈癌、膀胱癌、前列腺癌或黑素瘤)、自身免疫病、移植排斥和移植物抗宿主病。
本发明每一方面的优选特征也用于已作必要修正的每一其他方面。此处提及的现有的本领域内文献通过法律允许全文于此引用。
实施例本发明在以下实施例中进一步描述，所述实施例不以任何方式限制本发明的范围。
以下为参照附图的说明，其中图1为本发明的具有导入的链间二硫键的可溶性TCR的示意性图表；图2a和2b分别显示可溶性A6 TCR的α和β链的核酸序列，所述序列经过突变以导入半胱氨酸密码子。阴影处表示导入的半胱氨酸密码子；图3a显示A6 TCRα链的胞外氨基酸序列，其包括用以产生新链间二硫键的T48→C突变(下划线处)，且图3b显示A6 TCRβ链的胞外氨基酸序列，其包括用以产生新链间二硫键的S57→C突变(下划线处)；图4为可溶性A6 TCR阴离子交换层析后获得的曲线图，显示了应用以点线表示的0-500mM NaCl梯度从POROS 50HQ柱进行的蛋白质洗脱；图5-A.在图4中所过柱的级分的还原SDS-PAGE(考马斯染色)，如所示。B.在图4中所过柱的级分的非还原SDS-PAGE(考马斯染色)，如所示。峰1主要包含非二硫键连接的β-链，峰2包含链间二硫键连接的TCR异源二聚体，且肩峰的出现是由于与链间二硫键连接的sTCR混合的大肠杆菌污染物，该污染物在此操作中几乎不可见；图6为图5中峰1收集的合并级分进行的大小排阻层析获得的曲线图。蛋白质洗脱为单一主峰，与异源二聚体对应；
图7为二硫键连接的A6可溶性TCR与HLA-A2-tax复合体特异结合的BIAcore反应曲线。插入图显示与单独注射二硫键连接的A6可溶性TCR的对照进行比较的结合反应；图8a显示包含新半胱氨酸残基的A6 TCRα链序列，对其进行突变以导入一BamH1限制性位点。阴影指出形成BamH1限制性位点所导入的突变。图8b和8c显示突变的JM22 TCR的α和β链的DNA序列，所述序列经过突变以包括额外的半胱氨酸残基用以形成非天然二硫键；图9a和9b分别显示由图8a和8b的DNA序列产生的JM22 TCRα和β链的胞外氨基酸序列；图10为可溶性二硫键连接的JM22 TCR经阴离子交换层析后获得的曲线图，显示应用以点线表示的0-500mM NaCl梯度从POROS 50HQ柱进行的蛋白质洗脱；图11a显示在图10中所过柱的级分的还原SDS-PAGE(考马斯染色)，如所示，且图11b显示在图10中所过柱的级分的非还原SDS-PAGE(考马斯染色)，如所示。峰1明确地包含经链间二硫键连接的TCR异源二聚体。
图12为图10中峰1收集的合并级分的大小排阻层析获得的曲线图。蛋白质洗脱为单一主峰，与异源二聚体对应。产率为80％；图13-A.二硫键连接的JM22可溶性TCR与HLA-Flu复合体特异结合的BIAcore反应曲线。B，与单独注射二硫键连接的JM22可溶性TCR的对照进行比较的结合反应；图14a和14b显示经突变的NY-ESO TCRα和β链的DNA序列，序列经过突变以包含额外的半胱氨酸残基用以形成非天然二硫键；图15a和15b分别显示由图14a和14b的DNA序列产生的NY-ESOTCR的α和β链胞外氨基酸序列；图16为二硫键连接的可溶性NY-ESO TCR经阴离子交换层析后获得的曲线图，显示了应用以点线表示的0-500mM NaCl梯度从POROS 50HQ柱进行的蛋白质洗脱；图17-A.显示在图16中所过柱的级分的还原SDS-PAGE(考马斯染色)，如所示。B显示在图16中所过柱的级分的非还原SDS-PAGE(考马斯染色)，如所示。峰1和峰2明确地包含经链间二硫键连接的TCR异源二聚体；图18.为图17中峰1和峰2收集的合并级分的大小排阻层析获得的曲线图。蛋白质洗脱为单一主峰，与异源二聚体对应；图19显示二硫键连接的可溶性NY-ESO TCR与HLA-NYESO复合体特异结合的BIAcore反应曲线。A.峰1，B.峰2；图20a和20b分别显示突变的可溶性NY-ESO TCR的α和β链的DNA序列，序列经过突变以导入新的半胱氨酸密码子(以阴影显示)。序列包括参与天然链间二硫键形成的半胱氨酸(密码子以黑体显示)；图21a和21b分别显示由图20a和21b的DNA序列产生的NY-ESOTCRα和β链的胞外氨基酸序列；图22显示可溶性NY-ESO TCRαcysβcys经阴离子交换层析获得的曲线图，显示了应用以点线表示的0-500mM NaCl梯度从POROS 50HQ柱进行的蛋白质洗脱；图23显示可溶性NY-ESO TCRαcys经阴离子交换层析获得的曲线图，显示了应用以点线表示的0-500mM NaCl梯度从POROS 50HQ柱进行的蛋白质洗脱；图24显示可溶性NY-ESO TCRβcys经阴离子交换层析获得的曲线图，显示了应用以点线表示的0-500mM NaCl梯度从POROS 50HQ柱进行的蛋白质洗脱；图25分别显示在图22-24中经过阴离子交换柱的NY-ESO TCRαcysβcys、TCRαcys和TCRβcys级分的还原SDS-PAGE(考马斯染色)。1泳道和7泳道为MW标记物，2泳道为NYESOdsTCR1g4α-cysβ峰(EB/084/033)；3泳道为NYESOdsTCR1g4α-cysβ小峰(EB/084/033)，4泳道为NYESOdsTCR1g4αβ-cys(EB/084/034)，5泳道为NYESOdsTCR1g4α-cysβ-cys小峰(EB/084/035)，且6泳道为NYESOdsTCR1g4α-cysβ-cys峰(EB/084/035)；
图26分别显示在图22-24中经过阴离子交换柱的NY-ESO TCRαcysβcys、TCRαcys和TCRβcys级分的非还原SDS-PAGE(考马斯染色)。1泳道和7泳道为MW标记物，2泳道为NYESOdsTCR1g4α-cysβ峰(EB/084/033)；3泳道为NYESOdsTCR1g4α-cysβ小峰(EB/084/033)，4泳道为NYESOdsTCR1g4αβ-cys(EB/084/034)，5泳道为NYESOdsTCR1g4α-cysβ-cys小峰(EB/084/035)，且6泳道为NYESOdsTCR1g4α-cysβ-cys峰(EB/084/035)；图27为可溶性NY-ESO TCRαcysβcys经大小排阻交换层析获得的曲线图，显示了图22收集的合并级分的蛋白质洗脱。蛋白质洗脱为单一主峰，与异源二聚体对应；图28为可溶性NY-ESO TCRαcys经大小排阻交换层析获得的曲线图，显示了图22收集的合并级分的蛋白质洗脱。蛋白质洗脱为单一主峰，与异源二聚体对应；图29为可溶性NY-ESO TCRβcys经大小排阻交换层析获得的曲线图，显示了图22收集的合并级分的蛋白质洗脱。蛋白质洗脱为单一主峰，与异源二聚体对应；图30为NY-ESO TCRαcysβcys与HLA-NY-ESO复合体特异结合的BIAcore反应曲线；图31为NY-ESO TCRαcys与HLA-NY-ESO复合体特异结合的BIAcore反应曲线；图32为NY-ESO TCRβcys与HLA-NY-ESO复合体特异结合的BIAcore反应曲线；图33a和33b分别显示突变的可溶性AH-1.23 TCR的α和β链的DNA序列，所述序列经过突变以导入新的半胱氨酸密码子(以阴影显示)。序列包括参与形成天然链间二硫键的半胱氨酸(密码子以黑体显示)；图34a和34b分别显示由图33a和33b的DNA序列产生的AH-1.23TCRα和β链的胞外氨基酸序列；图35为可溶性AH-1.23 TCR经阴离子交换层析获得的曲线图，显示了应用以点线表示的0-500mM NaCl梯度从POROS 50HQ柱进行的蛋白质洗脱；图36为在图35中过柱的AH-1.23 TCR级分的还原SDS-PAGE(10％Bis-Tris胶，考马斯染色)。所测试的蛋白质为来自重折叠3的TCR 1.23S-S阴离子交换级分。1泳道为MW标记物，2泳道为B4，3泳道为C2，4泳道为C3，5泳道为C4，6泳道为C5，7泳道为C6，8泳道为C7，9泳道为C8且10泳道为C9；图37为在图35中过柱的AH-1.23 TCR级分的非还原SDS-PAGE(10％Bis-Tris胶，考马斯染色)。所测试的蛋白质为来自重折叠3的TCR 1.23S-S的阴离子交换级分。1泳道为MW标志物，2泳道为B4，3泳道为C2，4泳道为C3，5泳道为C4，6泳道为C5，7泳道为C6，8泳道为C7，9泳道为C8且10泳道为C9；图38为可溶性AH-1.23 TCR的大小排阻交换层析获得的曲线图，显示了来自图35收集的合并级分的蛋白质洗脱。蛋白质洗脱为单一主峰，与异源二聚体对应；图39a和39b分别显示突变的可溶性A6 TCRα链的DNA和氨基酸序列，所述序列经过突变以在TRAC*01外显子1的48位残基处导入新的半胱氨酸。阴影处的核苷酸表示导入的新半胱氨酸密码子且下划线处的氨基酸表示导入的半胱氨酸；图40a和40b分别显示突变的可溶性A6 TCRα链的DNA和氨基酸序列，所述序列经过突变以在TRAC*01外显子1的45位残基处导入新的半胱氨酸。阴影处的核苷酸表示导入的新半胱氨酸密码子且下划线处的氨基酸表示导入的半胱氨酸；图41a和41b分别显示突变的可溶性A6 TCRα链的DNA和氨基酸序列，所述序列经过突变以在TRAC*01外显子1的61位残基处导入新半胱氨酸。阴影处的核苷酸表示导入的新半胱氨酸密码子且下划线处的氨基酸表示导入的半胱氨酸；图42a和42b分别显示突变的可溶性A6 TCRα链的DNA和氨基酸序列，所述序列经过突变以在TRAC*01外显子1的50位残基处导入新半胱氨酸。阴影处的核苷酸表示导入的新半胱氨酸密码子且下划线处的氨基酸表示导入的半胱氨酸；图43a和43b分别显示突变的可溶性A6 TCRα链的DNA和氨基酸序列，所述序列经过突变以在TRAC*01外显子1的10位残基处导入新半胱氨酸。阴影处的核苷酸表示导入的新半胱氨酸密码子且下划线处的氨基酸表示导入的半胱氨酸；图44a和44b分别显示突变的可溶性A6 TCRα链的DNA和氨基酸序列，所述序列经过突变以在TRAC*01外显子1的15位残基处导入新半胱氨酸。阴影处的核苷酸表示导入的新半胱氨酸密码子且下划线处的氨基酸表示导入的半胱氨酸；图45a和45b分别显示突变的可溶性A6 TCRα链的DNA和氨基酸序列，所述序列经过突变以在TRAC*01外显子1的12位残基处导入新半胱氨酸。阴影处的核苷酸表示导入的新半胱氨酸密码子且下划线处的氨基酸表示导入的半胱氨酸；图46a和46b分别显示突变的可溶性A6 TCRα链的DNA和氨基酸序列，所述序列经过突变以在TRAC*01外显子1的22位残基处导入新半胱氨酸。阴影处的核苷酸表示导入的新半胱氨酸密码子且下划线处的氨基酸表示导入的半胱氨酸；图47a和47b分别显示突变的可溶性A6 TCRα链的DNA和氨基酸序列，所述序列经过突变以在TRAC*01外显子1的52位残基处导入新半胱氨酸。阴影处的核苷酸表示导入的新半胱氨酸密码子且下划线处的氨基酸表示导入的半胱氨酸；图48a和48b分别显示突变的可溶性A6 TCRα链的DNA和氨基酸序列，所述序列经过突变以在TRAC*01外显子1的43位残基处导入新半胱氨酸。阴影处的核苷酸表示导入的新半胱氨酸密码子且下划线处的氨基酸表示导入的半胱氨酸；图49a和49b分别显示突变的可溶性A6 TCRα链的DNA和氨基酸序列，所述序列经过突变以在TRAC*01外显子1的57位残基处导入新半胱氨酸。阴影处的核苷酸表示导入的新半胱氨酸密码子且下划线处的氨基酸表示导入的半胱氨酸；图50a和50b分别显示突变的可溶性A6 TCRβ链的DNA和氨基酸序列，所述序列经过突变以在TRBC2*01外显子1的77位残基处导入新半胱氨酸。阴影处的核苷酸表示导入的新半胱氨酸密码子且下划线处的氨基酸表示导入的半胱氨酸；图51a和51b分别显示突变的可溶性A6 TCRβ链的DNA和氨基酸序列，所述序列经过突变以在TRBC2*01外显子1的17位残基处导入新半胱氨酸。阴影处的核苷酸表示导入的新半胱氨酸密码子且下划线处的氨基酸表示导入的半胱氨酸；图52a和52b分别显示突变的可溶性A6 TCRβ链的DNA和氨基酸序列，所述序列经过突变以在TRBC2*01外显子1的13位残基处导入新半胱氨酸。阴影处的核苷酸表示导入的新半胱氨酸密码子且下划线处的氨基酸表示导入的半胱氨酸；图53a和53b分别显示突变的可溶性A6 TCRβ链的DNA和氨基酸序列，所述序列经过突变以在TRBC2*01外显子1的59位残基处导入新半胱氨酸。阴影处的核苷酸表示导入的新半胱氨酸密码子且下划线处的氨基酸表示导入的半胱氨酸；图54a和54b分别显示突变的可溶性A6 TCRβ链的DNA和氨基酸序列，所述序列经过突变以在TRBC2*01外显子1的79位残基处导入新半胱氨酸。阴影处的核苷酸表示导入的新半胱氨酸密码子且下划线处的氨基酸表示导入的半胱氨酸；图55a和55b分别显示突变的可溶性A6 TCRβ链的DNA和氨基酸序列，所述序列经过突变以在TRBC2*01外显子1的14位残基处导入新半胱氨酸。阴影处的核苷酸表示导入的新半胱氨酸密码子且下划线处的氨基酸表示导入的半胱氨酸；图56a和56b分别显示突变的可溶性A6 TCRβ链的DNA和氨基酸序列，所述序列经过突变以在TRBC2*01外显子1的55位残基处导入新半胱氨酸。阴影处的核苷酸表示导入的新半胱氨酸密码子且下划线处的氨基酸表示导入的半胱氨酸；图57a和57b分别显示突变的可溶性A6 TCRβ链的DNA和氨基酸序列，所述序列经过突变以在TRBC2*01外显子1的63位残基处导入新半胱氨酸。阴影处的核苷酸表示导入的新半胱氨酸密码子且下划线处的氨基酸表示导入的半胱氨酸；图58a和58b分别显示突变的可溶性A6 TCRβ链的DNA和氨基酸序列，所述序列经过突变以在TRBC2*01外显子1的15位残基处导入新半胱氨酸。阴影处的核苷酸表示导入的新半胱氨酸密码子且下划线处的氨基酸表示导入的半胱氨酸；图59-64为可溶性A6 TCR经阴离子交换层析获得的曲线图，显示了应用以点线表示的0-500mM NaCl梯度从POROS 50柱进行的蛋白质洗脱，其中所述可溶性A6 TCR在以下残基间含有新链间二硫键分别为，TRAC*01外显子1的48位残基和TRBC2*01外显子1的57位残基；TRAC*01外显子1的45位残基和TRBC2*01外显子1的77位残基；TRAC*01外显子1的10位残基和TRBC2*01外显子1的17位残基；TRAC*01外显子1的45位残基和TRBC2*01外显子1的59位残基；TRAC*01外显子1的52位残基和TRBC2*01外显子1的55位残基；TRAC*01外显子1的15位残基和TRBC2*01外显子1的15位残基；图65a和65b分别为可溶性A6 TCR的还原和非还原SDS-PAGE(考马斯染色)，所述A6 TCR在TRAC*01外显子1的48位残基和TRBC2*01外显子1的57位残基间包含新链间二硫键，电泳的级分收集自图59中所过的阴离子交换柱；图66a和66b分别为可溶性A6 TCR的还原和非还原SDS-PAGE(考马斯染色)，所述A6 TCR在TRAC*01外显子1的45位残基和TRBC2*01外显子1的77位残基间包含新链间二硫键，电泳的级分收集自图60中所过的阴离子交换柱；
图67a和67b分别为可溶性A6 TCR的还原和非还原SDS-PAGE(考马斯染色)，所述A6 TCR在TRAC*01外显子1的10位残基和TRBC2*01外显子1的17位残基间包含新链间二硫键，电泳的级分收集自图61中所过的阴离子交换柱；图68a和68b分别为可溶性A6 TCR的还原和非还原SDS-PAGE(考马斯染色)，所述A6 TCR在TRAC*01外显子1的45位残基和TRBC2*01外显子1的59位残基间包含新链间二硫键，电泳的级分收集自图62中所过的阴离子交换柱；图69a和69b分别为可溶性A6 TCR的还原和非还原SDS-PAGE(考马斯染色)，所述A6 TCR在TRAC*01外显子1的52位残基和TRBC2*01外显子1的55位残基间包含新链间二硫键，电泳的级分收集自图63中所过的阴离子交换柱；图70a和70b分别为可溶性A6 TCR的还原和非还原SDS-PAGE(考马斯染色)，所述A6 TCR在TRAC*01外显子1的15位残基和TRBC2*01外显子1的15位残基间包含新链间二硫键，电泳的级分收集自图64中所过的阴离子交换柱；图71为可溶性A6 TCR经大小排阻层析获得的曲线图，所述A6 TCR在TRAC*01外显子1的48位残基和TRBC2*01外显子1的57位残基间含有新链间二硫键，该曲线图显示来自Superdex 200 HL凝胶过滤柱的蛋白质洗脱。运行的级分收集自图59中所过的阴离子交换柱；图72为可溶性A6 TCR经大小排阻层析获得的曲线图，所述A6 TCR在TRAC*01外显子1的45位残基和TRBC2*01外显子1的77位残基间含有新链间二硫键，该曲线图显示来自Superdex 200 HL凝胶过滤柱的蛋白质洗脱。运行的级分收集自图60中所过的阴离子交换柱子；图73为可溶性A6 TCR经大小排阻层析获得的曲线图，所述A6 TCR在TRAC*01外显子1的10位残基和TRBC2*01外显子1的17位残基间含有新链间二硫键，该曲线图显示来自Superdex 200 HL凝胶过滤柱的蛋白质洗脱。运行的级分收集自图61中所过的阴离子交换柱子；
图74为可溶性A6 TCR经大小排阻层析获得的曲线图，所述A6 TCR在TRAC*01外显子1的45位残基和TRBC2*01外显子1的59位残基间含有新链间二硫键，该曲线图显示来自Superdex 200 HL凝胶过滤柱蛋白质洗脱。运行的级分收集自图62中所过的阴离子交换柱子；图75为可溶性A6 TCR经大小排阻层析获得的曲线图，所述A6 TCR在TRAC*01外显子1的52位残基和TRBC2*01外显子1的55位残基间含有新链间二硫键，该曲线图显示来自Superdex 200 HL凝胶过滤柱的蛋白质洗脱。运行的级分收集自图63中所过的阴离子交换柱子；图76为可溶性A6 TCR经大小排阻层析获得的曲线图，所述A6 TCR在TRAC*01外显子1的15位残基和TRBC2*01外显子1的15位残基间含有新链间二硫键，该曲线图显示来自Superdex 200 HL凝胶过滤柱的蛋白质洗脱。运行的级分收集自图64中所过的阴离子交换柱子；以及图77-80分别为显示在以下残基间含链间二硫键的可溶性A6 TCR与HLA-A2-tax pMHC结合的BIAcore反应曲线TRAC*01外显子1的48位残基和TRBC2*01外显子1的57位残基；TRAC*01外显子1的45位残基和TRBC2*01外显子1的77位残基；TRAC*01外显子1的10位残基和TRBC2*01外显子1的17位残基；和TRAC*01外显子1的45位残基和TRBC2*01外显子1的59位残基。
图81为显示在TRAC*01外显子1的52位残基和TRBC2*01外显子1的55位残基间含有新链间二硫键的可溶性A6 TCR与HLA-A2-tax和与HLA-A2-NY-ESO pMHC非特异结合的BIAcore曲线图；图82为显示在TRAC*01外显子1的15位残基和TRBC2*01外显子1的15位残基间含有新链间二硫键的可溶性A6 TCR与HLA-A2-taxpMHC结合的BIAcore曲线图；图83a为具有1BD2序列(链A Thr164，链B Ser174)的模型周围的电子密度图。图的形貌在1.0，2.0和3.0σ处绘出。图83b为在A164和B174两个位置处用Cys改进后的电子密度图。图的形貌用与图83a相同的σ水平绘出；
图84将本发明NY-ESO TCR的结构与1BD2 TCR的结构进行了比较，所述比较通过重叠以条带和线圈表示的所述结构进行；图85a和85b分别显示掺入生物素识别位点的NY-ESO TCRβ链的DNA和氨基酸序列。突出显示的为生物素识别位点；图86a和86b分别显示掺入六聚组氨酸标签的NY-ESO TCRβ链的DNA和氨基酸序列。突出显示的为六聚组氨酸标签；图87图示了含新二硫键和生物素识别序列的可溶性NY-ESO TCR经POROS 50HQ阴离子交换柱的洗脱，所述洗脱应用以点线表示的0-500mM NaCl梯度进行；图88图示了含新二硫键和六聚组氨酸标签的可溶性NY-ESO TCR经POROS 50HQ阴离子交换柱的洗脱，所述洗脱应用以点线表示的0-500mM NaCl梯度进行；图89为由图87所示的经NY-ESO-生物素化阴离子交换柱而收集到的合并级分进行凝胶过滤层析的蛋白质洗脱图；图90为由图88所示的经NY-ESO-六聚组氨酸标记的阴离子交换柱而收集到的合并级分进行凝胶过滤层析的蛋白质洗脱图；图91a-h为FACS条带图，表明的是由分别用以下浓度的NY-ESO肽和荧光NY-ESO TCR四聚体孵育HLA-A2阳性的经EBV转化的B细胞系(PP LCL)，来自25,000个细胞产生的染色强度NYESO 0 TCR 5μg、NYESO 10-4M TCR 5μg、NYESO 10-5M TCR 5μg、NYESO 10-6M TCR5μg、NYESO 0 TCR 10μg、NYESO 10-4M TCR 10μg、NYESO 10-5M TCR10μg、NYESO 10-6M TCR 10μg；图92为掺入TRBC1*01恒定区的A6 TCRβ-链的DNA序列；图93为掺入TRBC1*01恒定区的可溶性A6 TCR进行阴离子交换层析的曲线图，其显示了应用以点线表示的0-500mM NaCl梯度经POROS50HQ柱进行的蛋白质洗脱；
图94-A.来自图93中所过柱的级分的还原SDS-PAGE(考马斯染色)，如所示。B.来自图93中所过柱的级分的非还原SDS-PAGE(考马斯染色)，如所示；图95来自图93中峰2的合并级分的大小排阻层析。峰1包含链间二硫键连接的TCR异源二聚体；图96-A.二硫键连接的A6可溶性TCR与HLA-Flu复合体特异结合的BIAcore分析。B.与单独注射二硫键连接的A6可溶性TCR的对照进行比较的结合反应；图97显示掺入“自由”半胱氨酸的A6 TCR的突变β链的核酸序列；图98-掺入“自由”半胱氨酸的可溶性A6 TCR的阴离子交换层析。它显示了应用以点线表示的0-500mM NaCl梯度经POROS 50HQ柱进行的蛋白质洗脱；图99-A.来自图98中所过柱的级分的还原SDS-PAGE(考马斯染色)，如所示。B.来自图98中所过柱子的级分的非还原SDS-PAGE(考马斯染色)，如所示；图100-来自图98中峰2的合并级分的大小排阻层析。峰1包含链间二硫键连接的TCR异源二聚体；图101-A.为掺入“自由”半胱氨酸的二硫键连接的A6可溶性TCR与HLA-Flu复合体特异结合的BIAcore分析。B.与单独注射二硫键连接的A6可溶性TCR的对照进行比较的结合反应；图102显示掺入丝氨酸残基从而突变替换了“自由”半胱氨酸的A6TCR的突变β链的核酸序列；图103-掺入丝氨酸残基从而突变替换了“自由”半胱氨酸的可溶性A6 TCR的阴离子交换层析，其显示了应用以点线表示的0-500mM NaCl梯度经POROS 50HQ柱进行的蛋白质洗脱；图104-A.来自图103中所过柱的级分的还原SDS-PAGE(考马斯染色)，如所示。B.来自图103中所过柱的级分的非还原SDS-PAGE(考马斯染色)，如所示；峰2明确包含链间二硫键连接的TCR异源二聚体；
图105-来自图103中峰2的合并级分的大小排阻层析。峰1包含链间二硫键连接的TCR异源二聚体；图106-A.为掺入丝氨酸残基用以突变为“自由”半胱氨酸的二硫键连接的A6可溶性TCR与HLA-Flu复合体特异结合的BIAcore分析。B.与单独注射二硫键连接的A6可溶性TCR的对照进行比较的结合反应；图107显示pYX112的核酸序列；图108显示pYX122的核酸序列；图109显示前原交配因子(pre-pro mating factor)α与TCRα链融合的DNA和蛋白质序列；图110显示前原交配因子α与TCRβ链融合的DNA和蛋白质序列；图111显示在酿酒酵母(S.cerevisiae)菌株SEY6210中表达的可溶性TCR的Western印迹。C泳道含60ng的纯化可溶性NY-ESO TCR作为对照。1泳道和2泳道含分别从两个独自经TCR转化的酵母培养物收获的蛋白质；图112显示pEX172质粒的KpnI到EcoRI插入片段的核酸序列。质粒的其余部分为pBlueScript II KS-；图113为用于克隆入杆状病毒的TCR链的示意性图解；图114显示用以形成链间二硫键的A6 α TCR构建体的核酸序列，BamHI插入到pAcAB3表达载体中；图115显示用以形成链间二硫键的A6 β TCR构建体的核酸序列，BamHI插入到pAcAB3表达载体中；以及图116显示细菌产生的含链间二硫键的A6 TCR和昆虫产生的含链间二硫键的A6 TCR的考马斯染色凝胶和Western印迹。
在以下的所有实施例中，除非另外说明，产生的可溶性TCR链在紧邻形成天然链间二硫键的半胱氨酸残基的C末端进行截断。
实施例1-A6 Tax TCRα和β链的引物和突变设计将A6 Tax TRAC*01外显子1的48位苏氨酸突变为半胱氨酸时，设计以下的引物(突变以小写字母显示)5’-C ACA GAC AAA tgT GTG CTA GAC AT5’-AT GTC TAG CAC Aca TTT GTC TGT G将A6 Tax TRBC1*01和TRBC2*01两者的外显子1的57位丝氨酸突变为半胱氨酸时，设计以下的引物(突变以小写字母显示)5’-C AGT GGG GTC tGC ACA GAC CC5’-GG GTC TGT GCa GAC CCC ACT GPCR诱突含A6 Tax TCRα或β链基因的表达质粒的突变分别应用α-链引物或β-链引物进行如下突变。将100ng的质粒与5μl的10mM dNTP、25μl的10xPfu-缓冲液(Stratagene)、10单位的Pfu聚合酶(Stratagene)，且用H2O将终体积调整为240μl。将引物补充到48μl的该混合物中，以稀释引物使其在50μl的终反应体积中的终浓度为0.2μM。95℃30秒的初始变性后，反应混合物在Hybaid PCR express PCR仪中进行15轮的变性(95℃，30秒)、退火(55℃，60秒)和延伸(73℃，8分钟)。然后用10单位的DpnI限制性酶(New England Biolabs)37℃消化产物5小时。将10μl的消化反应物转化到感受态XL1-Blue细菌中并在37℃生长18小时。挑取单菌落并在5mlTYP+氨苄青霉素(16g/l细菌用胰蛋白胨、16g/l酵母提取物、5g/l NaCl、2.5g/l K2HPO4、100mg/l氨苄青霉素)中过夜培养。根据生产商的使用说明书应用Qiagen mini-prep柱纯化质粒DNA且应用牛津大学生化室的测序设备进行自动序列测定以证实序列。相应的突变核酸和氨基酸序列在图中显示，图2a和3a为用于α链且图2b和3b用于β链。
实施例2-可溶性TCR的表达、重折叠和纯化将分别含突变的α-链和β-链的表达质粒单独转化到大肠杆菌菌株BL21pLysS中，且将抗氨苄青霉素的单菌落在TYP(氨苄青霉素100μg/ml)培养基中37℃培养直到OD600为0.4，之后用0.5mM IPTG诱导蛋白质表达。诱导3小时后在Beckman J-6B中4000转/分钟离心30分钟收获细胞。细胞沉淀重悬在含50mM Tris-HCI、25％(w/v)蔗糖、1mM NaEDTA、0.1％(w/v)叠氮钠、10mM DTT，pH8.0的缓冲液中。过夜冻融步骤后，在Milsonix XL2020超声仪中用标准的12mm直径探针以1分钟脉冲超声降解重悬细胞总共约10分钟。在Beckman J2-21离心机中13000转/分钟离心30分钟回收包涵体沉淀。然后进行三次去污剂清洗以移除细胞残渣和膜成分。每次用Beckman J2-21以13000转/分钟离心沉淀15分钟之前将包涵体沉淀在Triton缓冲液(50mM Tris-HCI、0.5％Triton-X100、200mMNaCl、10mM NaEDTA、0.1％(w/v)叠氮钠、2mM DTT，pH8.0)中进行均质化。然后在以下的缓冲液中通过类似的洗涤以移除去污剂和盐50mMTris-HCl、1mM NaEDTA、0.1％(w/v)叠氮钠、2mM DTT，pH8.0。最后，将包涵体分装成30mg小份并冻存于-70℃。用6M盐酸胍溶解并用Bradford染料结合试验(PerBio)定量包涵体蛋白质产量。
从冷冻库存中取出约30mg(即1微摩尔)的每一溶解的包涵体链进行解冻，然后混合样本并将混合物稀释到15ml的胍溶液(6M盐酸胍、10mM乙酸钠、10mM EDTA)中，以保证链充分变性。然后将含充分还原和变性的TCR链的胍溶液注入到1升的以下重折叠缓冲液中100mM Tris pH8.5、400mM L-精氨酸、2mM EDTA、5mM还原谷胱甘肽、0.5mM氧化谷胱甘肽、5M尿素、0.2mM PMSF。放置溶液24小时。然后对重折叠液透析两次，首先用10升的100mM尿素，然后用10升的100mM尿素、10mMTris pH8.0。重折叠和透析步骤均在6-8℃进行。
将透析的重折叠液上样至Akta净化器(Pharmacia)的POROS 50HQ阴离子交换柱并以0-500mM NaCl梯度用50倍柱体积洗脱结合的蛋白质，以从降解产物和杂质中分离出sTCR，如图4所示。将峰级分存储在4℃并在合并和浓缩前进行考马斯染色的SDS-PAGE(图5)分析。最后，应用HBS-EP缓冲液(10mM HEPES pH7.4、150mM NaCl、3.5mM EDTA、0.05％NP40)预平衡的Superdex 200HR凝胶过滤柱(图6)纯化并表征sTCR。合并并浓缩位于相对分子量约50kDa的洗脱峰，之后通过BIAcore表面胞质共振分析进行表征。
实施例3-通过BIAcore表面胞质共振说明sTCR与特异pMHC的结合应用表面胞质共振生物传感器(BIAcore 3000TM)分析sTCR与其肽-MHC配体的结合。产生单pMHC复合体(以下描述)有利于分析，将pMHC复合体以半定向方式固定在链亲和素包被的结合表面，使得可同时有效检测可溶性T细胞受体与达四种的不同pMHC(固定在分别的流槽上)的结合。人工注射HLA复合体可容易地控制固定的I类分子的精确水平。
该固定的复合体能够结合T细胞受体和共受体CD8αα，二者均可以注射入溶解相。甚至在低浓度(至少40μg/ml)时也可获得TCR的特异结合，表明TCR是相对稳定的。应用在溶解相或固定相的sTCR定性和定量观察到的sTCR的pMHC结合特征均类似。这是对可溶性TCR种类部分活性的重要对照，并提示生物素化pMHC复合体与非生物素化复合体具有一样的生物活性。
从细菌表达的含构成性亚单位蛋白和合成肽的包涵体中体外重折叠生物素化I类HLA-A2-肽复合体，随后进行纯化和体外酶性生物素化(O’Callaghan等.(1999)生物化学年鉴(Anal.Biochem.)2669-15)。表达的HLA-重链具有一C末端生物素化标签，所述标签替换了适宜构建体中蛋白质的跨膜和胞浆结构域。获得了包涵体表达水平为～75mg/升的细菌培养物。也从适宜的构建物在大肠杆菌中以包涵体形式表达HLA轻-链或β2-小球蛋白，表达水平为～500mg/升细菌培养物。
裂解大肠杆菌细胞并纯化包涵体使其约为80％纯度。包涵体内的蛋白质在6M盐酸胍、50mM Tris pH8.1、100mM NaCl、10mM DTT、10mMEDTA中变性，并以浓度为30mg/升重链、30mg/升β2m加到0.4ML-精氨酸-HCl、100mM Tris pH8.1、3.7mM胱胺、mM半胱胺、4mg/ml肽(例如tax 11-19)中进行重折叠，在＜5℃条件下以单剂量一次性将变性蛋白质加入到重折叠缓冲液中。在4℃至少进行1小时以完全重折叠。
在10倍体积的10mM Tris pH8.1进行透析以交换缓冲液。两次缓冲液交换对于有效减少溶液的离子强度是必须的。然后蛋白质溶液过滤通过1.5μm的乙酸纤维素滤器并加样到POROS 50HQ阴离子交换柱(8ml柱床体积)。用线性0-500mM NaCl梯度洗脱蛋白质。HLA-A2-肽复合体在约250mM NaCl处进行洗脱，并收集峰级分，加入蛋白酶抑制剂混合物(Calbiochem)并将级分置冰上冷却。
生物素化HLA复合体的缓冲液交换为10mM Tris pH8.1、5mMNaCl，所述交换应用在同一缓冲液中平衡的Pharmacia快速去盐柱。洗脱后立即将含蛋白质的级分置冰上冷却并加入蛋白酶抑制剂混合物(Calbiochem)。然后加入生物素化试剂1mM生物素、5mM ATP(缓冲为pH8)、7.5mM MgCl2和5μg/ml BirA酶(根据O’Callaghan等.(1999)生物化学年鉴(Anal.Biochem.)2669-15进行纯化)。然后室温过夜孵育混合物。
应用凝胶过滤层析纯化生物素化HLA复合体。用滤过的PBS预平衡Pharmacia Superdex 75 HR 10/30柱并加入1ml生物素化反应混合物，并用PBS以0.5ml/分钟洗柱子。生物素化HLA复合体以单一峰洗脱，体积约为15ml。合并含蛋白质的级分、置冰上冷却并加入混合的蛋白酶抑制剂。应用考马斯-结合试验(PerBio)测定蛋白质浓度并将分装的生物素化HLA复合体储存于-20℃。通过标准的胺偶联法固定链亲和素。
在BIAcore 3000TM表面胞质共振(SPR)生物传感器上分析含新链间键的A6 Tax sTCR与其配体/MHC复合体或不相关HLA-肽组合物间的相互作用，其产生如上描述。SPR测定在小流槽内的传感器表面附近以反应单位(RU)表述的折射率的变化，这一原理可用于检测受体配体的相互作用以及用于分析其亲和性和动力学参数。通过将单独的HLA-肽复合体固定于分离的流槽中制备检测用流槽，所述固定通过交联到β2m上的生物素和链亲和素间的结合实现，而前述的抗生物素链菌素已化学交联到流槽的激活表面。然后通过将sTCR以恒定速度通过不同流槽的表面进行试验，以此测定SPR反应。起初，以5μl每分钟的固定流速将sTCR通过两种不同的表面证实相互作用的特异性；所述表面其一包被以～5000 RU的特异肽-HLA复合体，另一个包被～5000 RU的非特异肽-HLA复合体(图7中的插入图)。以不同流速和不同浓度将可溶性sTCR注入肽-HLA复合体上用来定义背景共振。这些对照测量的数值从用特异肽-HLA复合体获得的数值中减去并用以计算结合亲和力，所述结合亲和力以解离常数Kd表述(Price& Dwek，用于生物化学家的物理化学中的原则和问题(Principles andProblems in Physical Chemistry for Biochemist)(第二版)1979，ClarendonPress，Oxford)，如图7所示。
获得的Kd值(1.8μM)与报道的用于无新二硫键的A6 Tax sTCR与pMHC间的相互作用接近(0.91μM-Ding等，1999，免疫学(Inmmunity)1145-56)。
实施例4-含新二硫键的可溶性JM22 TCR的产生在实施例1中制备的可溶性A6 TCR的β链在其天然序列中包含适用于用作连接位点的BglII限制性位点(AAGCTT)。
进行如以下详细描述的PCR诱变以将BamH1限制性位点(GGATCC)导入可溶性A6 TCR的α链，位点位于新半胱氨酸密码子的5’端。在图2a中描述的序列用作该诱变的模板。应用以下的引物|BamHI|5′-ATATCCAGAACCCgGAtCCTGCCGTGTA-3′5′-TACACGGCAGGAaTCcGGGTTCTGGATAT-3′100ng的质粒与5μl的10mM dNTP、25μl的10xPfu-缓冲液(Stratagene)、10单位的Pfu聚合酶(Stratagene)混合，并用H2O将终体积调整至240μl。将引物补充到48μl的该混合物中，以稀释引物使其在50μl的终反应体积中的终浓度为0.2μM。95℃30秒的初始变性后，反应混合物在Hybaid PCR express PCR仪中进行15轮的变性(95℃，30秒)、退火(55℃，60秒)和延伸(73℃，8分钟)。然后用10单位的DpnI限制性酶(NewEngland Biolabs)37℃消化产物5小时。将10μl的消化反应物转化到感受态XL1-Blue细菌中并在37℃生长18小时。挑取单菌落并在5ml TYP+氨苄青霉素(16g/l细菌用胰蛋白胨、16g/l酵母提取物、5g/l NaCl、2.5g/lK2HPO4、100mg/l氨苄青霉素)中过夜培养。根据生产商的使用说明书应用Qiagen mini-prep柱子纯化质粒DNA且应用牛津大学生化室的测序设备进行自动序列测定以证实序列。导入到α链的突变为“沉默”突变，因此该链的氨基酸序列保持不变，与在图3a中描述的一致。突变α链的DNA序列在图8a中显示。
为产生掺入新二硫键的可溶性JM22 TCR，含α链BamHI和β链BglII限制性位点的A6 TCR质粒用作模板。应用以下的引物|NdeI|5′-GGAGATATACATATGCAACTACTAGAACAA-3′5′-TACACGGCAGGATCCGGGTTCTGGATATT-3′|BamHI||NdeI|5′-GGAGATATACATATGGTGGATGGTGGAATC-3′5′-CCCAAGCTTAGTCTGCTCTACCCCAGGCCTCGGC-3′|BglII|通过以下的PCR克隆获得JM22 TCRα和β-链构建体。
应用如上所示的引物和含JM22 TCR链的模板进行PCR反应。将PCR产物用相应的限制性酶消化并克隆到pGMT7中以获得表达质粒。质粒的插入序列通过自动DNA测序进行证实。图8b和8c分别显示JM22 TCR的突变α和β链的DNA序列，且图9a和9b显示生成的氨基酸序列。
如在实施例1和2中所描述的那样表达相应的TCR链、共同重折叠和纯化。图10说明应用以点线表示的0-500mM NaCl梯度经POROS50HQ柱对可溶性二硫键连接的JM22 TCR蛋白质进行的洗脱。图11显示自图10中阐述的柱运行所得级分的还原SDS-PAGE(考马斯染色)和非还原SDS-PAGE(考马斯染色)凝胶的结果。峰1明确包含链间二硫键连接的TCR异源二聚体。图12显示图10中峰1收集级分经大小排阻柱进行的蛋白质洗脱。
如在实施例3中所述进行JM22 TCR与pMHC结合的BIAcore分析。图13a显示二硫键连接的JM22可溶性TCR与HLA-Flu复合体特异结合的BIAcore分析。图13b显示与用于单独注射二硫键连接的JM22可溶性TCR的对照进行比较的结合反应。测定的该二硫键连接的TCR对HLA-flu复合体的Kd为7.9±0.51μM。
实施例5-含新二硫键的可溶性NY-ESO TCR的产生根据已知技术从Enzo Cerundolo(分子医学院，牛津大学(Institute ofMolecular Medicine，University of Oxford))提供的T细胞中分离编码NY-ESO TCR的cDNA。通过用反转录酶处理mRNA产生编码NY-ESOTCR的cDNA。
为产生掺入新二硫键的可溶性NY-ESO TCR，含α链BamHI和β链BglII限制性位点的A6 TCR质粒用作模板，如在实施例4中所描述的。应用以下的引物|NdeI|5′-GGAGATATACATATGCAGGAGGTGACACAG-3′5′-TACACGGCAGGATCCGGGTTCTGGATATT-3′|BamHI||NdeI|5′-GGAGATATACATATGGGTGTCACTCAGACC-3′5′-CCCAAGCTTAGTCTGCTCTACCCCAGGCCTCGGC-3’|BglII|通过如以下的PCR克隆获得NY-ESO TCRα和β-链构建体。
应用如上所示的引物和含NY-ESO TCR链的模板进行PCR反应。用相应限制性酶消化PCR产物并克隆到pGMT7以获得表达质粒。通过自动DNA测序证实质粒插入体的序列。图14a和14b分别显示NY-ESO TCR的突变α和β链的DNA序列，且图15a和15b显示产生的氨基酸序列。
如在实施例1和2中所述表达相应的TCR链、共同生折叠和纯化，但方法中存在以下的变更可溶性TCRs的变性从冷冻库存中解冻30mg的溶解TCR β-链包涵体和60mg的溶解TCRα-链包涵体。在6M的胍溶液中将包涵体稀释成终浓度为5mg/ml，并加入DTT(2M母液)使其终浓度为10mM。将混合物置37℃孵育30分钟。
可溶性TCRs的重折叠在5℃±3℃剧烈搅拌1L的重折叠缓冲液。在加入变性的TCR链前约5分钟加入氧化还原偶(2-半胱胺和胱胺(终浓度分别为6.6mM和3.7mM)。在5℃±3℃搅拌约5小时±15分钟进行蛋白质的重折叠。
经重折叠的可溶性TCRs的透析以Spectrapor 1膜(Spectrum；Product No.132670)在10L 10mM Tris pH8.1中于5℃±3℃透析经重折叠的TCR 18-20小时。此次透析后，透析缓冲液换成新鲜的10mM Tris pH8.1(10L)并继续在5℃±3℃透析20-22小时。
图16说明应用以点线表示的0-500mM NaCl梯度经POROS 50HQ柱对二硫键连接的可溶性NY-ESO TCR蛋白质的洗脱。图17显示经图16中所示柱的级分的还原SDS-PAGE(考马斯染色)和非还原SDS-PAGE(考马斯染色)凝胶的结果。峰1和峰2明确包含链间二硫键连接的TCR异源二聚体。图18显示来自图17中峰1(A)和峰2(B)收集的合并级分的大小排阻层析。蛋白质洗脱为单一主峰，与TCR异源二聚体对应。
二硫键连接的NY-ESO TCR与pMHC结合的BIAcore分析如实施例3中的描述进行。图19显示二硫键连接的NY-ESO可溶性TCR与HLA-NYESO复合体特异结合的BIAcore分析。A.峰1，B.峰2。
该二硫键连接的TCR对HLA-NY-ESO复合体的Kd测定为9.4±0.84μM。
实施例6-含新链间二硫键且两个半胱氨酸中至少其一为形成天然链间二硫键所需的可溶性NY-ESO TCR的产生为产生掺入一个新二硫键且半胱氨酸残基中的至少其一参与形成天然二硫键的可溶性NY-ESO TCR，含α链BamHI和β链BglII限制性位点的质粒用作构架，如在实施例4中所描述的。应用以下的引物
|NdeI|5′-GGAGATATACATATGCAGGAGGTGACACAG-3′5′-CCCAAGCTTAACAGGAACTTTCTGGGCTGGGGAAGAA-3′|HindIII||NdeI|5′-GGAGATATACATATGGGTGTCACTCAGACC-3′5′-CCCAAGCTTAACAGTCTGCTCTACCCCAGGCCTCGGC-3′|BglII|通过如以下的PCR克隆获得NY-ESO TCRα和β-链构建体。
应用如上所示的引物和含NY-ESO TCR链的模板进行PCR反应。用相应限制性酶消化PCR产物并克隆到pGMT7以获得表达质粒。通过自动DNA测序证实质粒插入体的序列。图20a和20b分别显示NY-ESO TCR的突变α和β链的DNA序列，且图21a和21b显示产生的氨基酸序列。
为产生含非天然链间二硫键和天然链间二硫键的可溶性NY-ESOTCR，用以上两引物分离的DNA均得以应用。为产生具有非天然链间二硫键和仅具有一个参与天然链间二硫键的半胱氨酸残基的可溶性NY-ESOTCRs，应用用以上引物中的一个以及实施例5中适宜引物所分离的DNA。
表达相应的TCR链、共同重折叠和纯化，如在实施例5中所述。
图22-24说明应用以点线表示的0-500mM NaCl梯度经POROS 50HQ阴离子交换柱对可溶性NY-ESO TCRαcysβcys(即在两条链中均具有非天然和天然半胱苷酸)、TCRαcys(在两条链中均具有非天然半胱氨酸但仅在α链中具有天然半胱氨酸)和TCRβcys(在两条链中均具有非天然半胱氨酸但仅在β链中具有天然半胱氨酸)的蛋白质的洗脱。图25和26分别显示经图22-24中所过柱子的NY-ESO TCRαcysβcys、TCRαcys和TCRβcys级分的还原SDS-PAGE(考马斯染色)和非还原SDS-PAGE(考马斯染色)凝胶的结果。结果明确显示已形成链间二硫键连接的TCR异源二聚体。图27-29分别为经图22-24所述的NY-ESO TCRαcysβcys、TCRαcys和TCRβcys阴离子交换柱洗脱的收集级分进行凝胶过滤层析的蛋白质洗脱图。蛋白质洗脱为一单一主峰，与TCR异源二聚体对应。
sTCR与pMHC结合的BIAcore分析按实施例3中所描述的进行。图30-32分别显示NY-ESO TCRαcysβcys、TCRαcys和TCRβcys与HLA-NYESO复合体特异结合的BIAcore分析。
TCRαcysβcys的Kd值为18.08±2.075μM，TCRαcys的Kd值为19.24±2.01μM且TCRβcys的Kd值为22.5±4.0692μM。
实施例7-含新链间二硫键的可溶性AH-1.23 TCR的产生根据已知技术从Hill Gaston(医学院(Medical School)，Addenbrooke’s医院，剑桥(Cambridge))提供的T细胞中分离编码AH-1.23 TCR的cDNA。通过用反转录酶处理mRNA产生编码NY-ESOTCR的cDNA。
为产生掺入新二硫键的可溶性AH-1.23 TCR，含α链BamHI和β链BglII限制性位点的TCR质粒用作模板，如在实施例4中所描述的。
|NdeI|5′-GGGAAGCTTACATATGAAGGAGGTGGAGCAGAATTCTGG-3′5′-TACACGGCAGGATCCGGGTTCTGGATATT-3′|BamHI||NdeI|5′-TTGGAATTCACATATGGGCGTCATGCAGAACCCAAGACAC-3′5′-CCCAAGCTTAGTCTGCTCTACCCCAGGCCTCGGC-3′|BglII|通过如以下的PCR克隆获得AH-1.23 TCRα和β-链构建体。
应用如上所示的引物和含AH-1.23 TCR链的模板进行PCR反应。用相应限制性消化PCR产物并克隆到pGMT7以获得表达质粒。通过自动DNA测序证实质粒插入体的序列。图33a和33b分别显示AH-1.23 TCR的突变α和β链的DNA序列，且图34a和34b显示产生的氨基酸序列。
表达相应的TCR链、共同重折叠和纯化，如在实施例5中描述的。
图35说明应用以点线表示的0-500mM NaCl梯度经POROS 50HQ阴离子交换柱对二硫键连接的可溶性AH-1.23 TCR蛋白质的洗脱。图36和37分别显示经图35中所示柱收集级分的还原SDS-PAGE(考马斯染色)和非还原SDS-PAGE(考马斯染色)凝胶的结果。这些凝胶明确表明链间二硫键连接的TCR异源二聚体的存在。图38为经图35中所示的阴离子交换柱收集级分进行Superdex 75 HR凝胶过滤柱的洗脱图。蛋白质洗脱为一单一主峰，与异源二聚体对应。
实施例8-在恒定结构域的免疫球蛋白区内的备选位置含有新链间二硫键的可溶性A6 TCRs的产生以下实验的进行用以研究是否可能在TCR免疫球蛋白区TRAC*01外显子1的48位苏氨酸和TRBC1*01/TRBC2*01二者的外显子1的57位丝氨酸之间以外的位置形成包含新二硫键的功能性可溶TCRs。
为突变A6 TCR的α-链，设计以下的引物(引物名称中的数字是指TRAC*01外显子1中突变氨基酸残基的位置，突变残基以小写字母显示)T48→C突变5’-CACAGACAAAtgTGTGCTAGACAT-3’5’-ATGTCTAGCACAcaTTTGTCTGTG-3’Y10→C突变5’-CCCTGCCGTGTgCCAGCTGAGAG-3”5’-CTCTCAGCTGGcACACGGCAGGG-3’L12→C突变5’-CCGTGTACCAGtgcAGAGACTCTAAATC-3’5’-GATTTAGAGTCTCTgcaCTGGTACACGG-3’S15→C突变5’-CAGCTGAGAGACTgTAAATCCAGTGAC-3’5’-GTCACTGGATTTAcAGTCTCTCAGCTG-3’V22→C突变5’-CAGTGACAAGTCTtgCTGCCTATTCAC-3’5’-GTGAATAGGCAGcaAGACTTGTCACTG-3’
Y43→C突变5’-GATTCTGATGTGTgTATCACAGACAAAT-3’5’-ATTTGTCTGTGATAcACACATCAGAATC-3’T45→C突变5’-CTGATGTGTATATCtgtGACAAAACTGTGC-3’5’-GCACAGTTTTGTCacaGATATACACATCAG-3’L50→C突变5’-AGACAAAACTGTGtgtGACATGAGGTCT-3’5’-AGACCTCATGTCacaCACAGTTTTGTCT-3’M52→C突变5’-ACTGTGCTAGACtgtAGGTCTATGGAC-3’5’-GTCCATAGACCTacaGTCTAGCACAGT-3’S61→C突变5’-CTTCAAGAGCAACtGTGCTGTGGCC-3’5’-GGCCACAGCACaGTTGCTCTTGAAG-3’为突变TCR A6的β-链，设计以下的引物(引物名称中的数字是指TRBC2*01外显子1中突变氨基酸残基的位置，突变残基以小写字母显示)S57→C突变5’-CAGTGGGGTCtGCACAGACCC-3’5’-GGGTCTGTGCaGACCCCACTG-3’V13→C突变5’-CCGAGGTCGCTtgtTTTGAGCCATCAG-3’5’-CTGATGGCTCAAAacaAGCGACCTCGG-3’F14→C突变5’-GGTCGCTGTGtgtGAGCCATCAGA-3’5’-TCTGATGGCTCacaCACAGCGACC-3’S17→C突变5’-GTGTTTGAGCCATgtGAAGCAGAGATC-3’
5’-GATCTCTGCTTCacATGGCTCAAACAC-3’G55→C突变5’-GAGGTGCACAGTtGtGTCAGCACAGAC-3’5’-GTCTGTGCTGACaCaACTGTGCACCTC-3’D59→C突变5’-GGGTCAGCACAtgCCCGCAGCCC-3’5’-GGGCTGCGGGcaTGTGCTGACCC-3’L63→C突变5’-CCCGCAGCCCtgCAAGGAGCAGC-3’5’-GCTGCTCCTTGCaGGGCTGCGGG-3’S77→C突变5’-AGATACGCTCTGtGCAGCCGCCT-3’5’-AGGCGGCTGCaCAGAGCGTATCT-3’R79→C突变5’-CTCTGAGCAGCtGCCTGAGGGTC-3’5’-GACCCTCAGGCaGCTGCTCAGAG-3’E15→C突变5′-GCTGTGTTTtgtCCATCAGAA-3′5′-TTCTGATGGacaAAACACAGC-3′PCR诱变、α和βTCR构建体扩增、连接和质粒纯化的进行如在实施例1中所描述，应用以上引物的适宜组合以产生包括新链间二硫键的可溶性TCRs，所述新链间二硫键在以下的氨基酸对之间
图39到58显示以上引物扩增的突变A6 TCR链的DNA和氨基酸序列。编码突变半胱氨酸的密码子着重显示。
各条TCR链的表达、共同重折叠和纯化如在实施例5中所描述。用POROS 50HQ阴离子交换柱纯化后，产生的蛋白质跑SDS-PAGE凝胶以评价是否已形成任何正确重折叠的可溶性TCR。这些凝胶也用以确认在纯化物质中正确分子量的任何二硫键连接蛋白质的存在与否。研究中的含以下新链间二硫键的TCRs用此细菌表达系统不能产生正确分子量的二硫键连接的蛋白质，因此不对其进行进一步的测试。但是，可应用备选的原核或真核表达系统。
图59到64分别显示在以下残基间含新链间二硫键的可溶性TCRs应用以点线表示的0-500mM NaCl梯度从POROS 200HQ阴离子交换柱的洗脱Thr48-Ser57、Thr45-Ser77、Tyr10-Ser17、Thr45-Asp59、Met52-Gly55和Ser15-Glu15，如由加点线所显示的。图65到70分别显示经图59到64所示柱子而收集级分的还原SDS-PAGE(考马斯染色)和非还原SDS-PAGE(考马斯染色)凝胶的结果。这些凝胶明确显示链间二硫键连接的TCR异源二聚体的存在。
图71到76为经图59到64中所示阴离子交换柱收集级分的Superdex200 HR凝胶过滤柱的洗脱图。
TCRs与pMHC结合的BIAcore分析的进行如实施例3所描述。图77-82为证明纯化的可溶性TCRs与HLA-A2 tax pMHC复合体结合能力的BIAcore曲线图。
Thr48-Ser57的Kd值为7.8μM、Thr45-Ser77的Kd值为12.7μM、Tyr10-Ser17的Kd值为34μM、Thr45-Asp59的Kd值为14.9μM且Ser15-Glu15的Kd值为6.3μM。Met52-Gly55能够与其天然“靶标”HLA-A2tax复合体结合，尽管其也能与“不相关”靶标HLA-A2-NY-ESO复合体以类似方式结合(参见图81)。
实施例9-NY-ESO-HLA-A2复合体特异的二硫键连接NY-ESO T细胞受体的X射线晶体学NY-ESO dsTCR的克隆如实施例所描述，且其如下表达。
分别含突变α-链和β-链的表达质粒单独转染到大肠杆菌菌株BL21pLysS中，且在TYP(氨苄青霉素100μg/ml)培养基中37℃培养抗氨苄青霉素的单菌落直到其OD600为0.7，之后用0.5mM IPTG诱导蛋白质表达。诱导18小时后在Beckman J-6B中4000转/分钟离心30分钟以收获细胞。细胞沉淀重悬在含10mM Tris-HCI pH8.1、10mM MgCl2、150mM NaCl、2mM DTT、10％甘油的裂解缓冲液中。在每1L的细菌培养物中加入100μl的溶菌酶(20mg/ml)和100μl的Dnase I(20μg/ml)。冰上孵育30分钟后，用具标准12mm直径探针的Milsonix XL2020超声仪超声细菌悬液，所述超声应用1分钟的脉冲共持续10分钟。在Beckman J2-21离心机(4℃)中13000转/分钟离心30分钟回收包涵体沉淀。然后在Triton洗涤缓冲液(50mM Tris-HCI pH8.1、0.5％Triton-X100、100mM NaCl、10mMNaEDTA，0.1％(w/v)叠氮钠、2mM DTT)中进行三次洗涤以移除细胞残渣和膜成分。每次洗涤时，包涵体沉淀在Triton洗涤缓冲液中进行均质化，之后在Beckman J2-21中13000转/分钟离心15分钟进行沉淀。然后以类似方法在重悬缓冲液(50mM Tris-HCl pH8.1、100mM NaCl、10mMNaEDTA、0.1％(w/v)叠氮钠、2mM DTT)中洗涤以移除去污剂和盐。最后，将包涵体溶解在6M胍缓冲液(6M盐酸胍、50mM Tris pH8.1、100mMNaCl、10mM EDTA、10mM DTT)中，分成120mg的小份并冷冻在-70℃。包涵体用6M盐酸胍溶解定量并用Bradford染料结合试验(PerBio)进行测量。
约60mg(即2.4微摩尔)冷冻的溶解α链与30mg(即1.2微摩尔)冷冻的溶解β链混合。用6M的胍缓冲液将该TCR混合物稀释成终体积为18ml并于37℃加热30分钟以保证链的完全变性。然后搅拌中将含充分还原和变性的TCR链的胍溶液与1升冷的重折叠缓冲液(100mM Tris pH8.1、400mM L-精氨酸-HCl、2mM EDTA、6.6mM 2-半胱胺、3.7mM胱胺、5M尿素)混合。将溶液置冷室(5℃±3℃)中5小时以进行重折叠。然后用12升的水透析重折叠产物18-20小时，之后用12升的10mM Tris pH8.1透析18-20小时(5℃±3℃)。截止分子量为6-8000kDa的Spectrapor1(Spectrum Laboratories，产品号132670)透析膜用于此透析过程。经透析的蛋白质用安装在Nalgene过滤装置中的0.45μm孔径的滤器(Schleicher和Schuell，目录号10404012)进行过滤。
将透析的重折叠产物加到POROS 50HQ(Applied Biosystems)阴离子交换柱子用KTA净化器(Amersham Biotech)从降解产物和杂质中分离重折叠的NY-ESO TCR。加蛋白质之前POROS 50HQ柱用10倍体积的缓冲液A(10mM Tris pH8.1)预平衡。用0-500mM NaCl梯度以7倍的柱体积洗脱结合的蛋白质。应用还原和非还原样本缓冲液在变性SDS-PAGE上分析峰级分(1ml)。含异源二聚体α-β复合体的峰级分应用以25mM MESpH6.5预平衡的Superdex 75HR凝胶过滤柱进行进一步纯化。合并相对分子量约为50kDa处洗脱的蛋白质峰，在Ultrafree离心浓缩器(Millipore，part number UFV2BGC40)中浓缩至42mg/ml并储存于-80℃。
通过悬滴技术在18℃进行NY-ESO TCR的结晶，应用1μl的蛋白质溶液(8.4mg/ml)溶在5mM Mes pH6.5中与等体积的结晶缓冲液混合。应用Crystal Screen缓冲液(Hampton Research)的几种不同的条件下出现结晶。单立方晶体(＜100μm)出现在30％PEG 4000、0.1M柠檬酸钠pH5.6、0.2M乙酸铵缓冲液中，并用于结构测定。
NY-ESO TCR的结晶快速冷冻并测试在Daresbury同步加速器的X线束中的衍射。晶体衍射为0.25mn(2.5)分辨率。收集一组数据并进行处理使其整组中98.6％的振幅在约0.27nm(2.7)为适当，当也可用于近0.25nm(2.5)。合并的R-因子，即晶体等同反射多次测量间的一致性，约占所有数据的10.8％。这处于分辨力设置(resolution shell)的边缘。空间基团为P21，其单元维数为a＝4.25nm(42.5)、b＝5.95nm(59.5)、c＝8.17nm(81.7)、β＝91.5°。单元维数和对称性意味着单元内存在两个拷贝。需要研究的不对称单位(au)或最小体积仅具有1个分子，且单元内的其他分子通过21对称操作产生。au内分子的位置在y-方向上是任意的。只要在x-z平面中处于正确的位置，即可将其在y-方向随意平移。在此“极性”空间基团，其被称作自由参数。
PDB数据库仅记录了一条含A/B异源二聚体TCR，为1BD2。该记录还具有HLA-结合肽与该TCR复合的坐标。该TCR链B与NY-ESO中的相同，但链A在C-结构域存在微小差异且在N-结构域存在显著差异。应用1BD2 A/B模型进行分子置换(MR)，产生不恰当的溶液，这一点通过与对称等价分子的广泛交叠所显示。单独应用B链产生更佳的溶液，其不与近邻产生明显的冲突。相关系数为49％，晶体R-因子为50％且最近的距离(重心到重心)为0.49nm(49)。将起始的链B模型转换成MR等价物所需的旋转和平移操作应用到链A。因此产生杂合的MR溶液，在单元中良好包装，并具有最小的冲突。
电子密度图通常与模型一致，且允许对其调整以与NY-ESO TCR的序列匹配。但起始模型具有许多缺口，特别是缺失侧链，这是模型的不佳排布部分的特征。链间的许多发卡环的密度非常低，且难以建模。模型的晶体R-因子为30％。R-因子为残数，即计算振幅和观测振幅间的差异。
如图83a和83b所示，来自1BD2的输入序列并不与密度很好地匹配。更换模型使链A中164位为Cys和链B中174位为Cys，随之以进一步的改进，清楚显示该序列赋值可更好地与密度匹配。但就侧链大小而言其差异微小，因此模型中很少存在干扰。该区域电子密度几乎不变。
该研究最重要的方面在于新TCR的结构与已发表模型(1BD2)的结构非常类似。比较可包括全部的TCR、恒定结构域或近突变位点的小部分。
r.m.s偏差值在以下的表中列出。结构的比较在图84中显示。
(所有单位均为)短延伸指现在通过二硫桥连接的A链的单链(A157到A169)和B链的单链(B170到B183)。仅对主链原子计算偏差。
这些结果显示二硫键的导入对键周围的TCR局部结构产生很小的影响。将该TCR与A6 TCR的已发表结构(1BD2)进行比较时观察到一些较大的影响，但RMS置换的增加主要是由于环构象的差异(参见图84)。这些环并不形成TCR核心结构的部分，该部分由形成特征性Ig折叠的一系列β-片层形成。完整α-链的RMS偏差特别大，这是由于A6(1BD2)和NY-ESO TCRs间可变结构域序列中存在的差异。但是，A6和NY-ESOTCRs具有相同的可变β-结构域，且完整β-链的RMS偏差显示该可变结构域的结构也存在于具有新二硫键的TCR中。因此这些数据表明TCR的核心结构存在于具有新二硫键的TCR的晶体结构中。
实施例10-含新链间二硫键和C末端β链标记位点的可溶性NY-ESOTCRs的产生。
为产生掺入新二硫键的可溶性NY-ESO TCR，应用在实施例4中描述的含α链BamHI和β链BglII限制性位点的A6 TCR质粒作为构架。
通过如下的PCR克隆获得NY-ESO TCR β-链构建体。应用如下所示的引物和含NY-ESO TCR链的模板进行PCR反应。
|NdeI|Fwd5′-GGAGATATACATATGGGTGTCACTCAGAAC-3′Rev5′-CCACCGGATCCGTCTGCTCTACCCCAGGC-3′|BamHI|
用相应限制性酶消化PCR产物并克隆到含生物素识别序列的pGMT7中以获得表达质粒。通过自动DNA测序证实质粒插入物的序列。图85a显示掺入生物素识别位点的NY-ESO TCRβ链的DNA序列，且图85b显示产生的氨基酸序列。
α链构建体的产生如在实施例5中所描述。相应TCR链的表达、共同重折叠和纯化如在实施例5中所描述。
为产生含非天然链间二硫键和β链C末端六聚组氨酸标签的可溶性NY-ESO TCR，应用以上的相同引物和NY-ESO模板。用相应限制性酶消化PCR产物，并克隆入含六聚组氨酸序列的pGMT7以获得表达质粒。图86a显示掺入六聚组氨酸标签的NY-ESO TCRβ链的DNA序列，且图86b显示产生的氨基酸序列。
图87显示应用以点线表示的0-500mM NaCl梯度从POROS 50HQ阴离子交换柱洗脱含新二硫键和生物素识别序列的可溶性NY-ESO TCR。图88显示应用以点线表示的0-500mM NaCl梯度从POROS 50HQ阴离子交换柱洗脱含新二硫键和六聚组氨酸标签的可溶性NY-ESO TCR。
图89和90分别为经图87和88所示NY-ESO-生物素和NY-ESO-六聚组氨酸标记的阴离子交换柱收集的合并级分进行凝胶过滤层析的蛋白质洗脱图。蛋白质洗脱为一单一主峰，与TCR异源二聚体对应。
sTCR与pMHC结合的BIAcore分析的进行如实施例3所描述。NY-ESO-生物素TCR的Kd值为7.5μM，The NY-ESO-六聚组氨酸标记的TCR的Kd值为9.6μM。
实施例11-应用含新链间二硫键的可溶性NY-ESO TCR的荧光标记四聚体进行细胞染色TCR四聚体的制备如在实施例10中制备的含新二硫键和生物素识别序列的NY-ESO可溶性TCRs用于形成用于细胞染色的可溶性TCR四聚体。应用PD-10柱(Pharmacia)将2.5ml经纯化的可溶性TCR溶液(～0.2mg/ml)缓冲液交换为生物素化反应缓冲液(50mM Tris pH8.0、10mM MgCl2)中。应用10kDa截止分子量的centricon浓缩器(Amicon)将洗脱液(3.5ml)浓缩至1ml。浓缩使浓度接近10mM，加入ATP母液(0.1g/ml，调节至pH7.0)。然后加入1倍体积的蛋白酶抑制剂混合物(蛋白酶抑制剂混合物组1，Calbiochem Biochemicals)，以使蛋白酶混合物的终浓度足以达到提供的母液浓度的1/100，之后加入生物素使其浓度为1mM(母液浓度为0.2M)和酶使其浓度为20μg/ml(母液浓度为0.5mg/ml)。然后室温过夜孵育混合物。通过S75 HR柱进行大小排阻层析移除过量的生物素。通过如下的基于大小排阻HPLC法测定NY-ESO TCR上的生物素化水平。将一份50μl体积的生物素化NY-ESO TCR(2mg/ml)与50μl的链亲和素包被的琼脂糖珠(Sigma)孵育1小时。然后将珠子旋转沉下，且将50μl的未结合样本过TSK 2000 SW柱(Tosoohaas)，流速为0.5ml/min(200mM磷酸盐缓冲液pH7.0)，时间30分钟。用紫外分光光度计在214nm和280nm处检测生物素化NY-ESO TCR的存在。生物素化NY-ESO与非生物素化NY-ESOTCR对照均过柱子。从非生物素化蛋白质的峰面积中减去生物素化蛋白质的峰面积计算生物素化百分率。
应用neutravidin-藻红蛋白结合物(Cambridge Biosciences，UK)获得生物素化可溶性TCR的四聚化。应用考马斯蛋白质试验(Pierce)测定生物素化可溶性TCR的浓度，并计算可溶性TCR 0.8mg/mg neutravidin-藻红蛋白结合物的比率以获得neutravidin-PE与生物素化TCR以1∶4的比率饱和。置冰上并温和搅动下将磷酸盐缓冲液(PBS)中19.5μl的6.15mg/ml生物素化NY-ESO可溶性TCR溶液缓慢加到150μl的1mg/ml的neutravidin-PE溶液中。然后将100.5μl的PBS加到此溶液中以获得最终的浓度为1mg/ml的NY-ESO TCR四聚体。
染色方法将四份0.5ml PBS中的0.3×106HLA-A2阳性的EBV转化的B细胞系(PP LCL)与不同浓度(0、10-4、10-5和10-6M)的HLA-A2 NYESO肽(SLLMWITQC)37℃孵育2小时。然后用Hanks缓冲盐溶液(HBSS)(Gibco，UK)洗涤这些PP LCL细胞两次。
将四份中的每一份均分成两份，并用neutravidin-藻红蛋白新鲜四聚化的生物素化NY-ESO二硫键连接的TCR进行染色。细胞与5或10μg的藻红蛋白标记的四聚体dsTCR复合体冰上孵育30分钟并用HBSS洗涤。再次洗涤细胞，重悬在HBSS中并用FACSVantage分析。收集25,000个细胞并用WinMIDI软件分析数据。
结果图91a-h显示如上描述制备的每一样本产生的FACSVantage数据的条带图。以下表列出每一样本观察到的染色阳性细胞的百分率
这些数据明确表明被NY-ESO TCR四聚体标记的细胞比例以与孵育细胞的肽(SLLMWITQC)浓度相关的方式增加。因此，这些NY-ESO TCR四聚体为适于对表达HLA-A2 NY-ESO复合体的特异细胞进行标记的分子。
在本实施例中，应用了荧光共轭的NY-ESO TCR四聚体。但是，如果用适宜的治疗性分子替换该标记也可预期类似的细胞结合水平。
实施例12-掺入Cβ1恒定区的具新二硫键的可溶性A6 TCR的产生。
先前的所有实施例均描述了掺入Cβ2恒定区的具新二硫键的可溶性TCRs的产生。本实施例证明掺入Cβ1恒定域的可溶性TCRs也可成功产生。
用于将A6 TCRβ-V-结构域与Cβ1进行PCR接合的引物设计设计以下的引物用于A6 TCRβ-链V-结构域的PCR构建体5’-GGAGATATACATATGAACGCTGGTGTCACT-3’5’-CCTTGTTCAGGTCCTCTGTGACCGTGAG-3’设计以下的引物用于Cβ1的PCR构建体5’-CTCACGGTCACAGAGGACCTGAACAAGG-3’5’-CCCAAGCTTAGTCTGCTCTACCCCAGGCCTCGGC-3’应用标准PCR技术分别扩增βVTCR构建体和Cβ1构建体。应用接合PCR(stitching PCR)将两构建体连接。根据生产商的说明书用Qiagenmini-prep柱子纯化质粒DNA，且应用牛津大学生物化学室的测序设备通过自动测序证实序列。A6+Cβ1的序列在图92中显示。
结果，在A6+Cβ1链和A6αTCR链的C-结构域均导入半胱氨酸后，通过链间二硫键A6+Cβ1链与A6αTCR配对。
可溶性TCR的表达和重折叠如实施例2所描述。
经再折叠的可溶性TCR的纯化将经透析的重折叠物上样到Akta净化器(Pharmacia)的POROS 50HQ阴离子交换柱，并以0-500mM NaCl梯度用50倍柱体积洗脱结合的蛋白质以从降解产物和杂质中分离出sTCR，如在图93中所示。峰级分储存在4℃并通过考马斯染色的SDS-PAGE(图94)进行分析，之后合并并浓缩级分。最后，应用HBS-EP缓冲液(10mM HEPES pH7.4、150mM NaCl、3.5mMEDTA、0.05％NP40)预平衡的Superdex 200HR凝胶过滤柱对sTCR进行纯化和表征(图95)。合并并浓缩在相对分子量约为50kDa处的洗脱峰，之后通过BIAcore表面胞质共振分析说明特性。
二硫键连接的A6 TCR与pMHC结合的BIAcore分析如在实施例3中所描述进行。图96显示二硫键连接的A6可溶性TCR与其配对的pMHC特异结合的BIAcore分析。
掺入Cβ1恒定区的具有新二硫键的可溶性A6 TCR对其配对pMHC的Kd值为2.42±0.55μM。该值与实施例3中所测定的掺入Cβ2恒定区的具有新二硫键的可溶性A6 TCR的Kd值(1.8μM)非常接近。
实施例13-β链中掺入“自由”半胱氨酸的具有新二硫键的可溶性A6TCR的产生TCRs的β链恒定区包括一个不参与链间或链内二硫键形成的半胱氨酸残基(TRBC1*01和TRBC2*01外显子1的75位残基)。先前描述的所有实施例中，产生具有新二硫键的可溶性TCRs时，该“自由”半胱氨酸均已突变为丙氨酸以避免形成可能的导致功能性TCR产量降低的“不适宜”二硫键。本实施例证明可产生掺入该“自由”半胱氨酸的可溶性TCRs。
引物设计及TCRβ链的突变将TCRβ-链的丙氨酸(TRBC1*01和TRBC2*01外显子1的75位残基)突变为半胱氨酸时，设计以下的引物(突变以小写字母显示)5’-T GAC TCC AGA TAC tgT CTG AGC AGC CG5’-CG GCT GCT CAG Aca GTA TCT GGA GTC A可溶性TCR的PCR诱变、表达和重折叠的进行如实施例2中所描述。
经重折叠的可溶性TCR的纯化将经透析的重折叠物加到Akta净化器(Pharmacia)的POROS 50HQ阴离子交换柱，并以0-500mM NaCl梯度用多于50倍柱体积洗脱结合的蛋白质以从降解产物和杂质中分离出sTCR，如在图98中所示，以从降解产物和杂质中分离出sTCR。峰级分储存在4℃并通过考马斯染色SDS-PAGE(图99)进行分析，之后合并并浓缩。最后，应用HBS-EP缓冲液(10mM HEPES pH7.4、150mM NaCl、3.5mM EDTA、0.05％NP40)预平衡的Superdex 200HR凝胶过滤柱(图100)对sTCR进行纯化和表征。收集并浓缩在相对分子量约为50kDa处的洗脱峰，之后通过BIAcore表面胞质共振分析说明其特征。
二硫键连接的A6 TCR与pMHC结合的BIAcore分析的进行如实施例3中所描述。图101显示二硫键连接的A6可溶性TCR与其匹配的pMHC特异结合的BIAcore分析。
β链中掺入“自由”半胱氨酸的具有新二硫键的可溶性A6 TCR对其匹配的pMHC的Kd值为21.39±3.55μM。
实施例14-其β链中的“自由”半胱氨酸突变为丝氨酸的具有新二硫键的可溶性A6 TCR的产生。
本实施例证明，可成功产生其β链中的“自由”半胱氨酸(TRBC1*01和TRBC2*01外显子1的75位残基)突变为丝氨酸的具有新二硫键的可溶性TCRs。
引物设计及TCRβ链诱变将TCRβ-链的丙氨酸(先前其替换了天然半胱氨酸(TRBC1*01和TRBC2*01外显子1的75位残基))替换为丝氨酸时，设计以下的引物(突变以小写字母显示)5’-T GAC TCC AGA TAC tCT CTG AGC AGC CG5’-CG GCT GCT CAG AGa GTA TCT GGA GTC A可溶性TCR的PCR诱变(导致产生如图102中所示的突变β链)、表达和重折叠的进行如实施例2中所示。
经重折叠的可溶性TCR的纯化将经透析的重折叠物加到Akta净化器(Pharmacia)的POROS 50HQ阴离子交换柱，并以0-500mM NaCl梯度用多于50倍柱体积洗脱结合的蛋白质，以从降解产物和杂质中分离出sTCR如在图103中所示，以从降解产物和杂质中分离出sTCR。峰级分储存在4℃并通过考马斯染色SDS-PAGE(图104)进行分析，之后合并并浓缩。最后，应用HBS-EP缓冲液(10mM HEPES pH7.4、150mM NaCl、3.5mM EDTA、0.05％NP40)预平衡的Superdex 200HR凝胶过滤柱(图105)对sTCR进行纯化和表征。收集并浓缩在相对分子量约为50kDa处的洗脱峰，之后通过BIAcore表面胞质共振分析说明其特征。
二硫键连接的A6 TCR与pMHC结合的BIAcore分析的进行如实施例3中所描述。图106显示二硫键连接的A6可溶性TCR与其匹配的pMHC特异结合的BIAcore分析。
β链中的“自由”半胱氨酸突变为丝氨酸的具有新二硫键的可溶性A6TCR对其匹配的pMHC的Kd值为2.98±0.27μM。该值与实施例3中所测定的β链中“自由”半胱氨酸突变为丙氨酸的具有新二硫键的可溶性A6TCR的Kd值(1.8μM)非常接近。
实施例15-含新二硫键的NY-ESO TCRα和β链克隆到酵母表达载体NY-ESO TCRα和β链与来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的前原交配因子α序列的C末端融合并分别克隆到酵母表达载体pYX122和pYX112中(参见图107和108)。
设计以下的引物以PCR扩增来自酿酒酵母SEY6210菌株的前原交配因子α序列(Robinson等(1991)，分子细胞生物学(Mol Cell Biol.)11(12)5813-24)，以用于与TCRα链的融合。
5’-TCT GAA TTC ATG AGA TTT CCT TCA ATT TTT AC-3’5’-TCA CCT CCT GGG CTT CAG CCT CTC TTT TAT C-3’设计以下的引物以PCR扩增来自酿酒酵母SEY6210菌株的前原交配因子α序列以用于与TCRβ链的融合。
5’-TCT GAA TTC ATG AGA TTT CCT TCA ATT TTT AC-3’5’-GTG TCT CGA GTT AGT CTG CTC TAC CCC AGG C-3’将酿酒酵母SEY6210菌株的一个菌落重悬在30μl的0.25％SDS水溶液中并于90℃加热3分钟制备酵母DNA。用于与TCRα和β链融合的前原交配因子α序列通过PCR扩增0.25μl的酵母DNA产生，所述扩增应用以上提及的相应引物以及以下的PCR条件。12.5pmoles的每一引物与200μM dNTP、5μl的10x Pfu缓冲液和1.25单位的Pfu聚合酶(Stratagene)混合，终体积为50μl。将反应混合物在Hybaid PCR express PCR仪中经92℃30秒的起始变性之后，进行30轮的变性(92℃，30秒)、退火(46.9℃，60秒)和延伸(72℃，2分钟)。
设计以下的引物，PCR扩增用于与以上提及的前原交配因子α序列融合的TCRα链。
5’-GGC TGA AGC CCA GGA GGT GAC ACA GAT TCC-3’5’-CTC CTC TCG AGT TAG GAA CTT TCT GGG CTG GG-3’设计以下的引物，PCR扩增用于与以上提及的前原交配因子α序列融合的TCRβ链。
5’-GGC TGA AGC CGG CGT CAC TCA GAC CCC AAA AT-3’5’-GTG TCT CGA GTT AGT CTG CTC TAC CCC AGG C-3’PCR扩增TCRα和β链的条件与以上提及的基本相同，不同之处在于用于扩增TCRα和β链的DNA模板分别为NY-ESO TCRα和β链(如实施例5中所制备的)；以及应用的退火温度为60.1℃。
然后将PCR产物用于PCR接合反应中，利用最初PCR产物中导入的互补交错序列产生全长的嵌合基因。用限制性酶EcoR I和Xho I消化产生的PCR产物并克隆到同样酶切的pYX122或pYX112中。根据生产商的使用说明用QiagenTMmini-prep柱纯化产生的质粒，并利用Genetics Ltd，Queensway，New Milton，Hampshire，United Kingdom的测序设备通过自动测序证实序列。图109和110显示克隆的嵌合产物的DNA和蛋白质序列。
实施例16-含新二硫键的可溶性NY-ESO TCR在酵母中的表达如实施例15中描述产生的分别含TCRα和β链的酵母表达质粒共转染入酿酒酵母SEY6210菌株中，所述转染应用Agatep等(1998)(在线技术诀窍(Technical Tips Online)(http//tto.trends.com)151P01525)的方法。生长在含组氨酸和尿嘧啶的SD(synthetic dropout)琼脂(Qbiogene，Illkirch，France)上的单菌落在10ml SD的含组氨酸和尿嘧啶的培养基中30℃过夜培养。过夜培养物以1∶10比例再次在10ml的含组氨酸和尿嘧啶的新鲜SD培养基中30℃培养4小时。用Heraeus Megafuge 2.0R(Kendro LaboratoryProducts Ltd，Bishop′s Stortford，Hertfordshire，UK)以3800转/分钟离心培养物5分钟并回收上清。将5μl的StratClean树脂(Stratagene)与上清混合并在blood wheel中4℃过夜旋转。在Heraeus Megafuge 2.0R中以3800转/分钟离心沉淀StrataClean树脂并弃去培养基。将25μl的还原性样本缓冲液(含50μl的2M DTT的950μl Laemmli样本缓冲液(Biorad))加到树脂并将样本在95℃加热5分钟，然后冰上冷却，之后将20μl的混合物加到SDS-PAGE凝胶上，以0.8mA恒流/cm2凝胶面积电泳1小时。将凝胶中的蛋白质转移到免疫印迹PVDF膜(Bio-Rad)上并与TCR抗α链抗体杂交，如以下的实施例17中所描述，其不同之处在以下列出。分别应用1∶200和1∶1000稀释的一级抗体(TCR抗α链)和二级抗体。图111显示生成的膜的图像。结果显示培养基中的酵母培养物存在低水平的TCR分泌。
实施例17-含二硫键的A6 Tax TCRα和β链在杆状病毒中的表达克隆策略含二硫键的A6 Tax TCR的α和β链从pGMT7克隆到基于pBlueScript KS2-的载体pEX172。该载体设计为用于克隆不同的II类MHC的β链，用于昆虫细胞表达，该载体具有DRB1*0101的先导序列、用于插入不同的编码肽的序列的AgeI位点、接头区以及在Jun亮氨酸拉链序列前克隆DRβ链的MluI和SalI位点。pEX 172区别于pBlueScript IIKS-的序列位于pBlueScript II KS-的KpnI和EcoRI位点间，如图112中显示。为将TCR链克隆到昆虫细胞，用AgeI和SalI消化该pEX172以移去接头区和MluI位点，并将TCR链置入肽序列起始处。TCR序列克隆自pGMT7的5’端的BspEI位点(该位点具有AgeI兼容的粘性末端)和3’端的SalI位点。为提供用于移除DRβ先导序列的切割位点，保留DRβ链(GDT)起始的三个残基。为防止转录出Jun亮氨酸拉链序列，必须在SalI位点前插入终止密码子。该构建体的示意图参见图113。一旦TCR链位于该质粒内，即将BamHI片段切下并亚克隆到pAcAB3载体，所述载体具有用于杆状病毒的同源重组位点。pAcAB3载体具有两个不同位点的启动子，其一具有BamHI位点而另一个具有BglII克隆位点。A6 TCRβ-链中存在BglII位点，因此将A6 TCRα-链插入到BglII位点，然后将β-链亚克隆到BamHI位点。
根据以上克隆策略，设计以下的引物(大写字母与载体同源)A6αF5’-gtagtccggagacaccggaCAGAAGGAAGTGGAGCAGAACR5’-gtaggtcgacTAGGAACTTTCTGGGCTGGGA6βF5’-gtagtccggagacaccggaAACGCTGGTGTCACTCAGAR5’-gtaggtcgacTAGTCTGCTCTACCCCAGGPCR、克隆和亚克隆含二硫键的A6 Tax TCRα或β链基因的表达质粒用作以下PCR反应的模板。100ng的α质粒与1μl 10mM dNTP、5μl 10xPfu-缓冲液(Stratagene)、1.25单位的Pfu聚合酶(Stratagene)、50pmol的上述A6α引物混合，且用水将终体积调整为50μl。建立用于β链的类似反应混合物，应用β质粒和β引物对。反应混合物在Hybaid PCR express PCR仪中进行35轮的变性(95℃，60秒)、退火(50℃，60秒)和延伸(72℃，8分钟)。然后用10单位的BspEI限制性酶将产物于37℃消化2小时，然后用10单位的SalI(New England Biolabs)进一步消化2小时。这些消化的反应液与已经AgeI和SalI消化的pEX172连接，转化到感受态XL1-Blue细菌中并在37℃培养18小时。从每一α和β转化板中挑取单菌落并在5ml的TYP+氨苄青霉素(16g/l细菌用胰蛋白胨、16g/l酵母提取物、5g/lNaCl、2.5g/lK2HPO4、100mg/l氨苄青霉素)中过夜培养。根据生产商的使用说明用QIAgen mini-prep柱纯化质粒DNA，并利用Genetix的测序设备通过自动测序证实序列。α链和β链的BamHI插入的氨基酸序列分别在图114和115中显示。
这些pEX172中的α和β二硫键的A6 Tax TCR链构建体用BamHI限制性酶(New England Biolabs)37℃消化2小时。α链BamHI插入序列连接到已用BglII酶消化的pAcAB3载体(Pharmingen-BD Biosciences21216P)。将其转化到感受态XL1-Blue细菌并于37℃培养18小时。从此平板上挑取单菌落并在5ml的TYP+氨苄青霉素中过夜培养并纯化质粒DNA，方法如前。然后用BamHI消化该质粒并连入β链BamHI插入序列，转化感受态XL1-Blue细菌，过夜培养，挑选到TYP-氨苄青霉素中并培养，之后用QIAgen mini-prep柱纯化DNA，方法如前。应用以下的测序引物通过测序证实具有正确方向的α和β链pAcAB3α正向5’-gaaattatgcatttgaggatgpAcAB3β正向5’-attaggcctctagagatccgA6 TCR在昆虫细胞中的转化、感染、表达和分析含α-链和β-链的表达质粒转化到在无血清培养基(Pharmingen-BDBiosciences551411)中培养的sf9细胞(Pharmingen-BD Biosciences21300C)，所述转化应用Baculogold转化试剂盒(Pharmingen-BDBiosciences21100K)，按生产商的使用说明书操作。27℃培养5天后，将转化细胞生长于其中的200μl培养基加到100ml的在无血清培养基中培养密度为1×106个细胞/ml的High Five细胞中。27℃继续培养6天后，取1ml的该培养基并在Hereus microfuge中13,000转/分钟离心5分钟以沉淀细胞残渣。
10μl该昆虫的A6二硫键连接的TCR的上清与阳性对照一同跑胶，所述阳性对照为5μg和10μg细菌的A6二硫键连接的TCR，胶为预制的4-20％Tris/甘氨酸凝胶(InvitrogenEC60252)。通过加入10μl的还原性样本缓冲液(950μl的Laemmli样本缓冲液(Bio-Rad161-0737)、50μl的2MDTT)并在95℃加热5分钟制备还原样本，室温冷却10分钟然后加样20μl。通过加入10μl的Laemmli样本缓冲液制备非还原样本，并加样20μl。
凝胶在Novex-Xcell凝胶槽中以150伏电泳1小时，之后在50ml的考马斯凝胶染色液(1.1g的考马斯粉溶于500ml的甲醇中搅拌1小时，加入100ml的乙酸，用水将体积调整为1升并搅拌1小时，然后用0.45μM的滤器过滤)中染色1小时，其间轻轻搅拌。在50ml的去染色液(不含考马斯粉，其余与考马斯染色液相同)中将凝胶去染色三次30分钟，其间轻轻搅拌。
如前所示通过SDS-PAGE胶进行Western印迹，不同之处在于蛋白质转移到免疫印迹PVDF膜(Bio-Rad162-0174)上而不是用考马斯对凝胶进行染色。将六张滤纸切成凝胶大小并浸到转移缓冲液(将2.39g甘氨酸、5.81g的Tris碱、0.77g DTT溶解在500ml水中，加入200ml甲醇，然后用水将体积调整到1000ml)中。在甲醇中浸泡1分钟且然后在转移缓冲液中浸泡2分钟制备PVDF膜。将三张滤纸放置于免疫印迹仪器(Pharmacia-Novablot)的阳极表面，然后将膜放置在顶端，之后放入胶，最后在阴极侧放置另外三张滤纸。以0.8mA恒流/cm2凝胶面积进行免疫印迹1小时。
印迹过后，在7.5ml的封闭缓冲液(4片Tris-缓冲盐(SigmaT5030)、3g脱脂奶粉SigmaM7409)、30μl的Tween 20，用水调整到30ml)封闭膜60分钟，其间轻轻搅动。用TBS洗涤缓冲液(20片TBS、150μl Tween 20，用水调整到300ml)洗涤膜三次，每次5分钟。然后将膜与1∶50稀释的抗TCRα链克隆3A8(SerotecMCA987)或抗TCRβ链克隆8A3(SerotecMCA988)一级抗体孵育，所述孵育在7.5ml的封闭缓冲液中进行1小时，其间轻轻搅动。如前所述在TBS洗涤缓冲液中洗涤膜。之后，在7.5ml的封闭缓冲液中与1∶1000稀释的HRP标记的山羊抗小鼠二级抗体(SantaCruz BiotechSc-2005)孵育30分钟，其间轻轻搅动。如前所述洗涤膜，然后在用2片TBS配制的30ml水中洗涤。
通过Opti-4CN比色检测(Biorad170-8235)(1.4ml Opt-4CN稀释液、12.6ml H2O、0.28ml Opti-4CN底物)测定抗体结合。膜显色30分钟，然后在水中洗涤15分钟。膜于室温干燥，并将扫描图像与考马斯染色凝胶的图像进行比对(图116)。
结果从图116可看出，两种含二硫键的TCRs均形成在SDS凝胶中稳定的异源二聚体。这两种TCRs还原后均分裂成α和β链。昆虫产生的含二硫键的TCR异源二聚体的分子量略大于细菌产生的相应二聚体，可能是由于昆虫细胞的糖基化作用。从本实施例可看出昆虫细胞产生过量的α链，且在抗αwestern印迹的非还原泳道可观察到游离α链。
这些数据明确表明，以上描述的杆状病毒表达系统提供了含新二硫键的可溶性TCRs原核表达的可行备选方案。
权利要求
1.可溶性T细胞受体(sTCR)，其包含(i)除外其跨膜结构域的全部或部分的TCRα链，和(ii)除外其跨膜结构域的全部或部分的TCRβ链，其中(i)和(ii)均包含TCR链的功能性可变结构域和至少一部分的恒定结构域，且由不存在于天然TCR恒定结构域残基间的二硫键连接。
2.权利要求1中所要求的sTCR，其中(i)和(ii)中的一条链或两条链包含TCR链的全部胞外恒定Ig结构域。
3.权利要求1或权利要求2所述的sTCR，其中(i)和(ii)中的一条链或两条链包含TCR链的全部胞外结构域。
4.可溶性αβ-形式的T细胞受体(sTCR)，其中α链恒定结构域免疫球蛋白区的一个残基与β链恒定结构域免疫球蛋白区的一个残基通过共价二硫键连接。
5.前述权利要求中任意一项所述的sTCR，其中天然TCR中不存在链间二硫键。
6.权利要求5所述的sTCR，其中天然α和βTCR链在C末端进行截断以去除形成天然链间二硫键的半胱氨酸残基。
7.权利要求5所述的sTCR，其中形成天然链间二硫键的半胱氨酸残基替换为另一残基。
8.权利要求7所述的sTCR，其中形成天然链间二硫键的半胱氨酸残基替换为丝氨酸或丙氨酸。
9.前述权利中任意一项所述的sTCR，其中存在于天然TCRβ链中的未配对半胱氨酸残基是不存在的。
10.前述权利要求中任意一项所述的sTCR，其中形成不存在于天然TCR中的二硫键的半胱氨酸残基替换了天然TCR结构中其β碳原子的距离小于0.6nm的残基。
11.前述权利要求中任意一项所述的sTCR，其中形成不存在于天然TCR中的二硫键的半胱氨酸残基替换了TRAC*01外显子1的Thr 48和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Ser 57。
12.权利要求1到10中任何一项所述的sTCR，其中形成不存在于天然TCR中的二硫键的半胱氨酸残基替换了TRAC*01外显子1的Thr 45和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Ser 77。
13.权利要求1到10中任何一项所述的sTCR，其中形成不存在于天然TCR中的二硫键的半胱氨酸残基替换了TRAC*01外显子1的Thr 10和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Ser 17。
14.权利要求1到10中任何一项所述的sTCR，其中形成不存在于天然TCR中的二硫键的半胱氨酸残基替换了TRAC*01外显子1的Thr 45和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Asp 59。
15.权利要求1到10中任何一项所述的sTCR，其中形成不存在于天然TCR中的二硫键的半胱氨酸残基替换了TRAC*01外显子1的Ser 15和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Glu 15。
16.权利要求1、2和5到15中任何一项所述的sTCR，其中(i)和(ii)中的每一条链包含的第一TCR的功能性可变结构域均与第二TCR全部或部分的恒定结构域融合，第一和第二TCRs来自同一物种。
17.权利要求16所述的sTCR，其中第二TCR的恒定结构域的N末端截短到形成非天然链间二硫键的残基。
18.前述权利要求中任意一项所述的sTCR，其中一条或两条链在其C或N末端与另一分子衍生或融合。
19.前述权利要求中任意一项所述的sTCR，其中一条或两条两在其C和/或N末端具有可与分子融合的半胱氨酸残基。
20.前述权利要求中任意一项所述的sTCR，其进一步包含可检测标记。
21.前述权利要求中任意一项所述的与治疗剂相联的sTCR。
22.多价T细胞受体(TCR)复合体，其包含多种前述权利要求中任意一项所述的sTCR。
23.权利要求22所述的复合体，其包含sTCR多聚体。
24.权利要求23所述的复合体，其包含两个、三个、四个或更多的T细胞受体分子相互连接，所述连接优选地通过接头分子进行。
25.权利要求22、23或24所述的复合体，其中sTCRs或sTCR多聚体存在于脂双分子层中或连接到颗粒上。
26.用于检测MHC-肽复合体的方法，其包括(i)提供权利要求1到21中任何一项所述的可溶性TCR或提供权利要求22到25中任何一项所述的多价T细胞受体复合体；(ii)将可溶性TCR或多价TCR复合体与MHC-肽复合体接触；以及(iii)检测可溶性TCR或多价TCR复合体与MHC-肽复合体的结合。
27.药物制剂，其包含权利要求1到21中任何一项所述的sTCR，和/或权利要求22到25中任何一项所述的多价TCR复合体，并包含可药用载体。
28.核酸分子，其包含编码权利要求1到21中任何一项所述的sTCR的(i)或(ii)的序列，或其互补序列。
29.包含权利要求28中所述核酸分子的载体。
30.包含权利要求29中所述载体的宿主细胞。
31.获得权利要求1到21中任何一项所定义的(i)或(ii)的方法，该方法包括在引起所述肽表达的条件下孵育权利要求30所述的宿主细胞，以及然后纯化所述多肽。
32.权利要求31所述的方法，其还包括在适宜的重折叠条件下将(i)和(ii)混合。
全文摘要
本发明提供了可溶性T细胞受体(sTCR)，其包含(i)除其跨膜结构域外的TCRα链的全部或一部分，以及(ii)除其跨膜结构域外的TCRβ链的全部或一部分。(i)和(ii)均包含TCR链的功能性可变结构域和至少一部分的恒定结构域，且通过不存在于天然TCR中的恒定结构域残基间的二硫键进行连接。
文档编号A61K48/00GK1561343SQ02819279
公开日2005年1月5日 申请日期2002年8月30日 优先权日2001年8月31日
发明者B·K·雅各布森, M·格利克 申请人:艾维德克斯有限公司