新的高效基因载体及其制备和用图
【专利摘要】本发明公开了一种新颖的含有树枝状大分子的基因载体的制备和用途，这种基因载体是以树枝状大分子和亲水链状化合物组成的基因载体，本发明公开了其制备方法和用途。该基因载体是一种低毒高效的基因载体，可以增加胞吞作用，并且快速进入细胞质中，增加肿瘤细胞胞吞治疗基因，也可以携带基因进入细胞核的基因载体，并且具有降低肿瘤细胞耐药性，并能提高细胞的抗氧化能力。
【专利说明】
新的高效基因载体及其制备和用途
技术领域
[0001] 本发明公开了一种新颖的含有树枝状大分子的基因载体的制备和用途，这种基因 载体是以树枝状大分子和亲水链状化合物组成的基因载体，本发明公开了其制备方法和用 途。该基因载体是一种低毒高效的基因载体，可以增加胞吞作用，并且快速进入细胞质中， 增加肿瘤细胞胞吞治疗基因，也可以携带基因进入细胞核的基因载体，并且具有降低肿瘤 细胞耐药性，并能提尚细胞的抗氧化能力。
【背景技术】
[0002] 在未来的临床治疗中，个性化的基因治疗取代化学药物治疗疾病已经成为科学界 的共识，目前最大的障碍如何高效地把外源的基因导入到靶细胞中，或是相应的环境中，使 之能纠正或补偿基因缺陷或是异常引起的疾病，简单地说就是如何把外源基因或是遗传信 息通过基因转移技术将其插入到受体细胞中。那么核心问题落到基因载体上。
[0003] 目前基因载体技术日益发展，主要分为病毒载体和非病毒载体。由于机体免疫问 题和宿主整合风险等问题，病毒载体基本不会作为未来临床治疗的首选。非病毒载体的开 发是科学家目前工作的重点领域。重点即是高转染率和低毒性。
[0004] 本发明公开了一种新颖的含有树枝状大分子的基因载体的制备和用途，这种基因 载体是以树枝状大分子和亲水链状化合物组成的基因载体，本发明公开了其制备方法和用 途。该基因载体是一种低毒高效的基因载体，可以增加胞吞作用，并且快速进入细胞质中， 增加肿瘤细胞胞吞治疗基因，也可以携带基因进入细胞核的基因载体，并且具有降低肿瘤 细胞耐药性，并能提尚细胞的抗氧化能力。
【发明内容】
[0005] 如下式所示的结构中一种新的含树枝状大分子的化合物，其特点为由近似球状的 树枝状大分子和一段亲水链状化合物构成，形成一个新的含有树枝状大分子结构的化合 物，其结构如下：
[0006] :i
.1. .1 (
[0007] 其中
[0008]
[0009] 结构中的S-S为树枝状大分子的内核，该结构表不近似球状的高度枝化的m代树 枝状大分子，其中m为树枝状大分子的代数，m取0-50之间的整数以及0. 5的倍数，而结构 中的Linker代表一种带有三个枝岔分支的分枝状结构化合物，一个分枝与亲水链连接，另 两个分枝与半个树枝状大分子的核心部分化学连接，形成一个含树枝状大分子为头部，亲 水链状化合物为尾部的化合物。该分枝状化合物含有可与-SH反应的活性基团。该分枝状 化合物，优选
[0010]
[0011] 化合物的结构中的亲水链为一段亲水的长链形状的化合物，选自聚乙烯醇，多糖， 聚乙二醇，聚吡咯烷酮，聚醚，聚氧乙烯嵌段共聚物，或是它们的共聚物。优选亲水链尾端为 羟基的结构。
[0012]
[0013] 本发明所发明的化合物的制备方法，其特征在于：
[0014] 1)将以S-S为核心的树枝状大分子Gm，其中m为树枝状大分子的代数，m取0-50 之间的整数以及〇. 5的倍数，G"在维生素 C、二硫苏糖醇或是亚硫酸氢钠的催化下分解为带 有SH健活性的半个树枝状大分子Gm的A ;
[0015] 2)分枝状化合物Linker与线性的亲水链化合物Hydrophilic Chain-侧偶联生 成带有分枝结构的线性化合物B ;
[0016] 3) -倍摩尔的化合物B与两倍摩尔的化合物A在0-20度的溶剂中过夜搅拌反应， 分枝的两侧分别与半个树枝状化合物A的内核的SH反应，反应得到含树枝状大分子的化合 物C ;
[0017] 4)将制备所得的化合物C在真空干燥箱中冻干24-96小时，得到最终产品备用；
[0018] 反应所述结构如下
[0019] 树枝状大分子化合物Gm :
[0020]
[0021] 化合物A:
[0022]
[0023] 化合物B:
[0024]
[0025] 其中该结构
[0026]
[0027] 属于Linker结构内的结构；
[0028] 化合物C:
[0029]
[0030] 。其中化学步骤1-4选用溶剂选自：甲醇、二氯甲烷、二甲基亚砜、乙醇、甲醚、乙 醚、石油醚、苯、甲苯、吡啶、四氢呋喃、三氟乙酸、氯仿、四氯化碳、3- (2-吡啶二巯基）丙酸 N-羟基琥珀酰亚胺酯、磷酸三（2-氯乙基）酯、二氯甲烷、N，N-二甲基甲酰胺、Ν，Ν'-二环 己基碳二亚胺中的一种或多种。
[0031] 本发明的制备方法具体如下：
[0032] 1)将以S-S为核心的树枝状大分子Gm(可商购），其中m为树枝状大分子的代数， m取0-50之间的整数以及0. 5的倍数，G"在维生素 C(可商购）、二硫苏糖醇（可商购）或 是亚硫酸氢钠（可商购）的催化下在有机溶液中还原分解为带有SH健活性的半个树枝状 大分子Gja a ;
[0033] 2)分枝状化合物Linker (可商购，也可制备）与一段线性的亲水性的链状化合物 (可商购，也可制备）在PH为5-9的条件下，常温反应1-48小时反应偶联生成带有分支结 构的化合物B，而后冻干备用；
[0034] 3) -倍摩尔的化合物B与两倍摩尔的化合物A在0-20度的溶剂中过夜低速 50rpm-500rpm搅拌反应，反应得到含有药物结构的树枝状化合物C ;
[0035] 4)将制备所得的以非易溶于水的药物结构为核心的树枝状化合物C直接洗涤后 冻干备用；或是加入冻干保护剂（山梨酸钾，甘露醇，羧甲基纤维素钠等），在真空干燥箱中 冻干24_96小时，得到最终广品备用；
[0036] 化合物C冻干后备用。
[0037] 在未来的临床治疗中，个性化的基因治疗取代化学药物治疗疾病已经成为科学界 的共识，目前最大的障碍如何高效地把外源的基因导入到靶细胞中，或是相应的环境中，使 之能纠正或补偿基因缺陷或是异常引起的疾病，简单地说就是如何把外源基因或是遗传信 息通过基因转移技术将其插入到受体细胞中。那么核心问题落到基因载体上。目前基因载 体技术日益发展，主要分为病毒载体和非病毒载体。由于机体免疫问题和宿主整合风险等 问题，病毒载体基本不会作为未来临床治疗的首选。非病毒载体的开发是科学家目前工作 的重点领域。重点即是高转染率和低毒性。本发明公开了一种新颖的含有树枝状大分子的 基因载体的制备和用途，这种基因载体是以树枝状大分子和亲水链状化合物组成的基因载 体，本发明公开了其制备方法和用途。该基因载体是一种低毒高效的基因载体，可以增加胞 吞作用，并且快速进入细胞质中，增加肿瘤细胞胞吞治疗基因，也可以携带基因进入细胞核 的基因载体，并且具有降低肿瘤细胞耐药性，并能提高细胞的抗氧化能力。
[0038] 综上所述，本发明的基因载体的应用将带来重大的社会意义和科学意义。
【附图说明】：
[0039] 图1实施例1的终产物的核磁共振图谱。
[0040] 图2实施例2的终产物的核磁共振图谱。 图3实施例1作为基因载体的细胞胞吞实验共聚焦显微镜图谱，其中白色小圆点代表 罗丹明标记的载体。 图4 G4作为基因载体的细胞胞吞实验共聚焦显微镜图谱，其中白色小圆点代表罗丹明 标记的载体。
【具体实施方式】
[0041] 下面具体实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明不仅局限以下实施例。制 备实施例如下：
[0042] 实施例1
[0043] 1)将以S-S为核心的树枝状大分子聚酰胺-胺G4(商购），在亚硫酸氢钠（商购） 的催化下24小时在二氯甲烷溶液中还原分解为带有SH健活性的半个树枝状大分子G4;
[0045] 还原为
[0046]
[0047] 2)分枝状化合物Linker (可商购，也可制备）在PH为8的条件下，常温条件下，与 一端带羧基的另一端以羟基为结尾的聚乙二醇（商购）反应20小时反应偶联生成带有分 支结构的化合物B，而后冻干备用；
[0048]
[0049]
[0050] η 约等于 50。
[0051] 3) -摩尔的化合物Β与两摩尔的化合物Α在10度的Ν，Ν' -二环己基碳二亚胺和 氯仿溶液中过夜低速l〇〇rpm搅拌反应，反应得到含有药物结构的树枝状化合物C ;
[0052]
[0053]
?
[0055] 4)将制备所得的以不易溶于水的药物结构为核心的树枝状化合物C在水溶液中 洗涤后，在真空干燥箱中冻干48小时，得到最终产品备用；
[0056] 实施例2
[0057] 1)将以S-S为核心的树枝状大分子聚酰胺-胺G1 (商购），在维生素 C (商购）的 催化下24小时在二甲基亚砜溶液中还原分解为带有SH健活性的半个树枝状大分子G1 ;
[0058]
[0060] 2)分枝状化合物LinkerA(可商购，也可制备）在N, N-二甲基甲酰胺和三氟乙酸 催化下加入乙酸酐生成LinkerB (也可商购），而后LinkerB在PH为6. 5的条件下，常温下 与一端带有氨基的另一端带有羟基结尾的聚乙二醇（商购）反应24小时反应偶联生成带 有分支结构的化合物B，而后冻干备用；
[0063] η约等于80
[0064] 3) -摩尔的化合物Β与两摩尔的化合物Α在20度的石油醚的水溶液中过夜低速 200rpm搅拌反应，反应得到含有药物结构的树枝状化合物C ;
[0065]
[0066] 4)将制备所得的以非易溶于水的药物结构为核心的树枝状化合物C在水溶液中 洗涤后，在真空干燥箱中冻干24小时，得到最终产品备用；
[0067] 效果实验如下：
[0068] 将实施例1-2制备的冻干样品以及树枝状大分子聚酰胺胺PAMAM G1和G4 (商购 于sigma)用蒸馏水溶液配置成10mg/100ml的用药组，携带基因治疗H22荷瘤小鼠情况进 行药效学比较。
[0069] 制备H22肝癌小鼠模型，按照传统方法，将H22细胞植入小鼠腋下，制备H22核瘤 小鼠模型后，分为6组，即对照组（不用药），P27直接给药组，实施例1-2制备的样品以及 G1和G4 (商购）携带P27组，每组20只小鼠。
[0070] 将实施例1-2制备的样品以及PAMAM 1代和4代树枝状高分子携带P27。（携带 等量P27,每组含10ul P27)，分别瘤内注射各组小鼠体内，试验2周后，处死小鼠，取瘤用卡 尺测量体积，结果如下。
[0071] 表瘤大小比较
[0072] 表1肿瘤体积（单位：cm2)
[0073]
[0074] 将实施例1-2, G1和G4的氨基偶联罗丹明，将其放入培养好的SCC15 口腔癌细胞 中，而后培养1小时，各种基因载体均放入等量浓度lug/ml，DAPI染色细胞核，在共聚焦显 微镜下可观察到，实施例1-2可以将进入到细胞核，而且非常迅速，在1小时内即可大量进 入细胞内，而G1和G4不能进入细胞核，而且在1小时内只有少量载体进入细胞质。从图3 及图4的大的近似圆形图案中（大的近似圆形图案代表细胞核）可以看出，实施例1，2毒 性非常小，小于G1和G4.
[0075]
[0076]
[0077] 制备口腔癌小鼠模型，分为6组，即对照组（不用药），SURVIVIN基因直接给药组， 实施例1-2制备的样品以及G1和G4(商购）携带SURVIVIN基因组，每组8只小鼠。
[0080]
[0078]
[0083] 其中，GST越高代表耐药性越强，H0-1越高，抗氧化能力越强。
[0079] 将实施例1-2制备的样品以及PAMAM 1代和4代树枝状高分子携带SURVIVIN基 因。（携带等量SURVIVIN基因，每组含10ul)，分别静脉注射各组小鼠体内，试验2周后，处 死小鼠，取瘤用免疫荧光手段检测，记录Ho-Ι和GST蛋白酶的表达暈（mmol/mm 2)
[0081]
[0082]
【主权项】
1. 如下式所示的结构中一种新的含树枝状大分子的化合物，其特点为由近似球状的树 枝状大分子和一段亲水链状化合物构成，形成一个新的含有树枝状大分子结构的化合物， 其结构如下：〇?2. 权利要求1的化合物的结构中的代表以二硫键为内核的，近似球状的高度枝化的m代树枝状大分子，其中m为树枝状 大分子的代数，m取0-50之间的整数以及0. 5的倍数。3. 权利要求1的化合物，其中结构中的Linker代表一种带有三个枝岔分支的分枝状结 构化合物，一个分枝与亲水链连接，另两个分枝与半个树枝状大分子的核心部分化学连接， 形成一个含树枝状大分子和亲水链状化合物的新化合物，化合物的结构中的亲水链为一段 亲水的长链形状的化合物，选自聚乙烯醇，多糖，聚乙二醇，聚吡咯烷酮，聚醚，聚氧乙烯嵌 段共聚物，或是它们的共聚物，分枝状化合物含有可与-SH反应的活性基团，优选亲水链尾 端为羟基的结构。4. 权利要求3的分枝状化合物，优选5. 如权利要求1-4本发明所发明的化合物的制备方法，其特征在于： 1) 将以S-S为核心的树枝状大分子Gm，其中m为树枝状大分子的代数，m取0-50之间 的整数以及〇. 5的倍数，G"在维生素C、二硫苏糖醇或是亚硫酸氢钠的催化下分解为带有SH 健活性的半个树枝状大分子G"的A ; 2) 分枝状化合物Linker与线性的亲水链化合物一侧偶联生成带有分枝结构的线性化 合物B ; 3) -倍摩尔的化合物B与两倍摩尔的化合物A在0-20度的溶剂中过夜搅拌反应，分 枝的两侧分别与半个树枝状化合物A的内核的SH反应，反应得到含树枝状大分子的化合物 C； 4) 将制备所得的化合物C在真空干燥箱中冻干24-96小时，得到最终产品备用； 反应所述结构如下 树枝状大分子化合物Gm :化合物A:化合物B:属于Linker结构内的结构； 化合物C:o6. 权利要求1-5的化合物的用途，该化合物用途为一种高效的基因给药的载体。7. 权利要求1-5的化合物的用途，该发明的基因载体是一种低毒性的基因载体，可以 增加胞吞作用，并且快速进入细胞质中，增加肿瘤细胞胞吞治疗基因。8. 权利要求1-5的化合物的用途，该发明的基因载体是一种可以携带基因进入细胞核 的基因载体。9. 权利要求1-5的化合物的用途，该发明的基因载体可以降低肿瘤细胞的耐药性。10. 权利要求1-5的化合物的用途，该发明的基因载体可以增加抗氧化能力。
【文档编号】A61K48/00GK106046387SQ201510177948
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2015年4月15日
【发明人】韩冰, 高扬, 高尚
【申请人】韩冰