一种蛋白质接枝共聚物及其制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种蛋白质接枝共聚物，以蛋白质作为基质，高分子侧链接枝聚合在蛋白质主链上，其含有大约14.0%?94.0质量%的蛋白质和大约6%?86质量%的高分子侧链。本发明进一步涉及根据本发明的蛋白质接枝共聚物的制备方法及其用途。
【专利说明】
一种蛋白质接枝共聚物及其制备方法
技术领域
[0001 ]本发明属于高分子科学技术领域，具体涉及一种蛋白质接枝共聚物，进一步涉及 其制备方法和用途。
【背景技术】
[0002] 具有生物相容性的两亲性的聚合物由于能够自组装形成胶束，且胶束的疏水性核 能高效负载疏水性药物分子，因而在药物传输方面的应用受到广泛关注。这是因为作为药 物载体使用的聚合物胶束不仅能保护药物分子不受其它体内物质的影响，并且胶束具有被 动靶向效应，能选择性聚集在肿瘤部位，从而实现在治疗中提高疗效、降低毒副作用的目 的。
[0003] 具有刺激响应性的智能高分子材料，尤其是在水溶液中具有刺激响应性的聚合物 胶束，由于其在缓控释放、药物传输、催化体系和刺激响应性器件等方面有潜在的应用价 值，近年来引起了人们极大的兴趣。但当前文献报道的关于刺激响应性高分子药物载体材 料通常只对单一刺激作出响应。
[0004] 蛋白质和核酸类天然大分子具有生物相容性和可降解性，且体内降解产物为氨基 酸，无毒副作用，不会引起病人排泄负担。蛋白质由于其化学结构及生理活性，通常可对多 重环境因素响应，如氧化还原响应性、酶响应性等。但由于溶解性差、免疫原性等因素，蛋白 质在体内不能长时间稳定存在，不能满足药物载体材料的性能要求;而功能性高分子的引 入能赋予蛋白质结构稳定、无免疫原性、体内循环时间长等特点。因此具有多重刺激响应性 的蛋白质高分子材料对拓宽天然高分子在药物载体领域的应用具有重要意义。
[0005] 针对所述问题，本发明提供了一种蛋白质接枝共聚物，其具有双亲性，能在水溶液 中自组装形成胶束，所述胶束兼具蛋白质的多重刺激响应性和高分子的功能性，并且该类 蛋白质接枝共聚物制备方法简便、快捷。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种蛋白质接枝共聚物，以蛋白质作为基质，高分子侧链 接枝聚合在蛋白质主链上，其含有大约14.0%_94.0质量％的蛋白质和大约6%-86质量％ 的高分子侧链，优选为大约25%-69质量％的蛋白质和大约31%-75质量％的高分子侧链。
[0007] 蛋白质接枝共聚物可以基于例如巯烯加成、巯基链转移或单体接枝聚合等原理合 成。
[0008] 所述蛋白质可以为具有-SH官能团的天然蛋白质或合成蛋白质，例如角蛋白、纤维 蛋白等。所述天然蛋白质可以从羊毛（包括山羊毛和绵羊毛）、兔毛、猫毛、狗毛、猪毛、马 毛、鸟类和禽类羽毛、人类头发、动物指甲、人或动物血液中提取得到。
[0009] 所述高分子侧链是水溶性的，可以由水溶性单体聚合而成或由带有-C = C_的高分 子链加成得到。所述水溶性单体可以是N-(2_羟丙基）甲基丙烯酰胺(HPMA)、N_异丙基丙烯 酰胺(NIPAM)、甲基丙烯酸甲酯(MMA)、丙烯酰胺(AAm)、丙烯酸叔丁酯（（t)BA)、甲基丙烯酸 羟乙酯(HEMA)、4-乙烯基吡啶(4VP)、2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱(MPC)、甲基丙烯酸二甲 氨基乙酯(DMAEMA)中的一种或多种;所述带有-C = C-的高分子链可以是聚乙二醇单甲醚甲 基丙烯酸酯(MPEGMA)及其它修饰上双键的高分子链。
[0010] 根据本发明的蛋白质接枝共聚物具有双亲性，能在水溶液中自组装，其临界胶束 浓度范围为4-21yg/mL，得到的胶束在水溶液中的流体力学半径<Rh>范围为80-100nm。
[0011] 随着接枝共聚物的接枝率(接枝密度）的增加，接枝共聚物的亲水性增加，接枝共 聚物的CMC也随之增大。所述蛋白质接枝共聚物自组装得到的胶束的载药量取决于接枝共 聚物中蛋白质的含量，即：随着接枝共聚物接枝率(接枝密度)减小，接枝共聚物中蛋白质含 量增加，其组装体载药量也增加。
[0012] 在根据本发明的蛋白质接枝共聚物中，所述具有-SH官能团的天然蛋白质或合成 蛋白质含有大量的羧基、氨基、羰基等极性官能团，这些活性官能团能与抗癌药物例如阿霉 素(D0X)分子上的羧基、氨基和羟基等极性基团产生氢键作用，从而能高效负载抗癌药物， 例如阿霉素，使负载的D0X分子能稳定存在于胶束核内，胶束对D0X的载药量范围为4.9%-22.5%。由于蛋白质主链上含有可氧化的-5!1官能团，-5!1与-5-5-之间的可逆转化可赋予载 药胶束具有对还原性物质谷胱甘肽(GSH)的刺激响应性，在10mM GSH浓度条件(癌细胞内环 境)下的药物释放量高出25% (相较于ΙΟμΜ GSH，正常细胞环境）。含有赖氨酸和精氨酸的天 然蛋白质，可被癌细胞内存在的胰蛋白酶消化降解，因此蛋白质接枝共聚物制备的胶束具 有对胰蛋白酶的响应性，在胰蛋白酶存在下能充分释放出负载的药物分子，释药量最高可 达 95 %。
[0013] 材料的细胞毒性是其能否用作药物载体的决定因素。本发明的蛋白质接枝共聚物 无细胞毒性，且制备的载药胶束能有效释放药物分子进入细胞核，并能杀死乳腺癌细胞 MCF-7〇
[0014] 此外，蛋白质接枝共聚物具有蛋白质的多重刺激响应性同时，还具备侧链高分子 的功能性，例如pH响应性、温度响应性、二氧化碳响应性、氧化还原电位响应性等。
[0015] 本发明进一步涉及根据本发明的蛋白质接枝共聚物的制备方法，包括如下步骤：
[0016] 首先将蛋白质分散在水中，然后按照不同的反应配比加入自由基引发剂和适量的 单体或带有-c = c-的高分子链。反应在一定温度下进行一段时间，得到蛋白质接枝共聚物。 将得到的反应产物用具有一定截留分子量的透析袋在Milli-Q水中透析后，经冷冻干燥得 到固体的蛋白质接枝共聚物。
[0017] 在根据本发明的一个优选的实施方案中，将1重量份蛋白质分散在10-30重量份40 °C_80°C水中，然后加入0.02-0.2重量份引发剂和0.1-20重量份单体或带-C = C-的高分子， 在持续搅拌下反应大约6-24小时后，得到蛋白质接枝共聚物。
[0018] 反应结束后，可以将得到的反应产物用截留分子量为7k-20kDa的透析袋在Milli-Q水中透析1 -2天，经冷冻干燥可得到固体的蛋白接枝共聚物。
[0019] 所述引发剂为水溶性的过硫酸盐或偶氮脒类引发剂，例如过硫酸钾、2,2'_偶氮二 异丁脒盐酸盐。
[0020] 本发明所述的蛋白质接枝共聚物具有双亲性，能在水溶液中自组装形成胶束，且 胶束具有蛋白质的刺激响应性和高分子侧链的功能性。胶束能负载药物分子，且能在细胞 环境下刺激响应性释放出药物分子杀死癌细胞。
[0021] 本发明进一步涉及根据本发明的蛋白质接枝共聚物在肿瘤部位刺激响应性药物 释放中用作药物载体材料、组织工程中用作支架材料、在传感器领域用作敏感元件、环境保 护中废弃羊毛的再生利用以及在绿色化学等领域的用途。
[0022] 本发明的有益效果在于:根据本发明的蛋白质接枝共聚物具有双亲性，能在水溶 液中自组装形成胶束，且胶束具有蛋白质的刺激响应性和高分子侧链的功能性。胶束能负 载药物分子，且能在细胞环境下刺激响应性释放出药物分子。
[0023] 在现有技术中，蛋白质接枝共聚物的制备通常需要合成小分子引发剂，向蛋白质 基体上引入小分子引发剂获得聚合活性位点，然后通过自由基聚合得到，实验繁琐、制备周 期长、后处理复杂，根据本发明的方法为操作简便的一步式合成法，即无需预聚体合成、蛋 白质活性点修饰等步骤即可获得一定支链长度的蛋白质接枝共聚物，并且反应过程中不涉 及任何有机溶剂。通过选择功能性单体或带有-c = c-的高分子链，利用本发明的方法可以 简便快速制备功能性蛋白质类接枝共聚物。
【附图说明】：
[0024]图1是通过本发明的实施例合成的蛋白质接枝共聚物的核磁谱图，其中图1(a)、1 (b) 和1(c)分别对应于实施例1、2和3。
[0025]图2是以芘作为荧光探针分子测定通过本发明的实施例合成的角蛋白接枝共聚物 的临界胶束浓度曲线图，其中图2(a)中，方形标记曲线对应于实施例1;在图2(b)中，圆形标 记曲线对应于实施例2，和2 (c)圆形标记曲线对应于实施例3。
[0026] 图3是通过本发明的实施例1合成的不同接枝率的角蛋白接枝聚乙二醇制备的胶 束在氧化前后流体力学半径变化图，其中图3(a)是接枝率50%的，3(b)是接枝率63%，3(c) 是接枝率86 %。
[0027] 图4是通过本发明的实施例合成的角蛋白接枝聚乙二醇和角蛋白接枝N-(2_羟丙 基）甲基丙烯酰胺制备的载药胶束在不同条件下药物释放量随时间变化关系图，其中图4 (a)对应于实施例1，图4(b)对应于实施例2。
[0028] 图5是通过本发明的实施例合成的蛋白质接枝共聚物制备所得胶束在0.04mM胰蛋 白酶存在下流体力学半径随时间变化关系图，其中图5(a)对应于实施例1，图5(b)对应于实 施例2,图5(c)对应于实施例3。
[0029] 图6是通过本发明的实施例合成的角蛋白接枝聚乙二醇和角蛋白接枝N-(2_羟丙 基）甲基丙烯酰胺细胞毒性实验结果图，其中图6(a)和6(b)分别对应于实施例1和2。
[0030] 图7是通过本发明的实施例合成的角蛋白接枝聚乙二醇、角蛋白接枝聚N-(2_羟丙 基）甲基丙烯酰胺制备的载药胶束细胞内化后激光共聚焦照片图，其中图7(A)和7(B)分别 对应于实施例1和2;其中：（a)细胞未经任何预处理，培养0.5小时；（b)细胞经10uM GSH-OEt 处理，培养〇. 5小时；（c)细胞经10mM GSH-OEt处理，培养0.5小时；（d)未经任何处理的细胞， 培养至1.5小时；（e)经10uM GSH-OEt预处理的细胞，培养至1.5小时；（f)经10mM GSH-OEt预 处理的细胞，培养至1.5小时;细胞核用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色。
[0031] 图8是通过本发明的实施例3合成的角蛋白接枝聚N-异丙基丙烯酰胺溶液不同温 度下的核磁谱图（8(a))、透过率随温度变化图（8(b))及流体力学半径随温度变化图（8 (c) )〇
[0032] 本发明蛋白质接枝共聚物的接枝率是通过下面方程计算的：
[0033] 接枝率=(M1_M0)/M1*100%
[0034] 式中Ml是接枝聚合反应产物干燥后的质量，M0是反应原料蛋白质的投料质量。
[0035] 如无特别说明，本文中所用的份数均为重量份(质量份），所有百分比均为重量百 分比（也称为质量百分比，重量％或质量％ )。
【具体实施方式】
[0036] 为更好地说明本发明，便于理解本发明的技术方案，下面结合本发明的典型但非 限制性的具体实施例对本发明进行进一步详细的说明。
[0037] 其中所用试剂均购自Sigma-Aldrich化学试剂供应商，所述操作均为常规操作。 [0038]实施例1:接枝率为50 %的角蛋白接枝聚乙二醇(Kerat in-g-PEG)的制备
[0039] 将200mg角蛋白分散在4mL水中，然后缓慢加入引发剂过硫酸钾(K2S2〇8，22mg)和 640mg MPEGMA，待K2S2〇8与MPEGMA充分溶解后，反应在70°C、持续搅拌条件下进行24h。反应 结束后，用截留分子量为7kDa的透析袋在水中透析24h后，经冷冻干燥得到接枝率为50%的 固体keratin-g-PEG接枝共聚物。
[0040]由图1(a)中可以看出，接枝率为50 %的Keratin-g-PEG核磁氢谱图在δ = 3 · 75ppm 处的质子峰归属于MPEGMA上-CH2CH2〇-的质子峰，说明PEG链已经成功接枝到角蛋白主链上。 通过调控MPEGMA与角蛋白的投料比，可以得到具有不同接枝率的接枝共聚物。表1中列出了 3种不同接枝率的角蛋白接枝聚乙二醇的合成投料比、接枝率及载药胶束的载药量。由它们 相应地制备的载药胶束的载药量在下面实施例8中具体说明。
[0041]表1. keratin-g-PEG的合成投料比、接枝率及载药胶束的载药量
[0043] a由称重法测定
[0044] 紫外分光光度计测定
[0045]实施例2:接枝率为43%角蛋白接枝聚1'1-(2-轻丙基）甲基丙稀酰胺(1^131:;[11-区-PHPMA)的制备
[0046]将200mg角蛋白分散在4mL水中，随后向反应瓶中加入4mg引发剂2，2 ' -偶氮二异丁 醚盐酸盐(V-50)和286mg N-(2-羟丙基）甲基丙烯酰胺(HPMA)。之后反应在50°C、持续搅拌 下进行24小时。反应结束后将反应物倒入截留分子量为7kDa的透析袋中，在水中透析24小 时以除去引发剂和未反应的单体，每12小时换水一次。透析完成后，通过冷冻干燥得到接枝 率为43%的固体1^抑1:;[11-8-?!1?1^接枝共聚物。图1(13)中1^抑1:;[11-8-?!1?1^43%核磁氢谱上 3.9和3.2ppm的质子峰来源于PHPMA上标明的e和f处质子H，说明PHPMA成功地接枝到角蛋白 主链上。通过调控HPMA与角蛋白的投料比，可以得到具有不同接枝率的接枝共聚物，表2中 列出了3种不同接枝率的角蛋白接枝聚Ν-(2-羟丙基）甲基丙烯酰胺的合成投料比、接枝率 及载药胶束的载药量，由它们相应地制备的载药胶束的载药量在下面实施例9中详细说明。 [0047] 表2.keratin-g-PHPMA的合成投料比、接枝率与载药胶束的载药量
[0049] a由称重法测定
[0050] 紫外分光光度计测定
[00511 实施例3:接枝率为62%角蛋白接枝聚N-异丙基丙烯酰胺(keratin-g-PNIPAM)的 制备
[0052] 将100mg角蛋白分散在4毫升Milli-Q水中，随后加入4mg引发剂V-50和670mgN-异 丙基丙烯酰胺(NIPAM)。反应在50°C、持续搅拌下进行24小时，随后将反应物倒入截留分子 量为7kDa的透析袋中，在水中透析24小时以除去引发剂和未反应的单体，每12小时换水一 次。透析完成后，通过冷冻干燥得到接枝率为53 %的kerat in-g-PNIPAM接枝共聚物。
[0053] 图1 (c)中keratin-g-PNIPAM核磁氢谱上1.2ppm的质子峰来源于PNIPAM上-CH3上 的质子Η，1.5-2.5ppm范围内的质子峰来源于PNIPAM重复单元-CH2CH-上的质子，3.8ppm的 质子峰归属于PNIPAM上与两-CH 3相连的-CH上的质子，说明PNIPAM成功地接枝到角蛋白主 链上。通过调控NIPAM与角蛋白的投料比，可以得到具有不同接枝率的接枝共聚物，表3中列 出了 3种不同接枝率的角蛋白接枝聚N-异丙基丙烯酰胺的合成投料比、接枝率及接枝共聚 物的低临界溶解温度(LCST)。由它们相应地制备的载药胶束的LCST在下面实施例15中具体 说明。
[0054] 表3. keratin-g-PNIPAM的合成投料比、接枝率及LCST
[0056] a由称重法测定 [0057] 紫外分光光度计测定
[0058]实施例4:蛋白质接枝共聚物在水中的自组装行为与临界胶束浓度(CMC)测定 [0059]以芘作为荧光探针分子研究了实施例1的最终产物接枝率为50%的keratin-g- PEG接枝共聚物在水中的自组装行为。
[0060] 配制不同keratin-g-PEG5〇%浓度（1 ·0Χ 1CK6~1 .Omg/mL)、相同花浓度的溶液。在 Perkin Elmer LS 55荧光分析仪上测定所有溶液在发射波长为393nm时的激发光谱，用激 发光谱中338nm与336nm处荧光强度的比值（1 338/ 1 336 )对接枝共聚物的浓度作图得到 keratin-g-PEG5〇%的临界胶束浓度为5yg/mL(图2 (a)中正方形曲线）。
[0061 ]图2(a)还给出了表1中所列接枝率分别为63%、86%的keratin-g-PEG接枝共聚物 在水溶液中的CMC，其CMC分别为8(图2(a)中圆形曲线）、20yg/mL(图2(a)中三角形曲线）。说 明随着接枝共聚物的接枝密度的增加，接枝共聚物的CMC也随之增大。这是因为随着接枝共 聚物中MPEG含量的增加，接枝共聚物的亲水性增加。
[0062]实施例5:蛋白质接枝共聚物在水中的自组装行为与临界胶束浓度(CMC)测定 [0063]以与实施例4相同的方法研究实施例2的最终产物接枝率为43 %的keratin-g-PHPMA接枝共聚物在水溶液中的胶束化行为，得到keratin-g-PHPMA43%的临界胶束浓度为15 yg/mL(图2(b)中圆形曲线）。
[0064] 图2(b)还给出了表2中所列接枝率分别为9%、80%的keratin-g-PHPMA接枝共聚 物在水溶液中的CMC，其CMC分别为4(图2(b)中正方形曲线）、21 (图2(b)中三角形曲线)yg/ mL〇
[0065] 实施例6:蛋白质接枝共聚物在水中的自组装行为与临界胶束浓度(CMC)测定
[0066] 以与实施例4相同的方法研究实施例3的最终产物接枝率为62 %的keratin-g-PNIPAM接枝共聚物在水溶液中的胶束化行为，得到keratin-g-PNIPAM62%的临界胶束浓度为 16yg/mL(图2(c)中圆形曲线）。
[0067] 图2(c)中还给出了表3中所列接枝率分别为31%、85%的1?^^丨111-?祖?41接枝 共聚物在水溶液中的CMC，其CMC分别为5(图2(c)中三角形曲线）、21(图2(c)中正方形曲线） yg/mL。说明随着接枝共聚物的接枝密度的增加，接枝共聚物的CMC也随之增大。该规律与 keratin-g-PEG和keratin-g-PHPMA接枝共聚物在水溶液中的CMC变化规律一致。
[0068]实施例7:蛋白质接枝共聚物的氧化还原响应性测定
[0069] 将实施例1的接枝率为50%的keratin-g-PEG 20mg分散在20mL水中，超声5分钟后 搅拌3h，得到核壳胶束。随后，通过加入2mL二甲基亚砜(DMS0)在45 °C条件下持续搅拌24h将 角蛋白链上-S Η官能团经氧化形成双硫键，使胶束的核被交联。氧化结束后，反应液在 Mi 11 i-Q水中透析24h以除去DMS0。透析得到的胶束溶液在不同浓度（1 OmM和1 ΟμΜ) GSH条件 下37°C处理2天后，用动态光散射(DSL)测定氧化胶束流体力学半径<Rh>。
[0070]图3为3种不同接枝率的keratin-g-PEG接枝共聚物形成的胶束氧化前后的流体力 学半径及其分布<Rh>。结果表明：经过DMS0氧化后，接枝共聚物的<Rh>增大，且<Rh>的分布变 窄，而经过10mM GSH处理过后，胶束的<Rh>回复到了氧化前的状态。说明氧化后的胶束对 细胞内GSH浓度存在响应性，在氧化后，能被还原至氧化前的状态。DLS的结果证明了根据本 发明的keratin-g-PEG5〇%接枝共聚物胶束具有氧化还原响应性。
[0071 ]实施例8:蛋白质接枝共聚物载药胶束的制备及药物释放行为测定
[0072] 1)载药胶束的制备：以阿霉素作为模型药物分子评定实施例1制备的keratin-g- PEG5Q%接枝共聚物在水溶液中自组装得到的胶束作为药物载体的功用和价值。
[0073] 载药胶束的制备过程如下：取14mg D0X · HC1溶解在水中，完全溶解后向溶液中加 入28mg keratin-g-PEG5Q%接枝共聚物。在持续搅拌3h后，加入1.4mL DMSO,溶液体系在45°C 氧化24h后得到核交联的胶束溶液。随后溶液体系用截留分子量为7kDa的透析袋在2000mL Milli-Q水中透析24h，每12h换水一次，以除去DMS0和游离的D0X。透析完成后，向载药胶束 溶液中加入超纯水，将得到的载药胶束溶液的体积调整为28mL，从而得到浓度为lmg/mL的 载药胶束溶液。胶束对D0X的载药量(α)通过如下公式进行计算：
[0074] CL( % ) = (ffDOX.L/ffnanoparticles) X 100
[0075] 其中WDQX,L、WDQX,feeding和Wnan。particles分别为胶束中DOX的质量、最初投入载药体系中 的D0X的质量和胶束的质量，胶束载药量见表1。三种不同接枝率keratin-g-PEG接枝共聚物 胶束对D0X的载药量结果表明，随着接枝共聚物接枝率减小，接枝共聚物中角蛋白含量增 加，其组装体对D0X的负载量也增加，这说明keratin-g-PEG接枝共聚物自组装得到的胶束 的载药量，取决于接枝共聚物中角蛋白的含量。角蛋白含有大量的羧基、氨基、羰基等极性 官能团，这些活性官能团能与D0X分子上的羧基、氨基和羟基等极性基团产生氢键作用，从 而使负载的D0X分子能稳定存在于胶束核内，赋予keratin-g-PEG胶束优异的载药性能。 [0076] 2)载药胶束药物释放实验:载药胶束D0X的体外释放实验通过透析方法进行，具体 如下：
[0077]将步骤1)中制备的keratin-g-PEG5Q%接枝共聚物浓度为lmg/mL的载药胶束溶液 1211^装入截留分子量为71^的透析袋中，置入盛有15〇1111^85(?!17.4)的广口瓶中，在37 °C、固定磁子转速条件下释放药物。为了模拟血液和细胞环境条件下的氧化还原环境，对比 释放实验中释放介质roS溶液中GSH浓度分别为1 ΟμΜ和10mM，且维持透析袋内、外溶液中GSH 浓度一致。间隔一段时间吸取3. OmL广口瓶中PBS溶液，进行紫外吸收光谱测量，以确定药物 释放量。
[0078]图4为keratin-g-PEG50%接枝共聚物制备的载药胶束在不同条件下药物释放量 随时间关系图。从图4(a)中可以看到，载药胶束在10mM GSH(图4(a)圆形曲线)浓度条件下， 相对10μΜ GSH(图4(a)正方形曲线)浓度条件下，载药胶束最终的药物释放量较高。结果表 明，GSH对D0X的释放具有非常重要的刺激作用。
[0079] 为了进一步证实GSH在药物释放过程中所起的作用，进行了 keratin-g-PEG5tt%接枝 共聚物制备的载药胶束在无 GSH(图4(a)星形曲线)条件下的释放实验。在24h后，最终释放 量不到15%，比10μΜ GSH条件下的D0X释放量还要少。以上结果证实了keratin-g-PEG5Q%接 枝共聚物制备的载药胶束释放D0X的过程具有对GSH的刺激响应性，在高浓度GSH条件即癌 细胞内GSH浓度条件下，载药胶束能更快地释放出D0X。这是因为高浓度的GSH打开了载药胶 束核上的交联键-S-S-，使负载D0X的胶束核变得更为疏松，从而药物分子能更好地扩散出 来，导致了较高的最终释放量。
[0080]为了实现药物的充分释放和有效利用，在药物释放环境中引入了胰蛋白酶。释放 结果如图4(a)(图4(a)倒三角曲线)所示。在胰蛋白酶存在下，D0X的释放量在lh之内就达到 了70 %。在24h后，释放量已经达到了95 %。结果表明，胰蛋白酶能触发D0X高效释放，这有利 于提尚药物的利用率。
[0081 ]实施例9:蛋白质接枝共聚物载药胶束的制备及药物释放行为测定
[0082]以与实施例8相同的方法研究实施例2的接枝率为43%的keratin-g-PHPMA接枝共 聚物载药胶束的制备及药物释放在水溶液中的胶束化行为，得到keratin-g-PHPMA43%制备 的载药胶束的药物释放结果图（图4 (b))。结果表明keratin-g-PHPMA43%制备的载药胶束的 药物释放行为具有对GSH的刺激响应性，且胰蛋白酶的存在能触发DOX高效释放。
[0083] 实施例10:蛋白质接枝共聚物的胰蛋白酶响应性测定
[0084] 为了研究胰蛋白酶在实现载药胶束充分释放D0X过程中所起的作用，将由实施例1 的keratin-g-PEG5〇%接枝共聚物制备的胶束溶液(lmg/mL)与0.04mM胰蛋白酶在37°C条件下 相互作用，一定间隔时间取样后用动态光散射跟踪其<Rh>的变化，结果如图5(a)所示。在37 °C，0.04mM胰蛋白酶存在下，实施例1中制备的keratin-g-PEG 5〇%的<Rh>在lh内从最初的 104nm左右降低到了 50nm左右。随着时间延长，<Rh>持续变小，24h后降低到了约20nm。这是 因为胰蛋白酶能打开角蛋白上存在的肽链，从而引起胶束的解体，从而生成了更小的纳米 粒子。在释放药物的过程中，胶束的解体有利于药物从胶束中扩散出来进入到释放介质中。
[0085] 实施例11:蛋白质接枝共聚物的胰蛋白酶响应性测定
[0086]以与实施例10相同的方法研究了实施例2的最终产物接枝率为43%的keratin-g-PHPMA接枝共聚物制备的胶束溶液的胰蛋白酶响应性，得到keratin-g-PHPMA4 3%胶束在胰蛋 白酶存在下的<Rh>随时间变化关系（图5(b))。在胰蛋白酶存在下，胶束<Rh>持续变小的现象 表明胶束对胰蛋白酶具有响应性。
[0087]实施例12:蛋白质接枝共聚物的胰蛋白酶响应性测定
[0088]以与实施例10相同的方法研究了实施例3的最终产物接枝率为62%的keratin-g-PNIPAM接枝共聚物的胰蛋白酶响应性，得到keratin-g-PNIPAM 62%胶束在胰蛋白酶存在下的 <Rh>随时间变化关系（图5 (c))。在胰蛋白酶存在下，胶束<Rh>持续变小的现象表明胶束对胰 蛋白酶具有响应性。
[0089] 实施例13:蛋白质接枝共聚物载药胶束的细胞毒性与细胞内化测定
[0090] 实施例1制备的keratin-g-PEG5Q%接枝共聚物的细胞毒性实验通过3-(4,5_二甲基 噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT)方法用人乳腺癌细胞（Michigan Cancer Foundat ion-7，MCF-7)培养24h后的细胞存活率进行测评。
[0091] 图6(a)为实施例1制备的3种不同接枝率的keratin-g-PEG经过24h细胞培养后用 MTT法测定的细胞存活率，显示细胞存活率均在80%以上。结果表明所述keratin-g-PEG接 枝共聚物对MCF-7细胞没有毒性，即便浓度高至lmg/mL时，keratin-g-PEG对细胞仍然没有 毒性。
[0092] 实施例14:蛋白质接枝共聚物载药胶束的细胞毒性
[0093] 实施例2制备的keratin-g-PHPMA43%接枝共聚物的细胞毒性实验方法同实施例13。 3种不同接枝率的keratin-g-PHPMA接枝共聚物细胞毒性结果如图6(b)所示，结果表明 keratin-g-PHPMA接枝共聚物无细胞毒性。
[0094] 实施例15:蛋白质接枝共聚物载药胶束的细胞内化实验
[0095]细胞内化实验简要过程如下，首先MCF-7细胞在含有10%牛血清蛋白的DMEM培养 液中在37°(：、5^^02和95%湿度条件培养箱中孵化，不同组细胞加入不同浓度（1(^1和 10mM)的GSH-OEt溶液孵化2h以保证细胞内GSH的浓度。未用GSH-OEt处理的细胞组为空白 组。随后加入200yL keratin-g-PEG5Q%载药胶束溶液，培养0.5h和1.5h后细胞的荧光图像用 FV 1000-1X81激光共聚焦显微镜(Olympus Japan)拍摄。
[0096]图7(A)为实施例8中制备的keratin-g-PEG5Q%接枝共聚物载药胶束细胞内化实验 结果的激光共聚焦照片，其中a组图片所显示的是空白细胞组在加入载药胶束培养0.5h后 的CLSM图。在这组细胞中，只有细胞质部分有少量的DOX红色荧光;而c组10mM GSH浓度细胞 组细胞内有很强的红色荧光（参见图片c)。相比发现，1 ΟμΜ GSH细胞组的荧光强度比1 OmM GSH细胞组的荧光强度要弱很多。细胞内的DOX荧光强度与GSH的浓度密切相关的实验现象 说明了，在细胞内D0X从keratin-g-PEG 5Q%接枝共聚物载药胶束中释放出来的快慢和多少受 环境中GSH浓度影响。细胞内化的结果表明keratin-g-PEG 5Q%接枝共聚物载药胶束能有效地 进入细胞，同时能释放出D0X。载药胶束释放出D0X快慢与GSH浓度有关的现象说明，接枝共 聚物载药胶束在活细胞内仍能呈现出对GSH的响应性释放。
[0097]实施例16:蛋白质接枝共聚物载药胶束的细胞内化实验
[0098]以与实施例13相同的方法研究了实施例9中制备的keratin-g-PHPMA43%接枝共聚 物载药胶束的细胞内化。图7 (B)细胞内化实验结果的激光共聚焦照片表明keratin-g-PHPMA43%接枝共聚物制备的载药胶束能在细胞环境下释放药物进入细胞，且药物释放行为 具有对GSH的刺激响应性。
[0099] 实施例17:蛋白质接枝共聚物的温敏性测定
[0100] 以氘代试剂D20为溶剂，配制实施例3中合成keratin-g-PNIPAM62%接枝共聚物溶 液，浓度为5mg/mL。在BRUKER AVANCE 400兆液体核磁谱仪进行谱图采集。样品溶液的温度 通过核磁仪器样品腔的控温单元控制，设置温度后待核磁管进入样品腔稳定30min后开始 谱图采集。
[0101] 图8(a)为实施例3中合成keratin-g-PNIPAM62%接枝共聚物在不同温度下的h-NMR 谱图，keratin-g_PNIPAM62%核磁氢谱上1 · 2ppm、1 · 5-2.5ppm和3.8ppm处的质子峰分别来源 于PNIPAM上-CH3上的H、重复单元-CH 2CH-上的Η和PNIPAM上与两-CH3相连的-CH上的H。当温 度升至30°C时，谱图中3.8ppm处来源于PNIPAM链上与两-CH 3相连的-CH上的质子峰强度开 始变弱。与此同时，1 · 5-2 · 5ppm范围内的质子峰和1 · 2ppm处-CH3的质子峰强度也随着温度 升高变弱。但keratin-g-PNIPAM62%核磁氢谱图上归属于角蛋白的质子峰（6 · 5-7 · 5ppm、 3.6ppm)强度并没有出现明显变化。随着温度升高至32°C，keratin-g-PNIPAM62%核磁氢谱上 归属于PNIPAM链上Η的质子峰强度急剧变弱的实验结果表明，keratin-g-PNIPAM 62%接枝共 聚物在水溶液中的分子链状态会随着温度变化而变化。当温度升至37°C时，keratin-g-PNIPAM 62%接枝共聚物1H-NMR谱图与32 °C谱图无明显区别。从kerat in-g-PNIPAM62%接枝共聚 物1H-NMR谱图随着温度变化而有所改变的结果可以初步判断，keratin-g-PNIPAM 62%接枝共 聚物的LCST居于30°C_37°C之间。
[0102] 通过变温紫外测试观察接枝共聚物胶束溶液浊度随温度的变化。变温紫外在日本 岛津UV-2550紫外可见分光光度计上进行测试，该仪器采用双单色器设计。三种keratin-g-PNIPAM接枝共聚物的浓度均为lmg/mL，通过控温软件来实现温度调控，温度范围为25 °C~ 50°C，变温速率为0.5°C/min，点距为0.1°C。测试狭缝宽度为0.2nm。图8(b)中三角形曲线为 keratin-g-PNIPAM62%接枝共聚物胶束溶液浊度随温度变化示意图，从图中可以看出，对于 kerat in-g-PNIPAM62%接枝共聚物胶束溶液，在升温初始阶段，溶液浊度没有明显变化，直到 温度升至33°C时，溶液浊度急剧增加。当温度升至37.5°C，溶液浊度达到平衡，几乎不再变 化。图8(b)中同时列出了接枝率为31 % (图8(b)中正方形曲线）和85% (图8(b)中五角星曲 线）的keratin-g-PNIPAM接枝共聚物胶束溶液浊度随温度变化示意图。从图中可以看到，不 同接枝率的Keratin-g-PNIPAM接枝共聚物胶束溶液随温度变化具有不同的浊度变化行为。 最早开始发生变化的是Keratin-g-PNIPAM85%接枝共聚物胶束溶液(图8(b)中五角星曲线）， 随着温度逐渐升高，溶液浊度在20°C开始逐渐增大。当温度升至32°C时，溶液浊度急剧增 加。当温度升至35 °C时，溶液浊度已经增至最大，透过率几乎为0 lerat in-g-PNIPAM31%接枝 共聚物胶束溶液浊度变化程度最小（图8(b)中正方形曲线），在35°C时溶液浊度开始增加。 随着温度升高浊度逐渐增大，当温度升至45°C时，溶液浊度仍有缓慢增加。直到温度升至50 °C，溶液浊度只增加了 50 %左右，溶液仍具有一定透光率。以溶液浊度变化至一半时所对应 的温度作为LCST，三种接枝共聚物胶束溶液的LCST如表1所示。结果表明，随着接枝率增加， keratin-g-PNIPAM接枝共聚物的LCST降低。
[0103] 通过观察<Rh>随温度的变化以证明胶束对温度的响应性。Keratin-g-PNIPAM接枝 共聚物制备的胶束溶液用Milipore 龙滤膜(0.45μπι)过滤后，样品在指定温度 (±0.01°C)平衡30min后，在ALV/SP-150激光光散射仪上在90°散射角进行DLS测量。所有接 枝共聚物样品溶液的浓度均为〇. 5mg/mL。
[0104] 图8(c)同时列出了三种不同接枝率的keratin-g-PNIPAM接枝共聚物胶束溶液流 体力学半径<Rh>随温度变化。随着温度升高，三种keratin-g-PNIPAM接枝共聚物胶束溶液 流体力学半径<Rh>变化呈现相同规律，当温度高于32°C后，均随着温度升高而持续增大。对 于keratin-g-PNIPAM 31%接枝共聚物胶束溶液而言，变化不明显，这是因为其PNIPAM含量较 小的缘故。在温度达到39°C后，<Rh>保持平衡，基本不再变化。Keratin-g-PNIPAM接枝共聚 物胶束溶液流体力学半径<Rh>随温度变化的结果也说明了keratin-g-PNIPAM接枝共聚物 胶束具有温度响应性。
【主权项】
1. 一种蛋白质接枝共聚物，以蛋白质作为基质，高分子侧链接枝聚合在蛋白质主链上， 其含有大约14.0 % -94.0质量％的蛋白质和大约6 % -86质量％的高分子侧链。2. 根据权利要求1所述的蛋白质接枝共聚物，其中所述共聚物含有25%-69质量％的蛋 白质和31%-75质量％的高分子侧链。3. 根据权利要求1所述的蛋白质接枝共聚物，其中所述的蛋白质可以为具有-SH官能团 的天然蛋白质或合成蛋白质。4. 根据权利要求3所述的蛋白质接枝共聚物，其中所述天然蛋白质为角蛋白和纤维蛋 白。5. 根据权利要求1所述的蛋白质接枝共聚物，其中所述高分子侧链是水溶性的，由水溶 性单体聚合而成或由带有-c=c-的高分子链加成得到。6. 根据权利要求5所述的蛋白质接枝共聚物，其中所述水溶性单体是N-(2-羟丙基）甲 基丙烯酰胺、N-异丙基丙烯酰胺、甲基丙烯酸甲酯、丙烯酰胺、丙烯酸叔丁酯、甲基丙烯酸羟 乙酯、4-乙烯基吡啶、2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱、甲基丙烯酸二甲氨基乙酯中的一种或 多种，所述带有-c = c-的高分子链是聚乙二醇单甲醚甲基丙烯酸酯及其它修饰上双键的高 分子链。7. 根据前述权利要求任一项所述的蛋白质接枝共聚物，其在水溶液中的临界胶束浓度 为4-21yg/mL。8. 根据前述权利要求所述的蛋白质接枝共聚物的制备方法，包括如下步骤:将蛋白质 分散在水中，然后按照不同的反应配比加入自由基引发剂和适量的单体或带有-c = c-的高 分子侧链;反应在一定温度下进行一段时间，得到蛋白质接枝共聚物;任选地，在反应结束 后，将反应物透析袋透析，冷冻干燥得到固体蛋白质接枝共聚物。9. 根据权利要求8所述的方法，其中所述蛋白质:水：引发剂:单体或带-C = C-的高分子 的重量份之比为1:10-30:0.002-0.2:0.1-20，反应温度为40 °C-80 °C，反应时间为6-24小 时。10. 根据前述权利要求1-6任一项所述的蛋白质接枝共聚物在肿瘤部位刺激响应性药 物释放中用作药物载体材料、组织工程中用作支架材料、在传感器领域用作敏感元件和在 环境保护中废弃羊毛的再生利用以及在绿色化学领域的用途。
【文档编号】C08F289/00GK106046384SQ201610403833
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年6月8日
【发明人】李琴梅, 魏晓晓, 沈上圯, 刘威, 刘伟丽
【申请人】北京市理化分析测试中心