专利名称：具有骨诱导和骨传导特性的装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及包括含有磷酸钙的载体和骨诱导蛋白并具有体内骨诱导和骨传导特性的装置，其中所述载体被所述蛋白均匀包被。此外，本发明涉及制造在体内具有骨诱导和骨传导特性的装置的方法。该发明包括包含该发明的装置或可以由该发明方法得到的装置的药用组合物，并涉及所述装置在制备用于骨增加、治疗骨缺陷，治疗变性的和外伤性的椎间盘疾病(disc disease)、用于窦底增高和治疗骨开裂的药物组合物中的用途。最后，该发明涉及包含该发明装置或可以从该发明方法得到的装置的药盒。
各种不同的磷酸钙，比如β磷酸三钙(beta-tricalcium phosphate)(Ca3(PO4)2)(β-TCP)，α磷酸三钙(alpha-tricalcium phosphate)(α-TCP)，和羟基磷灰石已经显示了作为骨替代材料的有效性。例如在治疗骨缺陷中粒状和片状(块状)的β-TCP都是适当的。通常，包含磷酸钙的骨替代材料用于当骨的再生再也不可能或就是可能也是很困难的情况下。另外，骨替代材料用于当额外骨形成是后来植入物种植的一个先决条件的情况下。磷酸钙表现出骨传导的效果，也就是，它们是一种惰性结构，能使细胞从邻近骨的迁移变得更为便利。然而，骨骼或不同间充质细胞的存在是新骨骼形成的前提。磷酸钙的效应能明显地通过加入骨片(bone chips)而增加。这些骨骼不仅仅是骨传导性的，也是骨生成性的(刺激骨细胞新合成骨材料)和骨诱导性的，也就是它们将引起成骨细胞和软骨细胞中的未分化的间充质干细胞发生转化。鉴于安全的理由，同源的骨片优于同种异体的或异种的制品。然而，同源性骨骼的产生总是牵涉第二次外科手术，这一点在许多情况下是不被患者所接受的。
使用同源性骨骼的一种替代方案是利用特殊骨生长和分化因子，比如，GDF-5或不同的骨形态发生蛋白(BMPs)。这些蛋白因子具有骨诱导作用，然而，它们只能在以固定化的形式使用时能发挥这种作用。在文献中，磷酸钙、胶原和矿化的胶原(包含胶原的磷酸钙)均被描述为载体(羟基磷灰石和β-TCP(Hotz，1994)，从海藻抽提物中得到的羟基磷灰石(Gao，1996)，骨抽提物(Gombotz，1996)和胶原(Friess，1999))。在这些文献中被包被载体有效性的分析没有呈现出一致的结果，而是表现出显著的不同，这种不同是由于所选载体类型或包被方法而造成的(Terheyden等(1997))。已描述了不同的方法。在WO98/21972中GDF-5在β-TCP上的快速沉淀完成包被，是由首先将GDF-5溶解于有机溶剂，然后加水入形成沉淀来完成的。然而，由于许多溶剂具有毒性，这样的方法不适宜于药用组合物的制备。Lind等(1996)完成了在作为保护蛋白质的明胶(通常从牛或猪骨骼中得到)存在下不同磷酸钙陶瓷的包被。然而，由于增加了感染风险，在制备药用组合物和医用产品时应该避免使用动物材料。Friess等(1999)和Gao等(1996)描述了用BMP-2包被胶原。但由于胶原压缩强度低，这样的载体并不对所有的适应症都适合。这尤其适用于新形成的骨必须支撑以后的压力负荷的适应症。此外，胶原的药学性质迄今为止只能从动物来源得知。
尽管几篇文章描述了应用蛋白质包被载体进行骨增生，但是有效而可靠的制备方法以及在治疗骨缺陷上的应用还不能得到，而仍然是十分需要的。
这样，本发明的技术问题是提供有效和可靠地治疗骨缺陷的工具和方法，包括骨增加。
这一技术问题由权利要求书中所表征的实施方案来解决。
由此，本发明涉及包括含有磷酸钙的载体和骨诱导蛋白、并具有体内骨诱导和骨传导特性(osteoinductive and osteoconductiveproperties)的装置(device)，其中所述载体均匀包被了所述蛋白。
根据本发明所用的术语“装置(device)”是指包含至少两个部件的实体。所述的部件之一是载体基质。优选地，所述载体基质由无机陶瓷组成。所述陶瓷由于存在大孔和小孔而具有特别大的表面。优选所述大孔直径大约在100-400纳米，而小孔直径在10纳米以下。最优选的是，所述载体是如下提及的磷酸钙。
所述装置另一个部件是具有骨诱导特性的蛋白质或多肽，这将在后面详细解释。蛋白质或多肽被固定在载体的表面上。根据本发明所应用的骨诱导蛋白质和多肽对于无机载体基质，比如磷酸钙，具有特别的高亲和性。优选所述蛋白质或多肽与载体的结合是可逆的。因此，一旦装置已被带入适宜的体内环境，比如骨腔(bone cavity)，所述蛋白质的溶解是允许的。优选所述蛋白质的溶解是缓慢释放，允许蛋白质扩散到围绕该装置的组织中。这样，该装置充当了骨诱导蛋白的体内来源，所述蛋白质被缓慢释放，这样可以有效地分布于周围的组织中，或以固定化的形式发挥作用。
此外，装置也可以包含附加的赋形剂。这些赋形剂起蛋白质稳定的作用，如，糖类、氨基酸、多羟基化合物或去污剂，或维持pH值，如，缓冲剂。本发明所涵盖的优选的赋形剂将在下面详细讨论。
术语“骨诱导性(osteoinductive)”是指将间充质干细胞转化为成骨细胞和软骨细胞的能力。骨诱导(Osteoinduction)的先决条件是由该装置分布于周围组织中的信号，在周围组织中，上述成骨细胞的前体被活化。在此使用的骨诱导包括间充质细胞分化变为骨前体细胞-成骨细胞。另外，骨诱导也包括所述成骨细胞分化成为骨成熟细胞-骨细胞。被骨诱导所包含的还有间充质细胞到软骨细胞的分化。特别在长骨中，存在于骨的软骨膜中的成软骨细胞和软骨细胞也能够分化为骨细胞。骨诱导要求未分化的或较低分化的细胞分化成为能够形成骨的骨细胞。这样，骨诱导的先决条件是由装置分布到上述骨细胞前体通常所存在的周围组织中的信号。正如上面描述的，本发明所用的骨诱导蛋白在植入后缓慢地从装置中释放，有效地分布到周围组织中。而且，本发明所包括的蛋白质和多肽具有体内骨诱导特性。例如，本技术领域公知，转化生长因子-β(TGF-β)超家族包括具有骨诱导特性的成员。在所述TGF-β超家族中具有尤其优良的骨诱导特性的单个成员在下面列出。总的来说，本发明装置的骨诱导蛋白质从载体上释放以后，对围绕所述装置植入面的组织的骨细胞前体起骨诱导信号的作用。
术语“骨生成性的”描述由成骨细胞合成新骨。根据本发明，利用所述装置的结构作为骨细胞能够粘附至其上的基质，在围绕该装置的植入面周围先前存在的骨生长进入该装置中。
术语“载体”包括三维基质，比如上述提及的陶瓷。如上所述，优选所述载体由于形成大孔和小孔而具有扩大的表面。载体物质对于骨诱导蛋白具有高亲和力，但还是允许所述蛋白在活体内释放。根据本发明，所述载体优选是磷酸钙。本发明装置所包含的载体可以制成适于在体内施用该装置的形式，比如，颗粒、块、立方体、粘固粉(cements)和无定形糊膏剂形式的陶瓷。另外，载体可以被包被在金属表面上。
术语“磷酸钙”包括含有钙离子、磷酸根离子，以及可有可无的更多的适合于本发明载体的离子或原子的组合物(compositions)。正如前面所述的，用于本发明的磷酸钙是具有适合于本发明装置的三维结构的晶体。优选的和公知的磷酸钙列表将在下面给出。
如前面提出的术语“骨诱导蛋白”是指具有骨诱导特性的转移生长因子-β(TGF-β)超家族成员，比如，生长和分化因子-5，见下面。这些骨诱导蛋白展示了对磷酸钙的高亲和力。磷酸钙能够例如以β-TCP、α-TCP和羟基磷灰石的形式存在。依赖于大孔(100-400nm)和小孔(小于10nm)，这些无机矿物可吸附水溶液。在这个过程中，蛋白质如GDF-5或BMP-2被紧紧地吸附在载体的表面。这一过程的重要前提条件是蛋白质在包被溶液中的充分的溶解性。
术语“均匀包被”意味着载体的表面完全被所述骨诱导蛋白包被，由此，在所述载体表面的全部区域存在基本上相同量的蛋白质。本发明的均匀包被载体优选展示为在它的表面覆盖最大量的骨诱导蛋白。均匀包被是骨诱导蛋白有效地释放、均一地分布以及活性进入移植位点的周围组织的一个先决条件。而且，应当理解，骨诱导蛋白质并不是由于沉淀或微沉淀(micro-precipitation)而聚集和部分或全部失活，而是通过均匀包被完成有生物活性的非聚集蛋白质的附着。所述均匀包被可以通过本发明方法来完成，描述在附带的实施例中。进一步地说，有关控制均匀包被、固定化蛋白质的定量和表征的工具和方法描述在附带的实施例中。
有利的是，根据本发明已经发现，上述本发明装置在植入受试者(优选人)体内以后具有改善的、可靠的体内骨诱导和骨传导特性。对于这样一种装置的先决条件是用有生物活性、非聚集的骨诱导蛋白质均匀包被载体。已发现，即使由微沉淀引起的聚集也导致非均匀包被，导致至少显著地降低骨诱导特性，这已描述在有关其它装置的现有技术，如WO98/21972中。此外，还发现，不受欢迎的副作用，如，植入后受试者的炎症和毒性反应，可以被不含毒性杂质或传染性污染物的本发明装置所避免。尤其是，保护性蛋白质(比如，明胶)作为溶解介质的应用对于本发明装置来说是完全没有必要的。
而且，本发明涉及制备在体内具有骨诱导以及骨传导特性的装置的方法，包括以下步骤(a)提供包含溶解的骨诱导蛋白质和缓冲剂(buffer)的溶液，所述缓冲剂能够保持所述蛋白质溶解足够长的时间以允许当接触所述载体时均匀包被包含磷酸钙的载体；(b)将步骤(a)的溶液与包含磷酸钙的载体接触；(c)允许所述溶解的蛋白质均匀包被所述载体；和(d)干燥步骤(c)得到的经包被载体。
用于描述本发明装置的术语的定义经过必要的改动适用于前面所述的方法以及下面将提及的方法。
术语“干燥”包括除去用骨诱导蛋白包被载体后仍然存在的液体如过剩缓冲液的方法。优选的干燥通过真空干燥或冷冻干燥来完成。
术语“保持所述蛋白质溶解一定的时间，以允许均匀包被的缓冲剂”是指骨诱导蛋白质能够在其中有效溶解的缓冲剂，该缓冲剂能够平衡由于该缓冲剂溶液接触磷酸钙载体而引起pH上升，这样蛋白质不会立即沉淀，如，由于pH的增加所致。所述缓冲剂可以由本领域的技术人员根据依赖于pH、离子强度和载体与所述缓冲溶液接触后载体对于所述参数的影响的骨诱导蛋白溶解性来配制。根据本发明，已经发现，对于本发明方法来说，适当的缓冲液包含低浓度的缓冲物质，弱酸、醇或糖类。
本发明的一个优点是在包被过程中通过限制包被溶液pH上升来实现的均匀包被。所描述的方法允许骨诱导蛋白质在所述载体上的均匀分布和固定。而且，包被方法的效力由于大量大、小孔存在产生的毛细管作用力而得到载体支持，所述孔由于其大小而能吸收溶液至孔中。与本领域其它的方法，如，WO98/21972中的方法不同，根据本发明方法骨诱导蛋白或多肽通过附着于载体而不是通过沉淀或微沉淀来施加。本发明所基于的发现证明了蛋白质聚集可以通过使用在这里描述的合适添加剂来避免。一个重要的前提条件是了解依赖于存在的pH值、离子强度和表面的骨诱导蛋白质的溶解性。减缓包被溶液与以碱性方式起反应的磷酸钙接触而引起的pH增加，在包被过程中尤其扮演了重要的角色。有利的是，通过本发明方法，在发生由pH引起的所述蛋白质沉淀前，跨越载体材料的内表面而均匀分散，并能够结合到表面上。能够证实，在磷酸钙包被过程中发生的pH增加可以通过使用弱酸如乙酸来充分地减速。此外，有机化合物组合如乙醇或蔗糖的加入被证实具有额外的益处。而且，低离子强度对于成功的包被来说是一个重要的前提条件。我们的试验还显示了包被溶液的体积对于包被质量来说也有相当的影响。最后，本发明方法的目的是避免通常用于本领域描述的方法中的有害的有机溶剂，如，乙腈。通过避免所述的有害有机溶剂，本发明装置的安全情况和局部的可容忍性(localtolerability)将得到改进。
在本发明方法的优选具体实施方案中，所述缓冲剂具有小于100mmol/l、小于50mmol/l或小于20mmol/l的缓冲剂浓度。
从以上看，更为优选的是，所述缓冲剂包含弱酸。
术语“弱酸”是指包含至少一个离子化地结合的氢原子的有机或无机化合物。弱酸是本领域公知的并在标准教科书，比如Rmpp，化学词典中有描述。优选地所述弱酸具有低解离度，描述为pK值在3-7之间，优选4-6之间。
最优选所述弱酸是乙酸或琥珀酸。
在该发明方法另一个优选实施方案中所述缓冲剂进一步包含糖。
术语“糖”包括单糖、二糖和多糖。单糖、二糖和多糖的结构和组成是本领域公知的，在标准教科书比如Rmpp，化学词典中有描述。
更优选地，所述糖是二糖。最优选地，所述二糖是蔗糖或海藻糖。
在该发明方法另一优选实施方案中，所述缓冲剂包含醇。
适宜的醇是本领域公知的，在标准教科书比如Rmpp，化学词典中有描述。
更优选地，所述醇是乙醇或甘露醇。
在本发明方法或装置的优选实施方案中所述磷酸钙是β磷酸三钙、α磷酸三钙、磷灰石或含有磷酸钙的粘固粉(cement)。
所述磷酸钙尤其适合作为本发明装置的载体。它们的体内特性在Hozt，1994；Gao，1996和WO98/21972中有描述。
该发明方法或装置的另一个优选实施方案中所述骨诱导蛋白是TGF-β家族成员。
TGF-β家族的生长和分化因子已被显示参与包括骨形成在内的大量生物学过程。所述家族的所有成员都是包含特征性域结构的分泌的多肽。在最N末端，TGF-β家族成员包含信号肽或分泌前导区。这个序列的C端跟随原区域(Prodomain)和成熟多肽的序列。成熟多肽的序列包含7个保守的半胱氨酸，其中6个是形成分子内二硫键所必需的，而1个为两个多肽二聚化所需要的。具生物学活性的TGF-β家族成员是二聚体，优选由两个成熟的多肽组成。TGF-β家族成员通常被分泌为除成熟序列之外还包含原区域的蛋白质原(Proproteins)。原区域在细胞外被裂解，不是该信号分子的一部分。然而，已有报道说原区域也许是成熟多肽的细胞外稳定化所需要的。
本发明的上下文中，术语“TGF-β家族成员”或以下提到的所述家族的蛋白质包括所述蛋白质或成员的所有生物学活性变体和所有变体以及它们的无活性前体。因此，仅包含成熟序列的蛋白质和包含成熟蛋白质和原区域，或成熟蛋白、原区域和前导区序列的蛋白，及其生物学活性片段均在本发明的范围中。TGF-β成员的片段是否具有生物活性能够简单地用生物学试验，如以下文献中描述的那些试验来确定Katagiri T，Yamaguchi A，Ikeda T，Yoshiki S，Wozney JM，Rosen V，Wang EA，Tanka H，Omura S，Suda T.(1990)由重组人类骨形态发生蛋白-2诱导非骨形成小鼠多能性细胞株C3H10T1/2分化为成骨细胞(The non-osteogenic mouse pluripotent cell line，C3H10T1/2，isinduced to differentiate into osteoblastic cells by recombinant humanbone morphogenetic protein-2).Biochem.Biophys.Res.Commun.172295-299或Nishitoh H，Ichijo H，Kimura M，Matsumoto T，Makishima F，Yamaguchi A，Yamashita H，Enomoto S，Miyazono K(1996)生长/分化因子5的类型I和II丝氨酸/苏氨酸激酶受体的鉴定(Identification of type I and type II serine/threonine kinase receptorsfor growth/differentiation factor-5).J.Biol.Chem.27121345-21352。
优选地，根据该发明的生物学活性可以用描述在所附实施例中的在体模型进行测定。进一步地，本发明包括TGF-β成员变体，所述变体具有与TGF-β家族成员的氨基酸序列至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列。
关于TGF-β超家族成员的综述参见Wozney JM，Rosen V(1998)在骨形成和修复中的骨形态发生蛋白和骨形态发生蛋白基因家族(Bone morphogenetic protein and bone morphogenetic protein genefamily in bone formation and repair).Clin Orthop 34626-37。TGF-β家族成员的氨基酸序列可以从公知的数据库得到，如，通过互联网实现的Swiss-Prot(http//www.expasy.ch/sprot/sprottop.html)。具有特别高的骨诱导潜力的TGF-β家族成员BMP2、BMP7和GDF-5的氨基酸序列也分别显示在SEQ ID No1-3中，具有特别高的骨发生潜力的TGF-β家族成员BMP2、BMP7和GDF-5的氨基酸序列也分别显示在SEQ ID No1-3中。
更优选地，所述TGF-β家族成员是BMP亚家族的成员。
骨形态发生蛋白质(BMP)亚家族成员已显示尤其是参与骨组织的诱导和重塑(remodelling)。BMPs最初从骨基质中分离而来。这些蛋白质特征为具有在异位点诱导新骨形成的能力。不同的体内研究表明，由BMPs促进了前体细胞的骨生成和软骨生成，并提出了每一个BMP分子在骨骼发育过程中具有独特作用的可能性。更详细的有关BMPs的分子与生物学特性描述在Wozney JM，Rosen V(1998)在骨形成和修复中的骨形态发生蛋白和骨形态发生蛋白基因家族(Bonemorphogenetic protein and bone morphogenetic protein gene familyin bone formation and repair).Clin Orthop 34626-27.Schmitt J，Hwang K，Winn，SR，Hollinger J(1999)骨形态发生蛋白最新基础生物学与临床意义(Bone morphogenetic proteinsan update on basicbiology and clinical relevance).J Orthop Res 17269-278和Lind M(1996)生长因子可能的新临床工具(Growth factorspossible newclinical tools).综述.Acta Orthop Scand 67407-17.
最优选地，所述BMP家族成员是BMP2或BMP7。
BMP2前原形式(Preproform)的氨基酸序列存放在Swiss-Prot，编号为P12643，并显示于下文。氨基酸1-23相应于信号序列，氨基酸24-282相应于原肽(Propeptide)，氨基酸283-396相应于成熟蛋白质。BMP7前原形式的氨基酸序列存放在Swiss-Prot，编号为P18075或显示于SEQ ID No2中。氨基酸1-29相应于前导区序列，氨基酸30-292相应于原形式(Proform)，氨基酸293-431相应于成熟蛋白质。优选BMP2或BMP7分别指前原形式、原形式或成熟的BMP2或BMP7肽。此外，也包括所述蛋白质具有基本上相同生物学活性的片段，所述活性优选骨诱导特性。更多的关于BMP2和BMP7的序列信息在以下提供。
同样更优选的是，所述TGF-β家族成员是GDF。
生长和分化因子(GDF)也显示尤其是参与骨组织的诱导和重塑。生长分化因子5(GDF-5)，也称由软骨起源的形态发生蛋白1(CDMP-1)，是还包括其它相关蛋白质优选GDF-6和GDF-7的BMP家族一个亚群的成员。所述蛋白质成熟形式是27kDa同型二聚体。不同的体内和体外的研究证明了在哺乳类动物骨骼不同形态特征形成过程中GDP-5的作用。GDF-5的突变是造成包括肢体长骨长度缩短、肢体和胸骨关节发育异常在内的骨骼异常的原因(Storm & Kingsley(1999)，Development Biology，209，11-27)。在小鼠与人之间氨基酸序列是高度保守的。
最优选地，所述GDF亚家族成员是GDF-5。
GDF-5前原形式的氨基酸序列存放在Swiss-Prot，编号为P43026或显示在SEQ ID No3。氨基酸1-27相应于前导区序列，氨基酸28-381相应于原形式(proform)，氨基酸382-501相应于成熟蛋白质。优选GDF-5指前原形式、原形式或成熟GDF-5肽。此外，也包括具有基本上相同的生物学活性的GDF-5片段，所述活性优选骨诱导特性。最优选地，所述片段包含显示为SEQ ID NO3的序列的氨基酸383-501。
另一个该发明方法或装置的优选实施方案中，所述装置没有毒性物质。
术语“毒性物质”优选包括本领域描述的方法所使用的那些毒性有机溶剂和添加剂，如，乙腈(actetonitrile)。植入包含所述物质的装置后，所述物质可引起炎症和其它反应。由于所述不可被本领域描述的包被方法所避免的不良副作用，所述装置在治疗学上是不太能被接受的。而且，开发治疗性蛋白质的国际指导要求在制备过程中应避免有害和有毒物质(具体的请看国际协调会议(ICH)，主题Q3C；www.emea.eu.int/)。然而，有利的是，本发明装置或能够通过本发明方法得到的装置没有所述毒性物质，因而，在治疗上是可以接受的，并满足管理机关的要求。
而且，在该发明装置或方法的另一优选实施方案中，所述装置没有感染性物质。
除了毒性物质外，由装置包含的感染性物质在装置植入的被试者中可以引起严重感染。然而，来源于牛或猪骨的具有潜在感染性的白明胶在许多现有技术方法中作为保护性蛋白使用(Lind，1996)。
该发明包括了含有本发明装置或通过本发明方法可以得到的装置的药用组合物。
本发明的产品可以被制成药用组合物或医学装置。所述产品的组合物可以包含附加的化合物，如稳定剂、缓冲物质和其它的赋形剂。本发明产品用于患者的量将由主治医师和其他临床因素来决定；优选根据任何的上述所描述的方法进行。正如在医学领域所知的，给予患者的用量取决于许多因素，其中包括患者大小、身体表面面积、年龄、性别、时间和投药的途径、基本健康情况、以及其它同时使用的药物。其进展可以由定期性的评估来监控。由于本发明，使得包括大型空腔(cavities)在内的许多骨缺陷的治疗变得可能。尤其是，大型空腔能够在不使用或仅仅不足地使用自体骨材料的情况下被有效地治疗。然而，由于本发明的装置或可以用本发明方法得到的装置具有可靠而有效的骨诱导和骨传导特性，已经使不进行第二次手术而进行需要广泛骨增加(bone augmentation)或骨修复的骨缺陷的治疗成为可能。
该发明也包括该发明装置或可以通过该发明的方法得到的装置制备用于骨增加的药用组合物的用途。
上文提到的术语的定义经过必要修改适用于前面提到的本发明的用途及以下描述的那些。
术语“骨增加(bone augmentation)”涉及到治疗性的骨形成，其目的是治疗骨缺陷、骨骼中空腔、或伴随骨组织丧失的疾病和障碍，或准备后来放置植入物。在以下描述的疾病和障碍在本领域是公知的，并具体描述在标准教科书，如，Pschyrembel或Stedman。
优选所述骨增加跟随在外伤性的、恶性的和人造的缺陷之后。
本发明的另一个实施方案涉及该发明装置或可由该发明方法得到的装置用于制备治疗骨缺陷的药用组合物的用途。
更优选地，所述骨缺陷是长骨缺陷或在牙根尖切除、囊肿或肿瘤的摘除、拔牙或滞留牙的外科去除之后的骨缺陷。
该发明也涉及该发明装置或可由该发明方法得到的装置用于填充空腔和牙周病学中支持物引导的组织再生的用途。
本发明另一个实施方案涉及该发明的装置或可由该发明方法得到的装置在制备用于窦底增高(sinus floor elevation)、萎缩的上颌和下颌嵴的增加以及直接植入物(immediate implants)的稳定化的药用组合物中的用途。
在本发明的范围中，还包括治疗根据本发明的用途提到的一种或多种疾病的方法，其中所述方法至少包括给被试者施用以可药用形式存在的该发明装置或可以由该发明方法得到的装置的步骤。优选所述被试者是人类。
最后，该发明涉及包含该发明装置或可以由该发明方法得到的装置的药盒(kit)。
该发明药盒的各部分可以单独包装在小瓶中、或依赖于各自成分包装在其它的适当的工具中或联合起来包装在合适的容器或多容器组件中。药盒的制备优选按照本领域技术人员公知的标准的程序进行。
以下的表显示了BMP-2、BMP-7和GDF-5的氨基酸序列人类BMP-2(Swiss-Prot主编号(Prim.Acession Number)P12643)；SEQ ID No.1Key 从 至 长度SIGNAL 123 23PROPEP 24 282 259hBMP2 283 396 11410 20 30 40 50 60| | | | | |MVAGTRCLLA LLLPQVLLGG AAGLVPELGR RKFAAASSGR PSSQPSDEVL SEFELRLLSM70 80 90100110120| | | | | |FGLKQRPTPS RDAVVPPYML DLYRRHSGQP GSPAPDHRLE RAASRANTVR SFHHEESLEE130140150160170180| | | | | |LPETSGKTTR RFFFNLSSIP TEEFITSAEL QVFREQMQDA LGNNSSFHHR INIYEIIKPA190200210220230240| | | | | |TANSKFPVTR LLDTRLVNQN ASRWESFDVT PAVMRWTAQG HANHGFVVEV AHLEEKQGVS250260270280290300| | | | | |KRHVRISRSL HQDEHSWSQI RPLLVTFGHD GKGHPLHKRE KRQAKHKQRK RLKSSCKRHP310320330340350360| | | | | |LYVDFSDVGW NDWIVAPPGY HAFYCHGECP FPLADHLNST NHAIVQTLVN SVNSKIPKAC370380390| | |CVPTELSAIS MLYLDENEKV VLKNYQDMVV EGCGCR
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人类GDF-5(Swiss-Prot主编号P43026)；SEQ ID No.3Key 从 至 长度SIGNAL 1 27 27PROPEP 28 381354hGDF-5 382 50112010 20 30 40 50 60| | | | | |MRLPKLLTFL LWYLAWLDLE FICTVLGAPD LGQRPQGSRP GLAKAEAKER PPLARNVFRP70 80 90100110120| | | | | |GGHSYGGGAT NANARAKGGT GQTGGLTQPK KDEPKKLPPR PGGPEPKPGH PPQTRQATAR130140150160170180| | | | | |TVTPKGQLPG GKAPPKAGSV PSSFLLKKAR EPGPPREPKE PFRPPPITPH EYMLSLYRTL190200210220230240| | | | | |SDADRKGGNS SVKLEAGLAN TITSFIDKGQ DDRGPVVRKQ RYVFDISALE KDGLLGAELR250260270280290300| | | | | |ILRKKPSDTA KPAVPRSRRA AQLKLSSCPS GRQPAALLDV RSVPGLDGSG WEVFDIWKLF310320330340350360| | | | | |RNFKNSAQLC LELEAWERGR TVDLRGLGFD RAARQVHEKA LFLVFGRTKK RDLFFNEIKA370380390400410420| | | | | |RSGQDDKTVY EYLFSQRRKR RAPLATRQGK RPSKNLKARC SRKALHVNFK DMGWDDWIIA430440450460470480| | | | | |PLEYEAFHCE GLCEFPLRSH LEPTNHAVIQ TLMNSMDPES TPPTCCVPTR LSPISILFID490500| |SANNVVYKQY EDMVVESCGC R
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图1GDF-5在不同pH值下5mM乙酸、5mM H3PO4/NaOH、150mM氯化钠中的溶解度。
图2GDF-5在不同pH值下20mM精氨酸/乙酸中的溶解度。
图3GDF-5在两种具有不同离子强度和pH值的缓冲液中的溶解度(HAc＝乙酸)。
图4存在10mmol/l HCl的包被过程中pH值的增加。
图575％乙腈存在的情况下pH值的增加。
图6包被过程中含有不同浓度乙酸的包被溶液的pH的依赖性。
图7通过在存在含蔗糖(右)和不含蔗糖(左)的10mmol/l乙酸的情况下包被实现的在β-TCP上GDF-5分布的均匀性(在100毫克β-TCP上的100微克GDF-5)。
图8由存在60％乙醇情况下的包被实现的在β-TCP上GDF-5分布的均匀性(在100毫克β-TCP上的100微克GDF-5)。
图9通过在存在20mmol/l甘氨酸/氢氧化钠，pH10的情况下包被实现的在β-TCP上GDF-5分布的均匀性(在100毫克β-TCP上的100微克GDF-5)。
图10在存在20mmol/l甘氨酸/氢氧化钠，pH10的情况下包被的植入物的组织形态测定分析(histomorphometrical analysis)。
图11在存在60％乙醇的情况下包被的植入物的组织形态测定分析。
图12在β-TCP上rhBMP-2分布的均匀性。
图13通过在存在蔗糖(左)和海藻糖(右)的情况下进行包被实现的在β-TCP上GDF-5分布的均匀性。
图14通过在存在乙醇(左)和甘露醇(右)时包被实现的在β-TCP上GDF-5分布的均匀性。
本发明将通过参考以下仅仅是例证性的、不构成对本发明范围的限制的生物学实施例来说明。
实施例1用RP-HPLC进行溶液中GDF-5的定量GDF-5含量通过反相(RP-)HPLC分析进行测定。样品的等分试样用Poros C8-18柱(R2/10，2.1*30毫米，Applied Biosystems)来分析。21％乙腈中的0.1％甲酸(溶剂A)和84％乙腈中的0.1％甲酸(溶剂B)用作溶剂，流速为0.4毫升/分钟。洗脱图通过测量220纳米处的吸光度来记录。GDF-5的量通过用标准曲线从220纳米处的峰面积进行计算。
实施例2提取和定量固定化蛋白质方法A被包被的β-TCP(40毫克)悬浮在700微升溶液基质(1.22摩尔/升柠檬酸，1.22摩尔/升HCl，8摩尔/升尿素)中，在4℃下孵育60分钟。离心(13200*g，2分钟)后50微升的上清液用RP-HPLC分析(见实施例1)。在各自基质溶液中用不同量的GDF-5得到标准曲线。
方法B被包被的β-TCP(40毫克)悬浮在700微升溶液基质(10毫摩尔/升Tris-HCl，pH7.4，8摩尔/升尿素，100毫摩尔/升EDTA)中，在4℃下孵育60分钟，然后离心(13200*g，5分钟)。随后，上清液按方法A中所述定量或进行进一步分析。
实施例3不同pH值下rhGDF-5的溶解度将GDF-5浓度调节为4毫克/毫升10毫摩尔/升HCl。母液的等分试样(50微升)用各自具有不同pH值的5毫摩尔/升乙酸、5毫摩尔/升H3PO4/NaOH、150毫摩尔/升氯化钠以1∶100倍稀释。将样品孵育15分钟，离心(在13,200*g下2分钟)。测定上清液的pH值和蛋白质的含量。在第二个试验中，母液用各自具有不同pH值的20毫摩尔/升精氨酸/HOAc进行稀释。图1和2的数据显示，在具有低离子强度(≤20毫摩尔/升)的缓冲液中GDF-5仅仅可溶解在酸性(pH≤5)或碱性(pH＞10)溶液中。在从pH6.0到9.5的范围中，溶解度是小于5微克/毫升。
实施例4在不同pH值下在2种具有不同离子强度的缓冲液中GDF-5的溶解性将GDF-5浓度体调节为4毫克/毫升10毫摩尔/升HCl。母液的等分试样(50微升)用各自具有不同的pH值的10毫摩尔/升乙酸/氢氧化钠和5毫摩尔/升乙酸、5毫摩尔/升H3PO4/NaOH、150毫摩尔/升氯化钠以1∶100稀释。样品孵育15分钟，离心(在13,200*g下2分钟)。测定上清液的pH值和蛋白质的含量。图3的数据显示，在所有被测试的pH值中，GDF-5在具有与生理条件相对应的较高离子强度的缓冲液中的溶解性显著低于在具有低离子强度(大约10毫摩尔/升)的缓冲液中的溶解性。
实施例5不同溶剂中GDF-5的溶解性将冷冻干燥的GDF-5溶解在纯乙腈中，室温下温育15分钟，离心(在13,200*g下2分钟)。在上清液中，没有检测到GDF-5。
将冷冻干燥的GDF-5(50微克)溶解在50微升75％乙腈中，室温下温育15分钟，离心(在13,200*g下2分钟)。在上清液中测定pH值以及GDF-5的含量。所使用的GDF-5 100％地被检测出，溶液的pH值是3。随后，通过加入NaOH将pH值调节到7.4，室温下再次温育15分钟，离心。仅检测到3微克/毫升，相对于60微克/毫升的溶解度。
这些数据显示，在纯乙腈中GDF-5是不溶的，但在包含乙腈的酸性水溶液中是可溶的。根据在水性系统中发现的结果，随着pH增加在乙腈-水混合物中的溶解度下降。
实施例6β-TCP包被过程中GDF-5溶液pH值的变化。
反应容器中，将200毫克β-TCP与200微升含有GDF-5(1毫克/毫升；由得自盐酸溶液的冷冻干燥物制备而成)的包被溶液混合。观察悬浮液的pH值30分钟。图4-5中的结果显示，当使用未缓冲的包被溶液，如，10毫摩尔/升HCl或75％乙腈(由残余量盐酸的存在导致了75％乙腈中起始酸性pH值)时，大约2分钟以后，悬浮液的pH达到pH大于6.5的范围，这对于GDF-5的溶解性而言是临界的。由于溶解的不充分，发生蛋白质的沉淀和聚集，这可以用考马斯染色法来检测(见实施例7)。
使用醋酸缓冲的包被溶液(图6)在包被过程中引起pH上升的减少。当在未缓冲的溶液中pH上升到8时，醋酸(40-80毫摩尔/升)缓冲的包被液的pH达到最大值5.4。这样，在包被过程中充分的溶解将得到保证。所使用的GDF-5能够均匀地散布，与载体结合，而不发生沉淀(见实施例7)。
延迟pH增加也可以通过使用60％乙醇来完成。这种延迟足以实现GDF-5沿着载体的均匀分布(见实施例7)。
实施例7包被均匀性的检测用考马斯亮蓝染色可以看见在载体上吸附的蛋白质。蓝色的分布与β-TCP载体上各自蛋白质的分布相关。
将3-4个包被颗粒与200微升染色液(60％PBS，40％甲醇，0.4％考马斯亮蓝R250)温育在96孔板的小孔中，室温下温育30分钟。未包被的载体用同样方法进行处理作为对照。用60％PBS，40％甲醇洗涤除去过剩的染色剂，直到作为对照的未包被载体完全脱色为止。染色的载体在40℃下干燥并通过照相存档。
实施例8颗粒的包被(I)200毫克β-TCP(0.5-1.0毫米的颗粒大小)以干燥的形式放置于一块2R玻璃上。rhGDF-5母液(10mM盐酸中含4毫克/毫升)用相对应的包被缓冲液稀释至1微克/毫升。吸取用此方法得到的GDF-5溶液200微升至β-TCP上，使之吸收。将潮湿的颗粒温育在25℃1小时，然后真空干燥。
实施例9颗粒的包被(II)200毫克β-TCP(0.5-1.0毫米的颗粒大小)以干燥的形式放置于一块2R玻璃上。rhGDF-5母液(10mM盐酸中含4毫克/毫升)用相对应的包被缓冲液稀释至1微克/毫升。吸取用此方法得到的GDF-5溶液200微升至β-TCP上，使之吸收。将潮湿的颗粒温育在25℃1小时，然后冷冻干燥。
实施例10块的包被将质量为360毫克的β-TCP块放入合适的反应容器(Eppendorf)中，与500微升包被溶液混合，温育1小时，然后真空或冷冻干燥。
实施例11不同包被方法的比较由于使用乙酸缓冲的包被溶液，能够显著降低沉淀的形成。另一个改进由加入蔗糖来完成。含蔗糖与不含蔗糖的包被质量由图7表示。在没有蔗糖时，仍然可以辨别出深蓝色小点样的个别沉淀，而存在蔗糖的包被导致无小点包被。
比较两种在研究过程中分别用60％乙醇和10毫摩尔/升甘氨酸/氢氧化钠，pH10中的包被溶液产生的制备物，包被均匀性的意义就明显了。在60％乙醇存在的情况下实现了均匀分布(图8)，而当存在甘氨酸时，在载体表面发生显著的沉淀形成(图9)。两种载体在大鼠颅盖缺陷模型中进行了比较(见下文)。
实施例12大鼠的全层(full-thickness)颅盖缺陷模型使用不同的包被缓冲液(20毫摩尔/升氨基乙酸/氢氧化钠，pH10(C1)和60％乙醇(C2))制备包被rhGDF-5(50μg/25mg β-TCP)的β-TCP。通过肌内注射替来他明-唑拉西泮(ZOLETILVIRBAC，CARROS，法国，50mg/kg，IM)对鼠进行麻醉。将头盖背部的毛拔取，然后，用杀菌肥皂(VETEDINE，VETOQUINOL，LURE，法国)擦净皮肤。手术部位涂上杀菌剂，如聚维酮碘(VETEDINE溶液，VETOQUINOL，LURE，法国)。在头皮上沿矢状缝完成一个长20毫米的切口，显示出皮肤、肌肉组织和骨外膜，暴露顶骨。用消毒生理溶液(AGUETTENT，LYON，法国)连续冲洗下，在矢状缝侧面的顶骨背部用6毫米环锯的钻(COVELY，GENAY，法国)造成缺陷。每一个动物创两个同样的缺陷。注意防止硬脑膜的损伤以及防止上矢状窦的穿刺。植入物放入以后，骨外膜和肌肉被缝合在原处，头皮被缝合(聚丙烯线，Prolène，ETHNOR，ISSY LES MOULINEAUX，法国)。
6周随访后，通过肌内注射ZOLETIL(50mg/kg)将动物麻醉，然后注射致死剂量的DOLETHALAND(Pentobarbital sodique，VETOQUINOL，LURE，法国)使动物安乐死。
从外植块上取样，并固定在10％缓冲福尔马林溶液中。然后，样品用递增浓度的乙醇溶液进行脱水，包埋在PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯(polymethylmetacrylate)，Merck KGaA，Darmstadt，德国)中。用根据Donath方法(Donath K.Breuner G.，一种研究附着有软组织的未去除石灰质的骨和齿的方法。J.Oral.Pathol.11，318-326，1982)修改的微切和碾磨技术(microcutting and grinding technique)得到20微米厚的切片。用修饰的Paragon染色切片，进行定性和半定量的光学显微镜分析。
组织学切片用Polyvar显微镜(REICHERT)4倍、10倍、25倍和40倍的目镜观察。
在C2处理部位中观察到大量骨的骨髓和成骨细胞。相反，用C1处理时骨形成很微弱。与C1比较，植入物材料的降解也是在C2中增多。植入物材料的组织形态测定分析结果见表1和图10、11。
表1
实施例13用BMP-2包被β-TCP200毫克β-TCP(0.5-1.0毫米的颗粒大小)注入2R玻璃容器中。BMP-2母液用相对应的包被缓冲液(10毫摩尔/升乙酸，10％蔗糖)稀释至1毫克/毫升。200微升的包被溶液与β-TCP一起孵育(1小时，4℃)，并冷冻干燥。包被载体上BMP-2的分布用考马斯染色显示(图12)。
实施例14存在蔗糖和海藻糖的包被方法的比较200毫克β-TCP(0.5-1.0毫米的颗粒大小)注入2R玻璃容器(2R-glass)中。GDF-5母液(10毫摩尔/升盐酸中含4mg/ml)用相对应的包被缓冲液稀释至1毫克/毫升。两种包被缓冲液变体分别包含10％蔗糖和10％海藻糖。200微升的包被溶液与β-TCP一起孵育(1小时，4℃)，冷冻干燥。包被载体上GDF-5的分布用考马斯染色显示(图13)。
实施例15存在乙醇和甘露醇的包被的比较200毫克β-TCP(0.5-1.0毫米的颗粒大小)注入2R玻璃容器中。GDF-5母液(10毫摩尔/升盐酸中含4mg/ml)用相对应的包被缓冲液稀释至1毫克/毫升。两种包被缓冲液变体分别包含60％乙醇和10％甘露醇、10mmol/L乙酸。200微升的包被溶液与β-TCP一起温育(1小时，4℃)，冷冻干燥。包被载体上GDF-5的分布用考马斯染色显示(图14)。
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权利要求
1.包括含有磷酸钙的载体和骨诱导蛋白、并具有体内骨诱导和骨传导特性的装置，其中所述载体被所述蛋白均匀包被。
2.一种制备具有体内骨诱导和骨传导特性的装置的方法，包括步骤(a)提供包含溶解的骨诱导蛋白和缓冲剂的溶液，所述缓冲剂能够保持所述蛋白被溶解充足的时间以允许当接触包含磷酸钙的载体时所述载体被均匀包被；(b)将步骤(a)的溶液与包含磷酸钙的载体接触；(c)允许所述溶解蛋白均匀包被所述载体的表面；和(d)将步骤(c)得到的经包被载体干燥。
3.权利要求2的方法，其中所述缓冲剂具有低于100毫摩尔/升、低于50毫摩尔/升或低于20毫摩尔/升的缓冲剂浓度。
4.权利要求3的方法，其中所述缓冲剂包含弱酸。
5.权利要求4的方法，其中所述弱酸是乙酸或琥珀酸。
6.权利要求2-5任一项的方法，其中所述缓冲剂还包括糖。
7.权利要求6的方法，其中所述糖是二糖。
8.权利要求7的方法，其中所述二糖是蔗糖或海藻糖。
9.权利要求2-8任一项的方法，其中所述缓冲剂包括醇。
10.权利要求9的方法，其中所述醇是乙醇或甘露醇。
11.权利要求1的装置或权利要求2-10任一项的方法，其中所述磷酸钙是β磷酸三钙、α磷酸三钙、磷灰石或包含磷酸钙的粘固粉。
12.权利要求1的装置、权利要求2-10任一项的方法或权利要求11的装置或方法，其中所述骨诱导蛋白是TGF-β家族的成员。
13.权利要求12的装置或方法，其中所述TGF-β家族的成员是BMP亚家族的成员。
14.权利要求13的装置或方法，其中所述BMP家族的成员是BMP2或BMP7。
15.权利要求12的装置或方法，其中所述TGF-β家族的成员是GDF-5、GDF-6和GDF-7组的蛋白。
16.权利要求15的装置或方法，其中所述GDF是GDF-5。
17.权利要求1的装置、权利要求2-10任一项的方法或权利要求11-16任一项的装置或方法，其中所述装置没有毒性物质。
18.权利要求1的装置、权利要求2-10任一项的方法或权利要求11-17任一项的装置或方法，其中所述装置没有感染性物质。
19.包含权利要求1或11-18任一项的或可以由权利要求2-18任一项的方法得到的装置的药用组合物。
20.权利要求1或11-18任一项的或可以由权利要求2-18任一项的方法得到的装置在制备用于骨增加的药用组合物中的用途。
21.权利要求20的用途，其中所述骨增加跟随在外伤性的、恶性的或人造的缺陷之后，或是随后放置植入物的前提条件。
22.权利要求1或11-18任一项的或可以由权利要求2-18任一项的方法得到的装置用于制备治疗骨缺陷的药用组合物的用途。
23.权利要求22的用途，其中所述骨缺陷是长骨缺陷、上颌面区域缺陷或牙根尖切除、囊肿或肿瘤摘除、拔牙、或滞留牙的外科去除之后的骨缺陷。
24.权利要求1或11-18任一项的或可以由权利要求2-18任一项的方法得到的装置用于制备治疗变性的和外伤性的椎间盘疾病的药用组合物的用途。
25.权利要求1或11-18任一项的或可以由权利要求2-18任一项的方法得到的装置用于制备治疗骨裂开的药用组合物的用途。
26.权利要求1或11-18任一项的或可以由权利要求2-18任一项的方法得到的装置的用途，用于制备用于窦底增高或增加萎缩的上颌或下颌嵴的药用组合物。
27.包含权利要求1或11-18任一项的或可以由权利要求2-18任一项的方法得到的装置的药盒。
全文摘要
本发明涉及包括含有磷酸钙的载体和骨诱导蛋白、并具有体内骨诱导和骨传导特性的装置，其中所述载体被所述蛋白均匀包被。此外，本发明涉及制造在体内具有骨诱导和骨传导特性的装置的方法。该发明包括包含该发明的装置或可以由该发明的方法得到的装置的药用组合物，并涉及所述装置制备用于骨增加、治疗骨缺陷、治疗变性的和外伤性的椎间盘疾病、治疗骨裂开或用于窦底增高的药用组合物的用途。最后，该发明涉及包含该发明装置或可以由该发明方法得到的装置的药盒。
文档编号A61L27/54GK1561235SQ02819274
公开日2005年1月5日 申请日期2002年3月27日 优先权日2001年11月19日
发明者U·科纳特, S·珀林, K·黑勒布兰德, P·哈珀斯伯格 申请人:Scil技术股份有限公司