用于在核基因转移的受体中产生没有发育能力的卵子的方法和组合物的制作方法

用于在核基因转移的受体中产生没有发育能力的卵子的方法和组合物的制作方法
【专利摘要】本技术提供了没有发育能力的卵细胞，其是通过对卵母细胞前体细胞中的至少一种基因进行遗传工程化(例如，失活)，并且将所述卵母细胞前体细胞在足以产生卵细胞的条件下培养而生产的。本技术还提供了使用所述没有发育能力的卵细胞的方法。
【专利说明】用于在核基因转移的受体中产生没有发育能力的卵子的方法和组合物
[0001]相关申请的交叉引用
本申请要求于2013年10月2日提交的美国临时申请号61/885,559的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
[0002]政府资助
本技术在美国政府支持下进行，得到了美国国立卫生研究院(the Nat1nal Intituteof Health)授予的资助R37-AG012279。美国政府拥有本技术的某些权利。
【背景技术】
[0003]提供以下说明以辅助读者的理解。所提供的信息或引用的文献均不被承认为现有技术。
[0004]以三磷酸腺苷(ATP)形式向所有细胞提供细胞能量的线粒体对于成功受精至关重要。源自母本(卵子)的线粒体充当新形成胚胎的线粒体的唯一来源，而源自父本(精子)的线粒体在精子受精后被卵子降解。现已将通常伴随延迟的母本年龄而观察到的卵子线粒体功能受损与胚胎发育能力不良关联在一起，胚胎发育能力不良会导致胚胎生长停滞、胚胎着床失败和流产。
[0005]线粒体在生育能力(fertility)方面也是重要的，因为根源于线粒体DNA突变的病变导致广泛的人类疾病，包括癫痫、耳聋、糖尿病、心肌病，和肝功能衰竭。

【发明内容】

[0006]在一个方面，本技术涉及没有发育能力的卵细胞，其经过工程改造，从而表达与野生型卵细胞相比降低水平的一种或多种蛋白质，所述一种或多种蛋白质由选自以下的一个或多个基因编码:合子阻滞蛋白I ("ZAR 1〃)、卵母细胞分泌蛋白I ("0SP1")，和胚胎所需的母体抗原("MATER")。在一些实施方式中，所述卵细胞不包含可检测水平的一种或多种蛋白质，所述一种或多种蛋白质由选自以下的一个或多个基因编码:ZAR 1、0SP1和MATER。
[0007]在一些实施方式中，所述没有发育能力的卵细胞已经受精。
[0008]在一些实施方式中，所述没有发育能力的卵细胞包含雌性和雄性原核。
[0009]在一些实施方式中，所述没有发育能力的卵细胞包含选自以下的失活基因:ZAR
1、OSPI和MATER。
[0010]在一些实施方式中，所述没有发育能力的卵细胞已经被摘除细胞核。
[0011]另一方面，本技术涉及用于产生没有发育能力的卵细胞的方法，其包括在卵母细胞前体细胞中，使选自以下的一个或多个基因失活:ZAR 1、0SP1和MATER;在一定条件下培养所述卵母细胞前体细胞以得到所述没有发育能力的卵细胞。
[0012]在一些实施方式中，所述卵母细胞前体细胞选自:雌性生殖系干细胞、胚胎干细胞、诱导的多能干细胞、皮肤细胞、骨髓细胞和外周血细胞。
[0013]在一些实施方式中，所述失活包括选自以下的一种或多种技术:CRISPR/Cas9、转录激活因子样效应物核酸酶(transcript1n activator-1 ike effector nucleases ,TALENS)、经工程改造的巨核酸酶(meganucleases)、锌指核酸酶(ZFN)、定点诱变，和条件性敲除。
[0014]在一些实施方式中，所述方法还包括使所述卵细胞受精。
[0015]在一些实施方式中，所述方法还包括摘除所述没有发育能力的卵细胞的细胞核。
[0016]另一方面，本技术涉及用于增强供体受精卵的线粒体健康的方法，包括将所述供体受精卵的细胞核引入到上述没有发育能力的卵细胞中，从而产生嵌合的供体受精卵细胞。
[0017]在一些实施方式中，所述供体受精卵细胞携带一个或多个线粒体基因突变。
[0018]在一些实施方式中，所述供体受精卵细胞携带已知的线粒体疾病。
[0019]在一些实施方式中，所述经工程改造的供体受精卵细胞发生胚胎形成。
[0020]在一些实施方式中，所述没有发育能力的卵细胞是人的卵细胞。
[0021]发明详述
应理解，下文中以不同的详细程度描述了本技术的某些方面、模式、实施方式、变式和特征，以提供对本技术的实质性理解。在上文中介绍且在下文中更详细讨论的各种构思可以多种方式中的任一种实施，因为所述构思不限于任何具体的实施方式。提供具体实施和应用的实例主要是出于说明的目的。以下提供了在本说明书中使用的某些术语的定义。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本技术所属领域中的普通技术人员通常所理解相同的含义。
[0022]除非上下文另有清楚规定，否则如本文使用的单数形式“一”(〃a〃、〃an〃和〃the")包括复数的指示物。例如，提及的“一个细胞”包括两个或更多细胞的组合，诸如此类。
[0023]如本文使用的，“约”是本领域普通技术人员所理解的，并且可依赖于使用该词的上下文而在一定程度上变化。如果存在对本领域普通技术人员而言不清楚的该术语的使用，则依据使用该词的上下文，“约”可表示特定术语的正或负10%。
[0024]如本文使用的术语“没有发育能力的卵子”和“没有发育能力的卵细胞”可互相交换使用，并且是指即便在受精后也不能分裂和形成胚胎的卵细胞。
[0025]挺述
辅助生殖技术(ART)程序允许将存在于待转移的受精卵中的核遗传物质(例如细胞核)转移至受精的摘除细胞核的卵子(即，核遗传物质被移除的受精卵)中。这种程序会是有益的实例是被诊断具有线粒体疾病的受精卵。来自患有线粒体疾病的受精卵(即供体卵子)的核遗传物质，可被移出并被植入到受精的摘除细胞核的卵子(即，受体卵子)中，所述受体卵子表达健康的线粒体。所得的胚胎和后代将携带供体卵子的遗传信息，但不会具有线粒体疾病。
[0026]然而，上文公开的方法确实存在伦理上的障碍。因为受体卵子在摘除细胞核之前是受精的，以准备接受供体卵子的核遗传物质，所以不清楚受体卵子的细胞核摘除是否导致活胚胎的牺牲。如果这种程序发生在人的卵子中，那么伦理问题是极为显著的。
[0027]目前尚不存在成熟的处理方案，以优化接受体外受精(IVF)的妇女的卵子和胚胎的能量潜能(energetic potential)。也没有防止线粒体疾病遗传的成熟的处理方案。线粒体疾病和病变包括但不限于:例如阿尔?自斯病(Alpers Disease)、巴特综合征(BarthSyndrome)、致死性婴儿心肌病(LIC)、β_氧化缺陷、肉碱-酰基-肉碱缺乏症，肉碱缺乏症、肌酸缺乏综合征;辅酶Q1缺乏症、复合体I缺乏症、复合体II缺乏症、复合体III缺乏症、复合体IV缺乏症/COX缺乏症、复合体V缺乏症、慢性进行性眼外肌麻痹综合征(CPEO)、肉碱棕榈酰转移酶(CPT) I缺乏症、CPT II缺乏症；卡恩斯-塞尔综合征(Kearns-Sayre Syndrome ,KSS)、乳酸性酸中毒、具有脑干和脊髓受累和乳酸升高的脑白质病(BSL -脑白质营养不良)、长链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症(LCAD)、长链3-羟基酰基辅酶A脱氢酶缺乏症(LCHAD)、雷氏病或综合征(Leigh Disease or Syndrome)、勒夫特病(Luf t Disease)、多发性酰基辅酶A脱氢酶缺乏症(MAD/II型戊二酸尿症)、中链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症(MCAD)、线粒体脑肌病乳酸性酸中毒和卒中样发作(MELAS)、肌阵挛性癫痫伴破碎红纤维病(MERRF)、线粒体隐性共济失调综合征(MIRAS)、线粒体细胞病、线粒体DNA缺失、线粒体脑病、线粒体肌病，肌神经胃肠疾病和脑病(MNGIE)、神经病变、共济失调和色素性视网膜炎(NARP)、皮尔森综合征(Pearson Syndrome)，丙酮酸羧化酶缺乏症、丙酮酸脱氢酶缺乏症;POLG突变、短链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症(SCAD)、短链3-羟基酰基辅酶A缺乏症(SCHAD)，和超长链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症(VLCAD)。
[0028]本体技术提供了用于产生没有发育能力的(“灭活”)卵子的方法和组合物，所述灭活的的卵子不具有在精子入卵后发生胚胎形成的可能性。因此，由于对存在的遗传物质的靶向突变而没有发育能力的这些灭活的卵子可用于摘除细胞核的方法，随后为来自线粒体功能(例如生物产能的能力)受损或具有基于线粒体DNA突变的病变的雌性的受精卵的遗传物质的转移。这种方法是有利的，至少因为其提供了一种途径以优化胚胎的能量潜能，从而改进IVF后的妊娠结果，或防止线粒体疾病遗传，而没有与精子入卵(即受精)后受体卵细胞核摘除相关的潜在胚胎破坏的伦理问题。
[0029]在一个方面，本技术提供了没有发育能力的卵子组合物(S卩，灭活的卵子)，其在精子入卵(即受精)后不会发生胚胎形成。在另一方面，本技术提供了用于制备没有发育能力的卵子(即，灭活的卵子)的方法，所述灭活的卵子在精子入卵(即受精)后不会发生胚胎形成。在另一方面，本技术提供了使用所述没有发育能力的卵子的方法。
[0030]本技术的没有发育能力的卵子组合物
一方面，本技术提供了没有发育能力的卵细胞组合物。在一些实施方式，与野生型的有(发育)能力的卵子(competent egg)相比，所述没有发育能力的卵子具有降低的基因产物水平。在一些实施方式中，所述卵子由于至少一个基因的失活而没有发育能力，并且包含至少一个失活的基因。在一些实施方式中，所述至少一个基因的失活阻止胚胎形成。在一些实施方式中，所述至少一个基因的失活阻止受精后的胚胎形成。在一些实施方式中，所述失活的一个或多个基因导致对早期胚胎形成、中期胚胎形成和/或晚期胚胎形成的阻止。
[0031]在一些实施方式中，没有发育能力的卵子是受精卵，其具有至少一种失活的酶，其中所述失活的酶阻止所述受精卵的胚胎形成。在一些实施方式中，所述没有发育能力的卵细胞包含雌性和雄性原核。不希望被理论束缚，没有发育能力的受精卵提供了一种合乎伦理的途径，以提供用于来自其他受精卵的遗传物质的理想受体，因为没有发育能力的受精卵绝不会形成活胚胎;因此，摘除没有发育能力的受精卵的细胞核不产生伦理问题。
[0032]以举例而非限制的方式，在一些实施方式中，所述失活的基因选自:合子阻滞蛋白I (ZAR I)基因、卵母细胞分泌蛋白I (0SP1)基因，和胚胎所需的母体抗原(MATER)基因。
[0033]在一些实施方式中，以上列出的基因之一的失活导致随后基因产物(例如蛋白质)的损失，这种损失阻止受精卵向胚胎阶段的转变。因此，在一些实施方式中，所述没有发育能力的卵子组合物缺少失活基因的产物(即，与野生型相比降低的所述产物水平)。
[0034]在一些实施方式中，所述没有发育能力的卵子源自卵母细胞前体细胞。以举例而非限制的方式，在一些实施方式中，所述卵母细胞前体细胞包括但不限于:多能细胞、单能细胞、雌性生殖系干细胞(fGSC，也称为卵原干细胞或0SC)、胚胎干细胞(ESC)、诱导的多能干细胞(iPSCs)、骨髓、外周血和皮肤细胞。
[0035]在一些实施方式中，所述没有发育能力的卵子是哺乳动物的卵子、爬行动物的卵子、鱼的卵子、两栖动物的卵子、昆虫的卵子或鸟类的卵子。可产生所述卵子的哺乳动物包括，例如家畜，如羊、猪、牛和马;宠物，如狗和猫;实验动物，如大鼠、小鼠、猴和兔。在一个实施方式中，所述哺乳动物是人。
[0036]在一些实施方式中，所述没有发育能力的卵子不具有疾病。以举例而非限制的方式，疾病可包括但不限于线粒体疾病或病变。线粒体疾病和病变包括但不限于:例如阿尔珀斯病(Alpers Disease)、巴特综合征(Barth Syndrome)、致死性婴儿心肌病(LIC)、β_氧化缺陷、肉碱-酰基-肉碱缺乏症；肉碱缺乏症、肌酸缺乏综合征;辅酶QlO缺乏症、复合体I缺乏症;复合体II缺乏症、复合体III缺乏症、复合体IV缺乏症/COX缺乏症、复合体V缺乏症、慢性进行性眼外肌麻痹综合征(CPEO)、肉碱棕榈酰转移酶(CPT) I缺乏症、CPT II缺乏症;卡恩斯-塞尔综合征(Kearns-Sayre Syndrome, KSS)、乳酸性酸中毒、具有脑干和脊髓受累和乳酸升高的脑白质病(BSL -脑白质营养不良)、长链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症(LCAD)、长链3-轻基酰基辅酶A脱氢酶缺乏症(LCHAD)、雷氏病或综合征(Leigh Disease or Syndrome)、勒夫特病(Luft Disease)、多发性酰基辅酶A脱氢酶缺乏症(MAD/II型戊二酸尿症)、中链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症(MCAD)、线粒体脑肌病乳酸性酸中毒和卒中样发作(MELAS)、肌阵挛性癫痫伴破碎红纤维病(MERRF)、线粒体隐性共济失调综合征(MIRAS)、线粒体细胞病、线粒体DNA缺失、线粒体脑病、线粒体肌病，肌神经胃肠疾病和脑病(MNGIE)、神经病、共济失调和色素性视网膜炎(NARP)、皮尔森综合征(Pearson Syndrome)，丙酮酸羧化酶缺乏症、丙酮酸脱氢酶缺乏症;POLG突变、短链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症(SCAD)、短链3-羟基酰基辅酶A缺乏症(SCHAD)，和超长链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症(VLCAD)。
[0037]本技术的没有发育能力的卵子的制备
在一个方面，本技术提供了制备没有发育能力的卵子的方法。
[0038]在一些实施方式中，通过对卵母细胞前体细胞中至少一个基因的遗传工程改造(例如，失活)，并且随后在足以产生没有发育能力的卵细胞的条件下培养所述遗传工程改造的卵母细胞前体细胞，来产生没有发育能力的卵子。在一些实施方式中，所述没有发育能力的卵细胞的产生还包括使所述没有发育能力的卵细胞受精。
[0039]以举例而非限制的方式，在一些实施方式中，所述前体细胞包括但不限于:多能细胞、单能细胞、雌性生殖系干细胞(fGSC，也称为卵原干细胞或OSC)、胚胎干细胞(ESC)、诱导的多能干细胞(iPSC)、骨髓、外周血和皮肤细胞。
[0040]在一些实施方式中，所述卵母细胞前体中的基因的失活在体外发生。在一些实施方式中，所述没有发育能力的卵子的受精在体外发生。
[0041 ]所述卵母细胞前体内的基因可以通过本领域中已知的任何方法失活。以举例而非限制的方式，在一些实施方式中，卵子内的基因通过以下失活:CRISPR/Cas9、转录激活因子样效应物核酸酶(TALENS)、经工程改造的巨核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、定点诱变，和条件性敲除，例如Cre-ZoxP系统。参见例如，Sun et al, B1logy of Reproduct1n, 79: 014-120 (2008)。
[0042]在一些实施方式中，至少一个基因的失活阻止所述没有发育能力的卵细胞中的早期胚胎形成。在一些实施方式中，至少一个基因的失活甚至在受精后阻止早期胚胎形成。
[0043]以举例而非限制的方式，在一些实施方式中，所述失活的基因选自:合子阻滞蛋白I (ZAR I)基因、卵母细胞分泌蛋白I (0SP1)基因，和胚胎所需的母体抗原(MATER)基因。
[0044]使用没有发育能力的卵子的方法
在另一个方面，本技术涉及在两个受精卵之间交换核遗传物质的方法。在一些实施方式中，所述受精卵之一自始即没有发育能力。在一些实施方式中，用于在两个卵子之间交换核遗传物质的方法包括使用本技术的没有发育能力的卵子组合物。
[0045]在一些实施方式中，用于在两个卵子之间交换遗传物质的方法包括:
收获前体细胞；
使所述前体细胞中至少一个基因失活；
在足以产生没有发育能力的受体卵子的条件下，培养所述前体细胞；
在适于产生受精的没有发育能力的受体卵子的条件下，使所述没有发育能力的受体卵子与精子体外接触；
摘除所述受精的没有发育能力的受体卵子的细胞核，以产生摘除细胞核的没有发育能力的受体卵子;以及
在一定条件下，用来自受精的供体卵子的核遗传物质使所述摘除细胞核的没有发育能力的受体卵子成核，其中所述摘除细胞核的没有发育能力的受体卵子接受来自所述受精的供体卵子的所述核遗传物质以产生有发育能力的卵子。在一些实施方式中，所述核遗传物质包含核细胞器。
[0046]在一些实施方式中，用于产生没有发育能力的卵细胞的方法包括:在卵母细胞前体细胞中，使选自ZAR 1、0SP1和MATER的一个或多个基因失活，并且在一定条件下培养所述卵母细胞前体细胞以得到所述没有发育能力的卵细胞。
[0047]在一些实施方式中，所述方法还包括:在用来自供体卵子的所述核遗传物质使所述摘除细胞核的没有发育能力的受体卵子成核之后，加入至少一种试剂以引发胚胎形成。试剂包括但不限于源自所述被失活的基因的蛋白质，例如，合子阻滞蛋白1、卵母细胞分泌蛋白I和胚胎所需的母体抗原。
[0048]在一些实施方式中，用于使基因失活的方法选自下列技术中的一种或多种:CRISPR/Cas9、转录激活因子样效应物核酸酶(TALENS)、经工程改造的巨核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、定点诱变或条件性敲除，例如，Cre-LoxP系统。
[0049]以举例而非限制的方式，在一些实施方式中，所述被失活的基因选自合子阻滞蛋白I(ZAR I)、卵母细胞分泌蛋白I(0SP1)和胚胎所需的母体抗原(MATER)。在一些实施方式中，至少一个基因的失活阻止了卵子受精后的胚胎形成。在一些实施方式中，所述基因的失活阻止了早期、中期或晚期胚胎形成。
[°°50] 在一些实施方式中，所述基因的失活在离体(ex rira)或体外(1 riiro)进行。
[0051]在一些实施方式中，所述受体卵子没有疾病。在一些实施方式中，所述受体卵子没有线粒体疾病。
[0052]在一些实施方式中，所述受精的供体卵子具有疾病或病变。在一些实施方式中，所述疾病选自:阿尔?自斯病(Alpers Disease)、巴特综合征(Barth Syndrome)、致死性婴儿心肌病(LIC)、β_氧化缺陷、肉碱-酰基-肉碱缺乏症，肉碱缺乏症、肌酸缺乏综合征;辅酶QlO缺乏症、复合体I缺乏症、复合体II缺乏症、复合体III缺乏症、复合体IV缺乏症/COX缺乏症、复合体V缺乏症、慢性进行性眼外肌麻痹综合征(CPEO)、肉碱棕榈酰转移酶(CPT) I缺乏症、CPT II缺乏症;卡恩斯-塞尔综合征(Kearns-Sayre Syndrome, KSS)、乳酸性酸中毒、具有脑干和脊髓受累和乳酸升高的脑白质病(BSL -脑白质营养不良)、长链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症(LCAD)、长链3-羟基酰基辅酶A脱氢酶缺乏症(LCHAD)、雷氏病或综合征(LeighDisease or Syndrome)、勒夫特病(Luft Disease)、多发性酰基辅酶A脱氢酶缺乏症(MAD/II型戊二酸尿症)、中链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症(MCAD)、线粒体脑肌病乳酸性酸中毒和卒中样发作(MELAS)、肌阵挛性癫痫伴破碎红纤维病(MERRF)、线粒体隐性共济失调综合征(MIRAS)、线粒体细胞病、线粒体DNA缺失、线粒体脑病、线粒体肌病，肌神经胃肠疾病和脑病(MNGIE)、神经病、共济失调和色素性视网膜炎(NARP)、皮尔森综合征(Pearson Syndrome),丙酮酸羧化酶缺乏症、丙酮酸脱氢酶缺乏症；POLG突变、短链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症(SCAD)、短链3-羟基酰基辅酶A缺乏症(SCHAD)，和超长链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症(VLCAD)。
[0053]在一些实施方式中，具有来自供体卵子的核遗传物质的所述没有发育能力的卵细胞可用于提尚生育能力。
[0054]在一些实施方式中，具有来自供体卵子的核遗传物质的所述没有发育能力的卵细胞可用于减少遗传病(例如，线粒体疾病或病变)的遗传。
[0055]在一些实施方式中，具有来自供体卵子的核遗传物质的所述没有发育能力的卵细胞可用于增强供体受精卵细胞的线粒体健康，其中向所述没有发育能力的卵细胞中引入所述供体受精卵细胞的细胞核产生了经工程改造的健康的供体受精卵细胞。
[0056]在一些实施方式中，具有来自供体卵子的核遗传物质的没有发育能力的卵细胞可作为一种选择用于优化正接受体外受精的妇女的卵子和胚胎的能量潜能。
[0057]在一些实施方式中，具有来自供体卵子的核遗传物质的没有发育能力的卵细胞可作为治疗选择用于防止线粒体疾病。
[0058]试剂盒
在一些实施方式中，本技术涉及试剂盒。在一些实施方式中，试剂盒包括本技术的至少一个没有发育能力的受精卵及其在本技术的方法中的使用说明书。
[0059]在一些实施方式中，试剂盒还包括用于摘除细胞核和/或成核的工具。另外，或可选地，在一些实施方式中，试剂盒还包括用于保存受精卵和/或摘除细胞核或成核的溶液。
[0060]在一些实施方式中，本技术的没有发育能力的受精卵没有线粒体疾病。在一些实施方式中，本技术的没有发育能力的受精卵没有疾病。
[0061]在一些实施方式中，本技术的没有发育能力的受精卵为哺乳动物的卵子、爬行动物的卵子、鱼类的卵子、两栖动物的卵子、昆虫的卵子或鸟类的卵子。可产生所述卵子的哺乳动物包括，例如，家畜，如羊、猪、牛和马；宠物，如狗和猫;实验动物，如大鼠、小鼠、猴和兔。在一个实施方式中，所述哺乳动物是人。
[0062]在一些实施方式中，试剂盒还包括如何使用所述试剂盒的说明书。以举例而非限制的方式，在一些实施方式中，说明书将会披露如何给所述试剂盒中的受精卵摘除细胞核，以及如何摘除细胞核且随后用来自另一个受精卵的核遗传物质使本技术的摘除细胞核的受精的没有发育能力的卵子成核。
实施例
[0063]这些实施例是对本技术的应用的非限制性实施方式。
[0064]实施例1: TALEN敲除ZAR I阻止了小鼠胚胎形成
此实施例显示，敲除小鼠卵母细胞中的ZAR I阻止了所述ZAR I KO卵母细胞在体外受精(IVF)后的胚胎形成。
[0065]材料和方法
TALEN蛋白质是人造的序列特异性核酸内切酶，其含有黄单胞杆菌(Xan iAoff1flas)转录激活因子样效应物(TALE)和FokI限制性核酸内切酶的核酸酶域。TALE的DNA结合域由33-35个氨基酸基序的串联重复序列组成，其中存在两个关键的相邻氨基酸对，称为重复可变二残基(RVD)，其决定了对单个核苷酸的结合特异性。RVD与其所识别的核苷酸之间存在一对一的关系。使用此密码，可以用识别所需核苷酸序列的DNA结合基序来构建TALEN。当两种TALEN在细胞中表达并以适当的距离(称为间隔区)结合至基因组时，FokI的核酸酶域二聚化并在该间隔区内生成双链断裂(DSB)。此损伤通过非同源末端连接(NHEJ)被频繁修复，而非同源末端连接是易错机制，其导致了小的插入或缺失(indel)突变的引入。已经报道了 TALEN可用于产生KO动物，例如，果蝇、蚕、斑马鱼、爪蟾(Xenopus)和大鼠。参见，例如，Kato 等 ，Product1n of Sry knockout mouse using TALEN viaoocyte inject1n, SCIENTIFIC REPORTS (2Ol3年11月5日)0
[0066]使用在线的TALEffector Nucleotide Targeter 2.0软件程序，针对ZAR I设计了 TALEN质粒。在pcDNA-TAL-NC载体质粒中装配TALEN。使用具有对照载体的载体质粒作为对照。
[0067]显微注射..用PvuII限制性核酸内切酶消化TALEN质粒和对照质粒。将每种经消化的质粒各I微克用作体外转录反应的模板，根据制造商的说明，使用mMESSAGE mMACHINE T7试剂盒(Life Technologies)。根据制造商的说明，使用MegaC I ear试剂盒(LifeTechnologies)纯化合成的RNA。使用NanoDrop 1000分光光度计测定RNA的浓度，并用注射缓冲液(10 mM Tris-HCl/0.1 mM EDTA (pH 7.4))稀释至600 ng/ml，其中总共存在两种TALEN mRNA(l:1的比例，S卩，各300 ng/ml)。使用得自超数排卵的(C57BL/6 3 DBA2)F1小鼠的卵母细胞，按照标准程序，将所述两种TALEN mRNA混合物和对照载体显微注射入卵母细胞的细胞质。
[0068]体外受餘在补充有4 mg/ml BSA的钾单纯优化培养基(KSOM)中制备了约2 x 15个精子细胞/ml的浓度，并进行了常规的IVF以及测量了胚胎形成。
[0069]题
按照预期，相比用对照载体处理的卵母细胞，具有针对ZAR I所设计的TALEN的卵母细胞在IVF后将不显示出显著的胚胎形成迹象。这些结果将表明，使特定基因失活对于产生没有发育能力的卵子是有用的。
[0070]实施例2:工程改造小鼠胚胎干细胞以产生具有ZAR I基因敲除的卵母细胞前体细
H
使用上述方法，工程改造胚胎干细胞以得到失活的ZAR I基因。在一定条件下培养所述ZAR I缺陷的干细胞，以分化成没有发育能力的卵子，例如，ZAR I缺陷的卵细胞。
[0071]使所述没有发育能力的卵子接受体外受精。使用经体外受精的野生型小鼠卵子作为对照。
[0072]按照预期，源自小鼠胚胎干细胞的所述没有发育能力的卵子在受精后将会形成雌性原核和雄性原核。然而，相比对照细胞，所述没有发育能力的卵子将不会分裂或进入胚胎形成。
[0073]这些结果将表明，多能干细胞可以用于生成没有发育能力的卵子。
[0074]实施例3:从野生型受精卵转移核遗传物质解除了ZAR I敲除对胚胎形成的抑制此实施例显示，从野生型受精卵转移核遗传物质将解除ZAR I敲除对胚胎形成的抑制。
[0075]材料和方法
使用实施例1或2中所述的方案生成受精的ZAR I敲除卵子。
[0076]收获来自野生型雌性小鼠的卵子，并通过以上讨论的体外受精方案使其受精。未接受体外受精的来自野生型雌性小鼠的卵子被用作对照。
[0077]摘除由实施例1或2所产生的ZARI敲除卵子的细胞核以移除其核遗传物质。用来自受精的野生型卵子的细胞核或来自未受精的野生型卵子的细胞核，使摘除细胞核的ZARI敲除卵子重新成核。在重新成核后的I天、2天、3天、4天、5天、6天、7天和/或2周后，测试了重新成核的卵子的胚胎形成和正常发育。
[0078]结果
按照预期，相比对照(即，用来自未受精的野生型卵子的核遗传物质重新成核的ZAR I敲除卵子)，用来自受精的野生型卵子的核遗传物质重新成核的ZAR I敲除卵子将会表现出胚胎形成和正常发育的迹象。
[0079]这些结果将表明，没有发育能力的卵子，S卩，ZARI敲除卵子，可以通过转移来自野生型受精卵的核遗传物质而被拯救成有发育能力的卵子。因此，本技术的没有发育能力的卵子可用作来自其它卵子的核遗传物质的受体，因为其可通过具有胚胎活性的核遗传物质的成核而变得具有胚胎形成能力。
[0080]实施例4:从有线粒体疾病的供体卵子向ZAR I敲除的没有发育能力的受体卵子转移核遗传物质
此实施例显示，没有发育能力的卵子可以充当来自有线粒体疾病的供体卵子的核遗传物质的受体，并且发育成正常胚胎，即，不会表现出线粒体功能障碍或疾病的迹象。
[0081 ] 材料和方法
使用实施例1或2中所述的方案生成受精的ZAR I敲除卵子。
[0082]收获来自有线粒体疾病的雌性小鼠的卵子，并通过以上讨论的体外受精方案使其受精O
[0083]摘除所述受精的ZARI敲除卵子的细胞核以移除其核遗传物质。用来自有线粒体疾病的受精卵的细胞核，使摘除细胞核的ZAR I敲除卵子重新成核。未接受核遗传物质转入的来自有线粒体疾病的雌性小鼠的受精卵被用作对照。在重新成核后的I天、2天、3天、4天、5天、6天、7天和/或2周后，测试了重新成核的卵子和对照卵子的胚胎形成和正常发育。
[0084]结果
按照预期，相比受精的有线粒体疾病的对照卵子，用来自受精的有线粒体疾病的卵子的细胞核重新成核的ZAR I敲除卵子将会表现出改善的胚胎形成和正常发育。这些结果将表明，没有发育能力的卵子可以拯救有线粒体疾病的卵子的正常发育。因此，本技术的没有发育能力的卵子可用于防止线粒体疾病传给后代。
[0085]等同形式
本技术不受限于本申请中所述【具体实施方式】，这些实施方式旨在作为对本技术的个体方面的单独说明。可以不背离其精神和范围而做出对本技术的许多修改形式和变型，这对于本领域技术人员将是显而易见的。根据上述说明书，除了本文中列举的那些以外，在本技术的范围内的功能上等同的方法和装置，对于本领域技术人员将是显而易见的。此类修改形式和变型旨在落入所附权利要求书的范围内。本技术仅受限于所附权利要求书，以及等同于此权利要求书所赋予的整个范围。应当理解，本技术不限于可以当然变化的具体方法、试剂、化合物、组合物或生物体系。还应当理解，本文中所用的术语仅出于描述【具体实施方式】的目的，而并非旨在进行限制。
【主权项】
1.没有发育能力的卵细胞，其经过工程改造，从而表达与野生型卵细胞相比降低水平的一种或多种蛋白质，所述一种或多种蛋白质由选自以下的一个或多个基因编码:合子阻滞蛋白I ("ZAR 1〃)、卵母细胞分泌蛋白I (〃OSPΓ)，和胚胎所需的母体抗原(〃MATER〃)。2.根据权利要求1的没有发育能力的卵细胞，其中所述卵细胞不包含可检测水平的一种或多种蛋白质，所述一种或多种蛋白质由选自以下的一个或多个基因编码:ZAR UOSPl和MATER。3.根据权利要求1或2的没有发育能力的卵细胞，其已经受精。4.根据权利要求1-3中任一项的没有发育能力的卵细胞，其包含雌性和雄性原核。5.根据权利要求1-4中任一项的没有发育能力的卵细胞，其包含选自以下的失活基因:ZAR 1、OSPI和MATER。6.根据权利要求1-3中任一项的没有发育能力的卵细胞，其已经被摘除细胞核。7.用于产生没有发育能力的卵细胞的方法，包括:在卵母细胞前体细胞中，使选自以下的一个或多个基因失活:ZAR 1、0SP1和MATER;在一定条件下培养所述卵母细胞前体细胞以得到所述没有发育能力的卵细胞。8.根据权利要求8的方法，其中所述卵母细胞前体细胞选自:雌性生殖系干细胞、胚胎干细胞、诱导的多能干细胞、皮肤细胞、骨髓细胞和外周血细胞。9.根据权利要求7或8的方法，其中失活包括选自以下的一种或多种技术:CRISPR/Cas9、转录激活因子样效应物核酸酶(TALENS)、经工程改造的巨核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、定点诱变和条件性敲除。10.根据权利要求7-9中任一项的方法，还包括使所述没有发育能力的卵细胞受精。11.根据权利要求7-10中任一项的方法，还包括摘除所述没有发育能力的卵细胞的细胞核。12.用于增强供体受精卵细胞的线粒体健康的方法，包括:将所述供体受精卵的细胞核引入到根据权利要求6的没有发育能力的卵细胞中，从而产生经工程改造的供体受精卵细胞。13.根据权利要求12的方法，其中所述供体受精卵细胞携带一个或多个线粒体基因突变。14.根据权利要求12或13的方法，其中所述供体受精卵细胞携带已知的线粒体疾病。15.根据权利要求12的方法，其中所述经工程改造的供体受精卵细胞发生胚胎形成。16.根据权利要求1-15中任一项的方法，其中所述没有发育能力的卵细胞为人卵细胞。17.试剂盒，其包含根据权利要求1-6中任一项的没有发育能力的卵细胞。18.根据权利要求17的试剂盒，还包含使用所述试剂盒的说明书。
【文档编号】C12N15/873GK105934512SQ201480066072
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2014年10月2日
【发明人】J.L.蒂利, D.C.伍兹
【申请人】东北大学