专利名称：一种受体蛋白及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种受体蛋白及其编码基因与应用。
背景技术：
细胞刺激素CCL18属于细胞趋化因子C-C亚族的一种。它主要由具有M2显型的单核衍生细胞分泌。M2巨噬细胞过度的分泌CCL18已经证实会引起相关组织纤维化，并导致淋巴细胞、未成熟的树突细胞和单核粒细胞的聚集，引起多种慢性炎症和纤维化病变的产生。另外，在一些巨噬细胞渗透性的卵巢癌、胃癌和神经胶质瘤中也发现了持续性的 CCL18高量分泌。目前，对于CCL18的受体的研究还不完善，没有找到其相应的受体蛋白，因此CCL18信号的调控通路也仍然是一个有待研究的目标。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种物质在制备具有抑制肿瘤功能的产品中的应用。本发明提供的如下1)-5)中任一所述物质在制备具有抑制肿瘤功能的产品中的应用1)抑制所述蛋白和趋化因子CCL18共同介导的信号通路的物质；2)抑制所述蛋白介导的信号通路的物质；3)抑制所述蛋白的表达和/或活性的物质；4)抑制所述的编码基因的表达和/或活性的物质；5)抑制所述的编码基因介导的信号通路的物质。所述抑制肿瘤为抑制肿瘤细胞的迁移和/或扩散；所述肿瘤为乳腺癌；所述肿瘤细胞为MDA-MB-231。所述1)-5)中任一所述物质为SiRNA ；所述siRNA的核苷酸序列为序列表中的序列5。本发明的另一个目的是提供一种具有抑制肿瘤功能的产品。本发明提供的产品，其活性成分为如下1)-5)中任一所述物质1)抑制所述蛋白和趋化因子CCL18共同介导的信号通路的物质；2)抑制所述蛋白介导的信号通路的物质；3)抑制所述蛋白的表达和/或活性的物质；4)抑制所述的编码基因的表达和/或活性的物质；5)抑制所述的编码基因介导的信号通路的物质。所述1) ,2) ,3)、4)或5)所述的物质为siRNA ；所述siRNA的核苷酸序列为序列表中的序列5 ；所述抑制肿瘤为抑制肿瘤细胞的迁移和/或扩散；所述肿瘤为乳腺癌；
所述肿瘤细胞为MDA-MB-231 ；所述产品为药物。本发明的第三个目的是提供一种受体蛋白及其编码基因。本发明提供的蛋白，命名为CCR18，人工合成，是如下1)或2)的蛋白质1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；幻将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由1)衍生的蛋白质。序列2由974个氨基酸组成，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/ 或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。所述蛋白的编码基因也是本发明保护的范围。所述编码基因为1)、2)或3)1)序列表中序列1自5’末端第44922位核苷酸；2)与1)限定的DNA序列至少具有80%同源性且具有相同功能蛋白的DNA分子；3)在严格条件下与1)限定的DNA分子杂交且具有相同功能蛋白的DNA分子。所述严格条件也可为在6XSSC，0. 5% SDS的溶液中，在65 °C下杂交，然后用 2 XSSC,0. 1% SDS 和 1XSSC，0. 1% SDS 各洗膜一次。序列1由四25个核苷酸组成，其编码区为自5’末端第14922位核苷酸。含有所述编码基因的重组载体或转基因细胞系或重组菌也是本发明保护的范围。所述重组载体为将所述编码基因插入到pEGFP-Cl的BglII和Ml I酶切位点得到的载体。本发明的实验证明，本发明提供了一个CCL18的受体蛋白CCR18，它是一个具有六次跨膜结构域的膜蛋白，在乳腺癌细胞系中与CCL18共定位于细胞质膜，参与CCL18信号的传递和调控功能。CCL18通过与乳腺癌细胞膜上的CCR18蛋白结合，可以促进肿瘤细胞的上皮-间质细胞转化，增强其侵染活性，从而促使癌细胞转移的发生。CCL18通过与CCR18的结合使其发生磷酸化，进而把CCL18的信号传入细胞内，通过其下游的Pyk2等激酶的级联反应而引起细胞功能学的变化。CCR18是CCL18的受体(或者是协同受体)，发挥信号通路的作用，调控肿瘤细胞的转移活性。因此，可以通过抑制CCR18蛋白的活性制备抑制肿瘤细胞转移的药物，在医学及制药领域发挥重要作用，应用前景广阔。
图1为CCL18受体的蛋白质组学鉴定图2为CCL18-CCR18的细胞共定位图3为CCL18-CCR18在乳腺癌病理组织中的高表达分析图4为CCR18siRNA对CCR18基因在细胞内表达的抑制作用和此抑制作用对细胞形态影响的检测结果图5为干扰CCR18对CCL18刺激MDA-MB-231细胞迁移能力的抑制作用图6为干扰CCR18对CCL18刺激实验性乳腺癌细胞转移的阻断作用
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中所用引物及DNA序列均由上海hvitrogen公司合成。实施例1、CCL18受体蛋白CCR18的获得一、CCL18受体蛋白获得1、CCL18受体蛋白CCR18的发现及其质谱鉴定为了鉴定CCL18的受体蛋白，将乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞(购自ATCC，编号 HTB-26)与CCL18蛋白(购自Peprotech公司，产品号300-34)在4°C孵育3小时使CCL18 结合于细胞表面，收集细胞并用预冷的细胞裂解液(PBS含0. 5% Triton X-100)裂解，利用 CCL18特异的单抗将其通过免疫沉淀的方法富集，产物经SDS-PAGE分离。结果如图IA所示，A为免疫沉淀的SDS电泳图，其中，第一泳道为孵育前样品，第二泳道为孵育后样品，第三泳道为蛋白A/G树脂(购自Pierce公司，产品号20421)泳道，第四泳道为蛋白A/G树脂与CCL18孵育样品，第五泳道为蛋白A/G树脂与CCL18抗体孵育样品， 第六泳道为免疫沉淀孵育样品中加入SDS破坏相互作用后的样品，第七泳道为免疫沉淀孵育样品(蛋白A/G树脂+CCL18蛋白+CCL18抗体)；可以在考马斯亮蓝染色的胶上看到第七泳道得到特异的蛋白条带。将特异条带蛋白经胶内胰蛋白酶的水解，得到酶解的特异肽段，经液相色谱-质谱联动分析，结果如图IB所示，可以看出，鉴定该蛋白为CCL18的受体蛋白。再将同样的样品进行SDS-PAGE分离，并转移至硝酸纤维膜上，用脱脂牛奶封闭 1小时后，分别利用CCL18的特异性兔源抗体(购自P^rotech公司，产品号500-P108)和 CCR18的特异性羊源抗体(购自Santa Cruz公司，编号sc-68687)与膜在室温下孵育1小时后，再与辣根过氧化酶(HRP)标记的二抗(购自Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.，编号705-035-003)孵育45分钟，进行免疫印迹分析，结果如图IC所示，1_7分别对应图IA的1-7泳道，进一步证实该条带为CCL18的受体蛋白。表明在CCL18的刺激的下游信号通路中CCL18与该蛋白存在相互作用关系。由质谱分析并经蛋白序列数据库检索，可以得出该蛋白的氨基酸序列为序列2所示，该蛋白命名为CCR18。2、CCR18基因的获得人工合成序列1作为模板，应用引物ccrl8-f (上游引物)和ccrlS-i (下游引物)， 利用聚合酶链式反应技术(PCR)扩增。PCR采用LA Taq聚合酶(Takara公司)催化反应， 94°C热启动，退火温度为56°C，72°C延伸3分钟。反应结束后，将PCR扩增产物直接用BamHI和MlI内切酶(Takara公司)进行酶切反应，用UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒(Sangon公司)回收基因片段。将得到的基因片段用jM连接酶(Takara公司)与经过BglII和Ml I酶切得到的载体pEGFP-Cl (Clontech 公司)载体片段连接，将连接产物转化入大肠杆菌T0P10菌株感受态，筛选阳性克隆。抽提质粒后经DNA测序，该质粒含有PCR产物，该PCR产物具有序列表中的序列1自5’末端第 4-2922位核苷酸(不包括原始基因编码区的起始密码子和终止密码子，下同)，该PCR产物的基因命名为ccrlS，该基因的编码区为列表中的序列1自5’末端第11922位核苷酸，该基因编码的蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2，该蛋白为CCL18的受体蛋白CCR18。该质粒为将序列表中的序列1自5’末端第44922位核苷酸插入到pEGFP-Cl的BglII和MlI酶切位点间得到的载体，命名为pEGFP-Cl-ccrl8。引物 ccrl8-f :5，-AT GGA TCC GCC AAG GCG GGC CGT GCA-3 (5，端的保护碱基 AT 和BamHI酶切位点GGATCC)(序列3) ’引物 ccrl8-r :5，_GC GTC GAC GGG CAC CGA CTC GAA CTT-3 (5，端的保护碱基 GC 和MlI酶切位点GTCGAC)(序列4)二、CCR18在细胞和组织中定位的亚细胞定位1、检测CCR18在MDA-MB-231细胞中的定位情况MDA-MB-231细胞经饥饿处理10小时，加入CCL18蛋白于37°C孵育10分钟后，弃去孔中的培养基，用预冷的PBS缓冲液洗一遍。弃去溶液，迅速用新鲜配制的2%的甲醛 (溶解于PBS中)固定细胞5分钟，固定后用PBS缓冲液洗三遍，每次5分钟。对其中一个盖玻片用含有0.1% (体积百分含量)Triton X_100的PBS缓冲液处理2分钟使细胞膜穿孔以利于抗体进入细胞内，另一个则不处理。接下来，用(质量体积比)BSA(溶解于 TBST缓冲液)在25°C下封闭30分钟。用适当稀释的一抗(CCL18的特异性兔源抗体)在 25°C孵育细胞/盖玻片60分钟。力Π 100 μ 11 % BSA (溶解于TBST缓冲液)至盖玻片上以洗去非特异性结合的抗体，洗三次，每次5分钟。然后将带有FITC偶联的抗兔的二抗(购自 Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.产品号 711-095—152)力口在盖玻片上，室温孵育30分钟。重复上述步骤，而将一抗改为CCR18羊源抗体(购自Santa Cruz公司)， 二抗改为 DyLight 594 偶联的抗羊的二抗(购自 Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.产品号705-515-003)。用100 μ 1 PBS洗涤三次，每次5分钟。最后，在载玻片上加适量(5μ 1)的荧光抗淬灭封片剂，轻轻地将盖玻片盖下(生长细胞的一面朝下)，用指甲油封片。在DeltaVision荧光显微镜下观察染好的片子，拍照后应用SoftWorx软件进行去卷积处理。结果如图2所示(图中，绿色(第一列)和红色(第二列)分别表示CCL18和CCR18 的定位，合并表示将上述两种颜色通道合并的结果)，说明在CCL18的信号通路中，CCL18首先要与CCR18暴露在细胞膜外侧的区域相结合，进而激活下游通路。2、利用免疫组化检测CCR18在组织中的分布收集正常乳腺组织和乳腺癌组织样品(自中山大学附属第二医院获得，经患者同意。)进行免疫组化分析。首先进行冰冻切片4 8mm，25°C放置30分钟后，加入4°C丙酮固定10分钟，PBS洗3遍后用3% (体积百分含量)过氧化氢孵育5 10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。然后使用5%正常山羊血清(购自Abcam公司，产品号ab7481) (PBS 稀释)封闭，25°C孵育20分钟。倾去血清，滴加稀释后的一抗工作液(含有适当稀释浓度的CCR18的特异性羊源抗体的PBS缓冲液)，37°C孵育2小时或4°C过夜，PBS冲洗3遍后， 依次滴加适当比例稀释的生物素标记二抗(购自JacksonImmunoResearch Laboratories Inc.，编号705-065-003) (1 % BSA-PBS稀释)和辣根酶标记链霉卵白素(购自Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.，编号 200-032-211) (PBS 稀释)，均在 37°C下孵育 30 分钟后PBS冲洗3次。最后使用显色剂显色，再进行复染，封片，并使用电镜进行观察。结果如图3所示，左图CCR18在正常乳腺组织表达量极低(呈深兰色；箭头所指是正常乳腺管)，右图CCR18在乳腺癌组织中表达量高(呈褐色；箭头是导管原位癌细胞) (100倍)，从图中可以看出，CCR18在正常组织中表达量较低，在乳腺癌组织中表达量明显升高。实施例2、干扰CCR18对细胞形态的影响以及对CCL18刺激乳腺癌细胞转移的阻断作用1、检验CCR18siRNA抑制ccrl8基因表达的效果抑制CCR18 基因表达的 siRNA(CCR18siRNA)购自 Qiagen 公司(predesigned，产品号 SI140252，序列为序列 5 :5，-ccugccaacc cccggguuuu uuuu-3 ‘),序列针对 CCR18 基因序列1自5，末端1837-1852位碱基)。将乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞传代分入M孔板中，细胞密度大约为20%，置于细胞培养箱中培养生长。对小时后进行转染分别向3个已加入48μ1 Opti-MEM培养基 (Invitrogen公司)的印管中加入对照siRNA(购自hvitrogen公司，产品号12935-100)、 25nM CCR18 siRNA、50nM CCR18 siRNA ；另 3 个印管中加入 48 μ IOpti-MEM 培养基和 2 μ 1 Oligofectamine转染试剂Gnvitrogen公司)，轻轻混勻后静置5分钟。然后将六个试管中的溶液两两混合并静置20分钟后缓慢加入M孔板中的培养液中，转染后48小时分别得到 Scramble 组(含有对照 siRNA)、25nM CCR18 siRNA 组和 50nM CCR18 siRNA 组，分别取样，先用PBS缓冲液清洗，再加入100 μ 1样品缓冲液(由5Χ样品缓冲液250mM pH6. 8Tris, 10% SDS，50%甘油，0.02%溴酚蓝，10% β巯基乙醇稀释五倍得到)，之后用移液器小心取出，95°C煮样3分钟。制备好的样品应用CCR18的特异羊源抗体抗体，按照实施例1中所提供的方法进行免疫印迹分析。结果如图4A 所示，组相比，25nM CCR18 siRNA 组和 50nM CCR18siRNA 组的CCR18蛋白表达量的降低；表明CCR18 siRNA可以有效抑制ccrl8基因的表达。2、检测ccrl8基因的表达被抑制对细胞形态的影响将Scramble 组和 5OnM CCR18 siRNA 组分别再加入 10ng/ml (终浓度) CCL18刺激30分钟，然后立即使用新鲜配置的2%的甲醛固定10分钟，再用特异性的FITC-Phal Ioidin(购自Cell Signaling公司)和DAPI进行荧光染色，分别得到 Scramble+CCL 18 组和 CCR18siRNA+CCL18 组，检测 F-actin (绿色)及 DNA 的染色以及 CCL18 对MDA-MB-231细胞形态学的影响。以不加入CCL18的kramble siRNA (Scramble)组为对眧。结果如图4B所示，从图中看出，与Scramble组相比，Scramble+CCL 18组和 CCR18siRNA+CCL18组在CCL18刺激下使MDA-MB-231细胞形态学改变为梭形，看出， MDA-MB-231细胞的CCR18在SiRNA的抑制下不响应CCL18的刺激作用。3、检测ccrlS基因的表达被抑制乳腺癌细胞转移的影响将MDA-MB-231细胞传代至M孔板中的4个孔内(含有载玻片)，24小时后根据 Invitrogen公司的Oligofectamine试剂盒操作指南将50nM终浓度的CCR18siRNA转染到其中的两孔细胞内，转染36小时后将四个孔的细胞培养基同时换成不含血清的DMEM进行饥饿处理，分别得到两个control组(不加入CCR18siRNA)和两个CCR18siRNA组(加入 CCRlSsiRNA)。10小时后，用细胞刮器对上述四组的细胞进行划痕损伤处理，利用相差显微镜记录细胞划痕情况，记作Oh ；同时将上述四组进行如下处理，得到四个小组control+CCL18-继续培养 12h ；
control+CCL18+ 加入CCL18刺激，使CCL18在孔内的终浓度为10ng/ml，继续培养 12h;CCR18siRNA+CCL18-继续培养 12CCR18siRNA+CCL18+ 加入CCL18刺激，使CCL18在孔内的终浓度为10ng/ml，继续培养1 ；记录划痕恢复情况，记作12h。结果如图5所示，从图中看出，在没有敲除CCR18(不加入CCR18siRNA ；对照)的情况下，CCL18的加入(CCL18+)能促进细胞的迁移活性，而当使用siRNA敲除CCR18 (加入 CCR18siRNA ；Si_CCR18)后，能够有效抑制CCL18对细胞迁移活性的促进能力。可见CCL18 能显著促进乳腺癌细胞的迁移能力；而这种促进能力在CCR18的表达受抑制后显著的降低。4、检测CCR18对CCL18刺激实验性乳腺癌转移的作用。免疫缺陷小鼠(雌性，BALB/c-nu/nu nude mice，4-6周龄，购自 JacksonLaboratory，产品目录号002019。该小鼠缺胸腺，故对其他物种的蛋白无排斥反应。)通过尾静脉注射稳定表达Luciferase的乳腺癌MDA-MB-231细胞OxlO5 ；注射的成功可通过生物发光检测仪IVIS Imaging System来检测)。具体分为两组处理，每组6只小鼠，实验重复三次对照组将MDA-MB-231注射在免疫缺陷小鼠中；沉默组将MDA-MB-231和终浓度50nM的CCR18siRNA注射在免疫缺陷小鼠中；饲养2周后造模成功，肿瘤区域在生物发光成像仪中清晰可见(见图6)。第三周开始，分别向沉默组和对照组静脉注射CCL18 (IOOng/天)，接种4周(即开始建模的第四周)后观察。药物对肿瘤的治疗效果通过每隔一日的生物发光成像仪确定。结果如图6所示，可以看出免疫缺陷小鼠通过尾静脉注射稳定表达Luciferase的乳腺癌MDA-MB-231细胞后两周观察，建模成功；第三周开始，静脉注射CCL18 (IOOng/天)， 接种4周后，对照组的肿瘤细胞扩散转移，但CCR18基因沉默的MDA-MB-231细胞扩散转移受到抑制。表明，CCR18基因与乳腺癌细胞的转移有关，沉默CCR18基因可以抑制乳腺癌细胞的扩散。
权利要求
1.如下1)-5)中任一所述物质在制备具有抑制肿瘤功能的产品中的应用1)抑制蛋白和趋化因子CCL18共同介导的信号通路的物质；2)抑制所述蛋白介导的信号通路的物质；3)抑制所述蛋白的表达和/或活性的物质；4)抑制编码基因的表达和/或活性的物质；5)抑制所述编码基因介导的信号通路的物质； 所述蛋白的氨基酸序列为序列表中序列2 ；所述编码基因为序列1自5’末端第41922位核苷酸。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于 所述抑制肿瘤为抑制肿瘤细胞的迁移和/或扩散； 所述肿瘤为乳腺癌；所述肿瘤细胞为MDA-MB-231。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于 所述1)-5)中任一所述物质为siRNA ；所述siRNA的核苷酸序列为序列表中的序列5。
4.一种具有抑制肿瘤功能的产品，其活性成分为如下1)-5)中任一所述物质1)抑制蛋白和趋化因子CCL18共同介导的信号通路的物质；2)抑制所述蛋白介导的信号通路的物质；3)抑制所述蛋白的表达和/或活性的物质；4)抑制编码基因的表达和/或活性的物质；5)抑制所述编码基因介导的信号通路的物质； 所述蛋白的氨基酸序列为序列表中序列2 ；所述编码基因为序列1自5’末端第41922位核苷酸。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于 所述1) >2) ,3)、4)或幻所述的物质为siRNA ； 所述siRNA的核苷酸序列为序列表中的序列5 ； 所述抑制肿瘤为抑制肿瘤细胞的迁移和/或扩散； 所述肿瘤为乳腺癌；所述肿瘤细胞为MDA-MB-231 ； 所述产品为药物。
6.一种蛋白，是如下1)或幻的蛋白质1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列表中序列2氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由1)衍生的蛋白质。
7.权利要求6所述蛋白的编码基因。
8.根据权利要求7所述的编码基因，其特征在于所述编码基因为1)、幻或3)1)序列1自5’末端第44922位核苷酸；2)与1)限定的DNA序列至少具有80%同源性且具有相同功能蛋白的DNA分子；3)在严格条件下与1)限定的DNA分子杂交且具有相同功能蛋白的DNA分子。
9.含有权利要求7或8所述编码基因的重组载体或转基因细胞系或重组菌。
10.根据权利要求9所述的重组载体，其特征在于所述重组载体为将权利要求7或8 所述编码基因插入到PEGFP-Cl的多克隆位点得到的载体。
全文摘要
本发明公开了一种受体蛋白及其编码基因与应用。本发明提供的蛋白，是如下1)或2)的蛋白质1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列表中序列2氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由1)衍生的蛋白质。所述蛋白在抑制癌细胞迁移和/或扩散中的应用；或所述的编码基因在抑制癌细胞迁移和/或扩散中的应用。本发明的实验证明，本发明提供了一个CCL18的受体蛋白CCR18，通过抑制CCR18蛋白的活性制备抑制肿瘤细胞转移的药物，在医学及制药领域发挥重要作用，应用前景广阔。
文档编号C07K14/00GK102475890SQ20101056539
公开日2012年5月30日 申请日期2010年11月30日 优先权日2010年11月30日
发明者丁霞, 姚雪彪, 宋尔卫, 王冬梅, 王峰松, 窦震, 邓辉, 陈静琦 申请人:中国科学技术大学