专利名称：一种水稻乙烯受体类蛋白及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物乙烯受体类蛋白及其编码基因与应用，特别是来源于水稻的乙烯受体类蛋白及其编码基因与应用。
背景技术：
干旱、盐碱、冷害、冻害、水涝等非生物逆境胁迫因素以及生物因素如病虫害，对植物的生长发育具有重要影响，严重时会造成农作物大规模减产，培育耐逆性作物是种植业的主要目标之一。提高作物的耐逆性，除了利用传统的育种方法，目前，分子遗传育种已经成为科技工作者所关注的领域之一。在非生物和生物逆境的胁迫下，高等植物细胞有多种途径感受和应答外界环境中物化参数的变化，将胞外的信号变为胞内信号，经过一系列磷酸化级联反应将信号传递到细胞核，经转录因子调控相关的功能基因，启动逆境应答基因的表达，提高植物的耐逆性。已经证实，植物中应答非生物和生物逆境胁迫的信号传递途径之一与乙烯相关。
水稻作为最重要的粮食作物之一，阐明其应答非生物和生物逆境的乙烯相关途径的信号传递，进而改善其耐逆性，具有重要的理论及现实意义。
发明内容
本发明的目的是提供与植物耐逆特性相关的一种乙烯类受体蛋白及其编码基因。
本发明所提供的耐逆性乙烯类受体蛋白来源于水稻，名称为OsPK1，是具有序列表中序列2氨基酸残基序列的一类蛋白质，或者是将序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序列2的氨基酸残基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白质。
序列表中序列2蛋白质序列由763氨基酸残基组成，含有保守的GAF结构域序列、激酶结构域序列和接受器结构域序列。GAF结构域序列为序列2中自氮端到碳端第190-349位氨基酸残基；激酶结构域序列为自氮端到碳端第375-615位氨基酸残基；接受器结构域序列为自氮端到碳端第640-756位氨基酸残基。
耐逆相关乙烯受体类蛋白OsPK1的编码基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)与序列表中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
序列表中序列1的DNA序列由2292个碱基组成，该基因的读码框为全长DNA序列，其表达主要受伤害及高盐的诱导。
利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明所提供的编码乙烯受体类蛋白的基因导入植物细胞，可获得对干旱和高盐等非生物逆境以及病虫害等生物逆境胁迫耐受力得到增强的转基因细胞系及转基因植株。本发明的基因在构建到植物表达载体中时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入植物可选择性标记(GUS基因、萤光素酶基因等)或具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素，卡那霉素等)。携带有本发明OsPK1基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如水稻、小麦、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜宿等。本发明的基因对培育抗逆植物品种，特别是培育耐非生物及生物胁迫如耐盐、抗病虫害植物品种，提高农作物产量具有重要意义。
下面结合附图及具体实施例对本发明做进一步说明。
图1、OsPK1与其它乙烯受体类蛋白基因的相似性比较。
图2、OsPK1的蛋白质结构模式。
图3、OsPK1转录受伤害和高盐胁迫诱导的RT-PCR分析结果。
具体实施例方式
实施例1、水稻耐逆相关乙烯受体类蛋白OsPK1的筛选及其cDNA的克隆以已知的烟草耐逆相关乙烯受体类蛋白基因NTHK1的氨基酸保守序列在水稻基因库中进行BLAST检索，得到的reads片段，经过拼接，得到耐逆相关乙烯受体类蛋白基因。
水稻(Oryza sativa var.Lansheng)种子种在培养皿中在培养室中生长至两叶一心期时进行逆境胁迫处理后取样。收集新鲜叶片1g在液氮中研碎，悬于4mol/L硫氢酸胍中，混合物用酸性苯酚、氯仿抽提，上清中加入无水乙醇沉淀总RNA，之后，溶于水。将RNA用逆转录酶合成cDNA。根据上述拼接基因的序列设计引物，经PCR扩增，得到OsPK1。
将OsPK1进行序列分析，和数据库中得到的序列相同，如图1所示，具有与乙烯受体类蛋白NTHK1，NTHK2等相似的保守区域。如图2所示，根据核苷酸序列推断的氨基酸序列画出蛋白质结构。
实施例2、水稻OsPK1活性与环境胁迫的关系水稻(Oryza sativa var.Lansheng)种子种在培养皿中在培养室中生长至两叶一心期时进行下述各种胁迫处理伤害处理将水稻苗剪切成1cm长，放入水中振荡。
盐处理将水稻苗移入1％NaCl溶液中。
旱处理将水稻苗移入20％PEG 6000溶液中。
分别在各种处理后0、0.5、1、3、8小时(伤害处理)；0、3、8、24、48小时(盐处理)；0、2、4、24小时(旱处理)取样。收集新鲜叶片1g在液氮中研碎，悬于4mol/L硫氢酸胍中，混合物用酸性苯酚、氯仿抽提，上清中加入无水乙醇沉淀总RNA，之后，溶于水，得到总RNA。以OsPK1 DNA部分序列为引物进行RT-PCR分析。部分结果如图3所示，图中A为伤害处理；B为1％NaCl处理，分析表明，OsPK1受伤害和高盐诱导，但不受干旱诱导。
序列表<160>2<210>1<211>2292<212>DNA<213>水稻(Oryza sativa var.Lansheng)<400>1atgccaccga tcccatctct gtggatccgc gtcttcttct cctggctgct gctgtcgctg 60cccgccgcgg ctgccgccga tttcagccac tgcggcggct gcgacgacgg cgacggcggc 120ggcggcatat ggagcacgga caacatcctg caatgccaga gggtgagcga cttcctcatc 180gccatggcct acttctccat cccgctcgag ctgctctact tcgccacctg ctccgacctc 240ttcccgctca agtggatcgt cctgcagttc ggcgccttca tcgtgctctg cggcctcacc 300cacctcatca ccatgttcac ctacgagccg cactcgttcc acgtcgtgct cgcgctcacc 360gtcgccaagt tcctgaccgc cctggtgtcg ttcgccaccg cgatcacgct gctcacgctc 420ataccgcagc tgctcagggt caaggtcagg gagaacttcc tcaggatcaa ggcgcgggag 480ctggaccggg aggtggggat gatgaagagg caagaggaag cgagttggca cgtgcggatg 540ctcacgcacg agatccgcaa gtcgctcgat cgccacacga tcctgtacac caccatggtt 600gagctctcca agacgctcga gctgcagaac tgcgccgtct ggatgcctag cgagagcggg 660agcgagatga tcctgacaca tcagctgagg cagatggaga cggaggactc gaatagcctg 720tccattgcga tggacaaccc ggatgtactt gaaataaagg caacaaagga tgcaaaagtt 780ctcgcggcag actcagcgct tgggattgca agcagaggca agcttgaagc aggtcctgtt 840gctgcaatac ggatgccgat gttgaaggcg tcgaatttca aaggagggac tccagaagtg 900atggaaacaa gctatgctat tttggtcttg gtactacccg aggatggttc actaggatgg 960ggtgaagagg agttggagat tgttgaagtg gttgctgatc aagtcgcagt cgccctatca 1020catgctgcag ttctggagga atctcaattg atgcgagaga agctcgccgc gcaacacagg 1080gacttgctga gagcaaagca tgaaaccacg atggccactg aagctaggaa ctcctttcag 1140actgccatgt atgatggaat gcgacggcca atgcactcga tccttggtct agtctcaatg 1200atgcagcaag aaaatatgaa ccctgagcaa aggcttgtaa tggatgccat tgtcaagaca 1260agtagcgttg cgtcaacatt gatgaatgat gtcatgcaaa catcaaccgt aaatcgtgag 1320tatttgtctt tggtgaggag ggcattcaac cttcattcgt tggttaagga ggcaatcagt 1380gttgtaagat gcctaactgg ctgcaagggg attgattttg agtttgaagt ggataattct 1440ttgcccgaaa gggtcgtcgg tgatgagaag agggttttcc acatcgtcct gcacatggta 1500ggtactctaa tacagaggtg taatgcaggc tgtctatcct tgtatgcgaa tacttacaat 1560gagaaggaag agaggcacaa tcaggattgg atgctgcgaa gagcaaactt ctctggcagc 1620tatgtgtgtg ttaagtttga gattaggatt agagagtcca gaggtaatct tttgagttcg 1680tcatccagtc ggagacttca agggcccaac tctaccagtt ctgagatggg gcttagcttc 1740aacatgtgca agaaaattgt gcagatgatg aatggtaata tttggtcagt ctctgattca 1800aaaggccttg gagaaactat catgcttgcc cttcagttcc agctgcagca tgtgactccg 1860gtctctggag catcctcgga cttgttccga tcagcgccaa ttcccaattt taatggactc 1920caagtcattc ttgtggacag tgatgacacc aatcgggccg taactcacaa gctcctggag 1980aagcttggtt gcctagtcct ctcggttact tccggcatcc aatgcatcaa ctcctttgcc 2040agtgctgagt catctttcca gctggtggtt cttgacctca ccatgcgtac aatggatgga 2100tttgatgtag ctcttgcaat caggaagttc agggggaatt gttggccacc gttgatagtt 2160gctcttgcgg caagcaccga tgacaccgtt cgggatcggt gccagcaggc aggaataaac 2220ggtctgatcc aaaaaccagt cactttagca gcactgggag atgaactgta tagagtcctt 2280caaaacaatt ga2292<210>2<211>763<212>PRT<213>水稻(Oryza sativa var.Lansheng)<400>2Met Pro Pro Ile Pro Ser Leu Trp Ile Arg Val Phe Phe Ser Trp1 5 10 15Leu Leu Leu Ser Leu Pro Ala Ala Ala Ala Ala Asp Phe Ser His20 25 30Cys Gly Gly Cys Asp Asp Gly Asp Gly Gly Gly Gly Ile Trp Ser35 40 45Thr Asp Asn Ile Leu Gln Cys Gln Arg Val Ser Asp Phe Leu Ile50 55 60Ala Met Ala Tyr Phe Ser Ile Pro Leu Glu Leu Leu Tyr Phe Ala65 70 75Thr Cys Ser Asp Leu Phe Pro Leu Lys Trp Ile Val Leu Gln Phe80 85 90Gly Ala Phe Ile Val Leu Cys Gly Leu Thr His Leu Ile Thr Met95 100105Phe Thr Tyr Glu Pro His Ser Phe His Val Val Leu Ala Leu Thr110 115120Val Ala Lys Phe Leu Thr Ala Leu Val Ser Phe Ala Thr Ala Ile
125 130135Thr Leu Leu Thr Leu Ile Pro Gln Leu Leu Arg Val Lys Val Arg140 145150Glu Asn Phe Leu Arg Ile Lys Ala Arg Glu Leu Asp Arg Glu Val155 160165Gly Met Met Lys Arg Gln Glu Glu Ala Ser Trp His Val Arg Met170 175180Leu Thr His Glu Ile Arg Lys Ser Leu Asp Arg His Thr Ile Leu185 190195Tyr Thr Thr Met Val Glu Leu Ser Lys Thr Leu Glu Leu Gln Asn200 205210Cys Ala Val Trp Met Pro Ser Glu Ser Gly Ser Glu Met Ile Leu215 220225Thr His Gln Leu Arg Gln Met Glu Thr Glu Asp Ser Asn Ser Leu230 235240Ser Ile Ala Met Asp Asn Pro Asp Val Leu Glu Ile Lys Ala Thr245 250255Lys Asp Ala Lys Val Leu Ala Ala Asp Ser Ala Leu Gly Ile Ala260 265270Ser Arg Gly Lys Leu Glu Ala Gly Pro Val Ala Ala Ile Arg Met275 280285Pro Met Leu Lys Ala Ser Asn Phe Lys Gly Gly Thr Pro Glu Val290 295300Met Glu Thr Ser Tyr Ala Ile Leu Val Leu Val Leu Pro Glu Asp305 310315Gly Ser Leu Gly Trp Gly Glu Glu Glu Leu Glu Ile Val Glu Val320 325330Val Ala Asp Gln Val Ala Val Ala Leu Ser His Ala Ala Val Leu335 340345Glu Glu Ser Gln Leu Met Arg Glu Lys Leu Ala Ala Gln His Arg350 355360Asp Leu Leu Arg Ala Lys His Glu Thr Thr Met Ala Thr Glu Ala365 370375Arg Asn Ser Phe Gln Thr Ala Met Tyr Asp Gly Met Arg Arg Pro380 385390Met His Ser Ile Leu Gly Leu Val Ser Met Met Gln Gln Glu Asn395 400405Met Asn Pro Glu Gln Arg Leu Val Met Asp Ala Ile Val Lys Thr410 415420Ser Ser Val Ala Ser Thr Leu Met Asn Asp Val Met Gln Thr Ser425 430435Thr Val Asn Arg Glu Tyr Leu Ser Leu Val Arg Arg Ala Phe Asn440 445450Leu His Ser Leu Val Lys Glu Ala Ile Ser Val Val Arg Cys Leu455 460465Thr Gly Cys Lys Gly Ile Asp Phe Glu Phe Glu Val Asp Asn Ser470 475480Leu Pro Glu Arg Val Val Gly Asp Glu Lys Arg Val Phe His Ile485 490495Val Leu His Met Val Gly Thr Leu Ile Gln Arg Cys Asn Ala Gly500 505510Cys Leu Ser Leu Tyr Val Asn Thr Tyr Asn Glu Lys Glu Glu Arg515 520525His Asn Gln Asp Trp Met Leu Arg Arg Ala Asn Phe Ser Gly Ser530 535540Tyr Val Cys Val Lys Phe Glu Ile Arg Ile Arg Glu Ser Arg Gly545 550555Asn Leu Leu Ser Ser Ser Ser Ser Arg Arg Leu Gln Gly Pro Asn560 565570Ser Thr Ser Ser Glu Met Gly Leu Ser Phe Asn Met Cys Lys Lys575 580585Ile Val Gln Met Met Asn Gly Asn Ile Trp Ser Val Ser Asp Ser590 595600Lys Gly Leu Gly Glu Thr Ile Met Leu Ala Leu Gln Phe Gln Leu605 610615Gln His Val Thr Pro Val Ser Gly Ala Ser Ser Asp Leu Phe Arg620 625630Ser Ala Pro Ile Pro Tyr Phe Asn Gly Leu Gln Val Ile Leu Val635 640645Asp Ser Asp Asp Thr Asn Arg Ala Val Thr His Lys Leu Leu Glu
650 655660Lys Leu Gly Cys Leu Val Leu Ser Val Thr Ser Gly Ile Gln Cys665 670675Ile Asn Ser Phe Ala Ser Ala Glu Ser Ser Phe Gln Leu Val Val680 685690Leu Asp Leu Thr Met Arg Thr Met Asp Gly Phe Asp Val Ala Leu695 700705Ala Ile Arg Glu Phe Arg Gly Asn Cys Trp Pro Pro Leu Ile Val710 715720Ala Leu Ala Ala Ser Thr Asp Asp Thr Val Arg Asp Arg Cys Gln725 730735Gln Ala Gly Ile Asn Gly Leu Ile Gln Lys Pro Val Thr Leu Ala740 745750Ala Leu Gly Asp Glu Leu Tyr Arg Val Leu Gln Asn Asn755 760 76权利要求
1.耐逆相关乙烯受体蛋白质OsPK1，是具有序列表中序列2氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序列2的氨基酸残基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的乙烯受体蛋白质，其特征在于它是具有序列表中序列2氨基酸残基序列的蛋白质。
3.根据权利要求2所述的乙烯受体蛋白质，其特征在于所述序列2中自氮端到碳端第375-615位氨基酸残基是激酶功能保守域。
4.耐逆相关乙烯受体蛋白质OsPK1的编码基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)与序列表中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
5.根据权利要求4所述的基因，其特征在于所述乙烯受体蛋白质OsPK1的编码基因是序列表中序列1的DNA序列。
6.根据权利要求5所述的基因，其特征在于该基因的读码框为自3’端第1到第2292位碱基。
7.含有权利要求4所述基因的表达载体。
8.含有权利要求4所述基因的细胞系。
9.权利要求4所述基因在培育耐逆植物品种中的应用。
全文摘要
本发明公开了来源于水稻的耐逆相关乙烯受体蛋白质及其编码基因与应用，目的是提供具有较强抗逆特性的乙烯受体蛋白质及其编码基因。本发明所提供的抗逆相关乙烯受体蛋白质名称为OsPK1，是具有序列表中序列2氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序列2的氨基酸残基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白质。抗逆相关乙烯受体蛋白质OsPK1的编码基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)与序列表中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。本发明的基因对培育耐非生物及生物胁迫植物品种，特别是培育耐盐、抗病虫害植物品种，提高农作物产量具有重要意义。
文档编号C07H21/00GK1488642SQ0213115
公开日2004年4月14日 申请日期2002年10月11日 优先权日2002年10月11日
发明者张劲松, 陈受宜, 曹宛虹, 董亿 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所