专利名称：一个控制植物根系发育的基因及其编码产物与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一个控制植物根系发育的基因及其编码产物与应用，特别是涉及一个与水稻根系发育有关的基因及其编码产物与应用背景技术农作物的生长与发育都需要依赖根系从土壤中吸收水分和无机盐养分。因此，根的发育对于农作物的产量起着至关重要的作用。水稻的根系，可根据它们发生的位置和发育阶段分为两类，一类是胚生根，一类是胚后发育的根。胚生根由胚根萌发后发育而来，它有两种形式，一条初生根和几条种子根。胚后发育的根，也有两种类型，一类是从植株茎节产生的不定根，另一类是在所有类型根上，都产生的侧生根。
植物中很多基因受生长素的调控，例如AUX/IAA家族，SAUR(small auxinup-regulated RNA)家族和GH3家族(Hagen et al.，1984，Planta 162，147-153；McClureet al.，1989，Science 243，91-93；Abel and Theologis，1996，Proc Natl Acad SciUSA.91326-30)。这些家族中的有些成员除了可以被生长素专一诱导外还受其它激素如激动素、乙烯和环境因子如重金属离子、高温所诱导(Gray et al.，1998，Nature，414，271-276)。很多受生长素调控的基因的启动子序列中都有一段共同序列—生长素反应元件AuRE(Auxin Response Element)5’-TGTCTC-3’，这个序列被证实是生长素反应因子ARF(auxin response factor)结合所必需的(Guilfoyle et al.，1998，PlantPhysiol.118，341-347；Liu et al.，1994，Plant Cell.6，645-57；Ulmasov etal.，1999，Plant J 19，309-319)。很多被生长素诱导的基因参与调控根的生长发育。例如受生长素快速诱导的AUX/IAA基因家族成员SHY2/IAA3、SLR1/IAA14、IAA28、MSG2/IAA19等，如果它们发生突变都会导致侧生根减少或缺失(Reed 2001，Trends PlantSci.6，420-425)。相反有些基因如AUX1、TIR1或者MAC1，它们的超表达则会促进侧生根的形成(Marchant et al.，2002，Plant Cell.14，589-597.；Gray et al.，1999，Genes Dev.3，1678-1691；Xie et al.，2000，Genes Dev.14，3024-3036)。虽然生长素的信号转导途径在双子叶和单子叶植物中具有较高的保守性，但与双子叶植物相比，单子叶植物根发育调控机理的研究相对滞后。尽管在玉米中有与根发育相关的突变体(Hetz et al.，1996，Plant J.10，845-857)，但遗憾的是这些突变体相对应的基因并没有克隆出来。而在水稻中，和根发育相关的基因研究则更少。
发明内容
本发明的目的是提供一种与水稻根系发育有关的基因及其编码产物。
一种与水稻根系发育有关的基因OsRAA1(Oryza sativa Root ArchitectureAssociated 1)，它是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)与序列表中序列1限定的DNA序列具有80％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
一种由上述基因OsRAA1编码的蛋白质，具有序列表中序列2的氨基酸残基序列或将序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序列2的氨基酸残基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白质。
本发明序列1的DNA序列由330碱基组成，编码序列表中由109个氨基酸残基组成的蛋白质序列2。
含有本发明基因OsRAA1的表达载体及细胞系也在本发明的保护范围之内。将序列1基因的cDNA构建在Ubiqutin启动子下游，得到表达载体(其图谱如图1所示)，利用电激等方法即会得到含有该表达载体的农杆菌菌株。
利用Northern杂交、RNA原位杂交、报告基因的组化染色等技术，分析了本发明基因的表达模式。借助农杆菌介导的转化，分析了该基因在组成型超表达时对植株根系发育的影响。研究结果表明，本发明与水稻根系发育有关的基因在根尖细胞表达，尤其在根尖分生组织的皮层和中柱鞘有很强表达，同时OsRAA1的转录物在侧根中也有分布。Northern杂交表明该基因可被生长素诱导表达，转基因植物表型分析发现该基因控制水稻根系的生长发育，对于培养优良的作物品种特别是水稻品种具有重要的理论及实际意义。
图1为Ubii∷OsRAA1的构建图谱。
图2为对照和转基因植株根系的比较。
具体实施例方式
在本发明的下述实施例中，所用的实验材料均为粳稻中花10号(Oryza sativa L.cvZhonghua 10)和粳稻中花11号(Oryza sativa L.cv Zhonghua 11)。
实施例1、与水稻根系发育有关基因序列的克隆利用RNA提取分离试剂盒(Trizol GibcoBRL)分离水稻根中总RNA，其具体方法是收集水稻材料100mg，立即置于液氮中研磨，加入1ml Trizol试剂，充分混匀；室温放置5min；加入0.2ml新鲜氯仿，剧烈振摇15s，室温温育3min；4℃，12000g离心15min；上清水相转移到一个新的1.5ml离心管中，加入0.5ml异丙醇沉淀RNA；RNA沉淀用1ml75％乙醇洗涤后溶于适量DEPC处理过的水中，-70℃保存备用。
根据生物信息学提供的序列资料设计以下引物5’端引物T GCACTG CAGAGT TTG AGA GAG ATC TAA GAG ATG，(其中划线序列为Pst I位点)；3’端引物ATGCGGA TCCAAT TTA GGC GTC GAC GAC GCG GAA G，(其中划线序列为BamH I位点)。
通过RT-PCR扩增得到OsRAA1的cDNA序列，具体方法是依据Plant RT-PCR Kit2.01(TaKaRa，Japan)的用户手册进行。1-2μg总RNA(大约1-2μl)，和Kit的各种反转录试剂混合(MgCl24μl；10×RNA PCR Buffer 2μl；RNase Inhibitor 0.5μl；RNasefree Water 8.5μl； dNTP Mixture 2μl；Reverse Transcriptase 1μl；OligodT-Adaptor 1μl)。混匀后，42℃ 30min；99℃ 5min；5℃ 5min，完成反转录反应。吸取2μl反转录产物，作为模板进行PCR反应94℃ 2min后进入扩增程序94℃ 1min、62℃ 1min、72℃ 1min，30个循环后，72℃ 7min。扩增得到的OsRAA1cDNA序列自起始密码子到终止密码子总长330碱基，编码109个氨基酸，推测分子量12kD，等电点9.45。
实施例2、OsRAA1基因的表达模式Northern杂交表明OsRAA1 mRNA在水稻根和穗状花序中特异表达，在幼茎和幼叶中没有信号。
利用地高辛标记反义RNA为探针进行组织原位杂交实验，结果表明OsRAA1基因在根尖细胞表达，而且在根尖分生组织的皮层和根尖中柱鞘有很强表达，相反，在成熟区的皮层没有明显可检测杂交信号，同时OsRAA1的转录物也存在于侧根。
用OsRAA1启动子驱动的β-葡糖醛酸苷酶报告基因(GUS)植物转化载体，利用农杆菌侵染的方法转化水稻，发现转基因植物根的GUS染色阳性部位与前面原位杂交结果相同。
1、Northern杂交将各种材料的总RNA分别测定浓度后，取等量的各个样品在0.7％的琼脂糖凝胶上进行电泳至溴酚蓝迁移到凝胶的2/3处，将凝胶转移至一个培养皿内，用灭菌的DEPC水淋洗3-4次，浸泡于数倍体积的20×SSC中，温和摇动45min；通过毛吸作用转移24小时，使RNA带吸附在尼龙膜上，120℃烤膜30分钟。将尼龙膜放入杂交管，经65℃预杂交2-3hr后，加入经纯化、变性的32P-标记的OsRAA1探针，65℃杂交过夜(17小时以上)，倒出杂交液，用2×SSC+0.1％SDS和1×SSC+0.1％SDS，65℃，各洗膜10min；用保鲜膜包裹尼龙膜后，用X-光胶片进行放射自显影；-80℃曝光3-7天后，按常规洗片，显示杂交带的位置。
2、原位杂交
利用DIG T7/SP6 Labeling kit(Roche)，通过体外转录的方法标记OsRAA1 mRNA的正义和反义探针。
水稻组织的石蜡切片材料经FAA固定后分别经系列乙醇脱水30min；再经过系列二甲苯-乙醇的混合物透明、浸蜡、包埋后，制备7μm厚切片，粘附于没有RNase污染的载玻片上。将粘好材料的片子分别经过100％二甲苯2×20min、以及2/3二甲苯-1/3乙醇、1/3二甲苯-2/3乙醇、100％、100％、90％、70％、50％、30％、10％乙醇、ddH2O、ddH2O，每步2min；转入37℃预热的，含1-5μg/ml蛋白酶K(Roche)的蛋白酶K buffer中，37℃处理30min；用DEPC处理后灭活的dd H2O洗3次；将片子放入刚刚混合好的乙酰化溶液(0.25％乙酸酐(Sigma)、100mM pH8.0的三乙醇胺(Sigma))中，5min；2×SSC处理2×5min；10％、30％、50％、70％、90％、100％、100％乙醇每步处理2min；42℃晾干片子，每张载玻片上加100-200μl杂交液，用parafilm膜轻轻覆盖，在42℃湿室中杂交过夜；4×SSC漂洗4×5-10min；转入37℃预热的，含25μg/ml RNase A(Sigma)的RNase buffer(500mM NaCl、1mM EDTA、10mM Tris-HCl pH7.5)中，37℃处理30min；RNase buffer 37℃漂洗3×15min；800ml 2×SSC漂洗2×30min；800ml 0.1×SSC漂洗30min；转入1×PBT，平衡5min；1/20×Blocking solution(用1×PBT稀释)封闭30-60min；1×PBT，平衡1min；加入Antibody(Roche)solution，在湿室中放置30-120min；250ml 1×PBT，漂洗2×20min；换成TNM50室温平衡5min；在载玻片上加显色液(BCIP∶NBT∶稀释液＝1∶1∶50)，暗中显色；显色合适后，如前所述梯度脱水；然后依次1/3二甲苯-2/3乙醇、2/3二甲苯-1/3乙醇、100％二甲苯、100％二甲苯每步1-2min透明；封片观察。
实施例4、OsRAA1基因的超表达表型观察水稻OsRAA1基因正义及反义RNA植物表达载体的构建将测序验证的RT-pCR片段用Pst I和BamH I酶解后连接到pBlueSK质粒上，再用Kpn I和SacI切下目的片段，连接到pUN1301质粒的Kpn I和Sac I位点之间，构建成为由玉米泛素蛋白启动子驱动的OsRAA1正义植物表达载体。通过农杆菌转化水稻，得到转基因种子。转基因水稻的种子，经表面消毒后，放置在含有50mg/l潮霉素的1/2 MS培养基上培养(将所有的NO3-离子，用NH4+取代，造成Cl-比正常1/2 MS有所增加，为了增加培养基透明度，凝水剂为Gerite(Sigma)。10小时光照，14小时黑暗。
9天后统计不定根数目，结果如图2所示，其中A是萌发12天幼苗根系，B是抽穗后根系，图A和图B中，位于右侧的是转基因植物，位于左侧的是相同栽培条件下的对照。从图中可以看出，转基因植物比对照植物有更多的不定根，每棵转基因植物平均比对照多两条以上的根，而且转基因植物的根比对照约长0.5cm。
序列表<160>2<210>1<211>330<212>DNA<213>稻属水稻(Oryza sativa)<400>1atgtcagggg tttgggtgtt caagaacggg gtggtgagat tggtggagaa50gcagcaggcg acggcgggga cggcggtggc gggagggagg aggaaggcgc100tggtgcacac gccgagcggg caggtggtgt cgtcgtacgc ggcgctggag150gcgcggctga cggcgctcgg gtgggagcgc tactacgagg acccctccct200cttccagttc cacaagcgtg gctccctcga cctcatctcc ctccccgccg250acttctccgc cttctcctcc gtccacatgt acgacatcgt cgtcaagaac300cgcgactcct tccgcgtcgt cgacgcctaa 330<210>2<211>109<212>PRT<213>稻属水稻(Oryza sativa)<400>2Met Ser Gly Val Trp Val Phe Lys Asn Gly Val Val Arg Leu Val15 10 15Glu Lys Gln Gln Ala Thr Ala Gly Thr Ala Val Ala Gly Gly Arg20 25 30Arg Lys Ala Leu Val His Thr Pro Ser Gly Gln Val Val Ser Ser35 40 45Tyr Ala Ala Leu Glu Ala Arg Leu Thr Ala Leu Gly Trp Glu Arg50 55 60Tyr Tyr Glu Asp Pro Ser Leu Phe Gln Phe His Lys Arg Gly Ser65 70 75Leu Asp Leu Ile Ser Leu Pro Ala Asp Phe Ser Ala Phe Ser Ser80 85 90Val His Met Tyr Asp Ile Val Val Lys Asn ArgAsp Ser Phe Arg95 100105Val Val Asp Ala109
权利要求
1.一种控制植物根系发育的基因OaRAA1，它是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)与序列表中序列1限定的DNA序列具有80％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
2.根据权利要求1所述的基因，其特征在于所述与水稻根系发育有关的基因OsRAA1，具有序列表中序列1的DNA序列。
3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于该基因的读码框为自3’端第1988到第2316位碱基。
4.一种由权利要求1所述的基因OsRAA1编码的蛋白质，它具有序列表中序列2的氨基酸残基序列或将序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序列2的氨基酸残基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白质。
5.根据权利要求4所述的蛋白质，其特征在于它具有序列表中序列2的氨基酸残基序列。
6.含有权利要求1所述基因的表达载体。
7.含有权利要求1所述基因的细胞系。
8.权利要求1所述的基因在水稻育种中的应用。
全文摘要
本发明公开了一个与水稻根系发育有关的基因及其编码产物与应用。与水稻根系发育有关的基因OsRAA1是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)与序列表中序列1限定的DNA序列具有80％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。由上述基因OsRAA1编码的蛋白质，具有序列表中序列2的氨基酸残基序列或将序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序列2的氨基酸残基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白质。该基因可被生长素诱导表达，并能控制水稻根系的生长发育，对于培养优良的作物品种具有重要的理论及实际意义。
文档编号C07K14/415GK1483821SQ0213075
公开日2004年3月24日 申请日期2002年9月20日 优先权日2002年9月20日
发明者种康, 葛磊, 徐云远, 陈惠 , 赵原, 许明丽, 许智宏, 谭克辉, 种 康 申请人:中国科学院植物研究所