短小芽孢杆菌RP01及其应用的制作方法

本发明属于生物农业科技应用领域，具体涉及短小芽孢杆菌(bacilluspumilus)rp01及其应用。

背景技术：

1904年，德国微生物学家最早提出了植物根际(rhizosphere)这个概念，指植物根周围数毫米的区域范围。植物根际是植物根系与土壤界面的一个微环境，是土壤、根系和微生物三者紧密结合的相互作用位点。根际微生物种群主要是以细菌为主，根据其对植物的作用不同，根际细菌(rhizobacteria)大体上可以分为有益细菌(2％-5％)，有害细菌(8％-15％)和中性细菌(80％-90％)三大类。植物根际促生菌(plantgrowth-promotingrhizobacteria，pgpr)是指能自由生活于土壤中或定植于植物根际的一类可促进植物生长或抑制病原菌活动的菌群，通常指具有固氮、溶磷、解钾、分泌抗生素和产生植物激素等能力或者具有其中之一能力的有益细菌。其中，能够将土壤中植物难以吸收利用的磷转化为植物可吸收利用的有效磷，这种微生物即为溶磷微生物(phosphatesolubilizingmicroorganism，psm)，包括分解有机磷化合物的有机磷细菌和能够分解无机磷化合物的无机磷细菌。

微生物肥料(microbialfertilizers)是指以微生物的生命活动为核心，导致农作物获得特定的肥料效应的一类肥料制品。衡量微生物肥料的质量标准的核心是无害和有效原则。由于我国在微生物肥料方面的研究投入少，使我国的生物肥料产业依然处于整体水平不高、技术创新不足、产品质量和应用效果不稳定的缺点，这些都制约着我国微生物肥料的进一步推广和普及。结合世界农业可持续发展的前提，我国微生物肥料的发展趋势主要包括以下四大方面：1)选育优良菌种；2)不同功能菌株的组合；3)研发多功能微生物肥料；4)重点产品的研究和应用。

土壤微生物群落的多样性决定了土壤微生态系统功能的多样性。接种外源微生物肥料的有效性长期以来一直是学术界的热点争议问题，这主要归因于外源促生菌自身无法与土著优势微生物种群进行竞争而导致的定殖能力低下、遗传性状不稳定等。紫色土是中国典型的土壤类型，广泛覆盖于中国四川盆地。在紫色土中单一接种pgpr对植物的促生效应等已有一定研究，如固氮菌、硅酸盐细菌等。但是，大多数相关研究都是基于对土壤或基质进行灭菌后，再开展接种pgpr对于植物的促生等效应的研究，所引种的外源性菌剂在大田试验条件下，均因生态适应性差等问题，无法与土著微生物竞争而“湮灭”，无法实现对作物的促生效应。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种对植物生长有促进作用的益生菌，该菌株具有溶解无机磷的功能；本发明的目的之二在于提供短小芽孢杆菌rp01在制备微生物肥料菌剂中应用。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、短小芽孢杆菌(bacilluspumilus)rp01，由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为cgmccno：13472。短小芽孢杆菌rp01属芽孢杆菌属的一种好氧菌，菌体呈细杆状，单个细胞为0.6～0.7μm×2.0～3.0μm；孢子呈椭圆型，生长位置为中生，荚膜肥厚；菌落表面湿润透明，难以挑起，边缘整齐。

2、权利要求1所述的短小芽孢杆菌rp01在作为植物生长促生菌中的应用。

进一步，所述促生菌为具有溶解无机磷功能的促生菌。

进一步，所述植物为烟草幼苗。

进一步，所述短小芽孢杆菌rp01的接种浓度为10⁶cfu/ml。

进一步，所述烟草幼苗生长具体为株高、总根长和叶面积的增长。

3、权利要求1所述的短小芽孢杆菌rp01在制备微生物肥料菌剂中应用。

进一步，所述微生物肥料菌剂为微生物溶磷菌剂。

本发明的有益效果在于：本发明公开了短小芽孢杆菌rp01，该菌株具有溶解无机磷的功能，能够有效促进植物生长，经实验测定，在pko无机磷培养基上，当菌体浓度为1×10⁷cfu/ml时，28℃、120r/min培养7天，其发酵液溶磷含量高达129.0±11.89mg/l，表现出较高的无机磷溶解能力。可将其用于制备微生物肥料菌剂，能够有效改善我国南方酸性土壤中农作物磷素营养，从而减少化肥的使用。

生物材料保藏

短小芽孢杆菌(bacilluspumilus)rp01于2016年12月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为cgmccno：13472。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为显微镜(1600倍)下短小芽孢杆菌rp01经染色后的形貌图。

具体实施方式

下面将对本发明的优选实施例进行详细的描述。

实施例1

短小芽孢杆菌(bacilluspumilus)rp01的筛选与鉴定

一、短小芽孢杆菌(bacilluspumilus)rp01的筛选

1、材料准备

(1)供试土壤

土壤采集自重庆市北碚区在西南大学国家紫色土肥力与肥料效应监测基地的轮作蔬菜(莴苣-辣椒-大豆-小白菜)中，样地为种植蔬菜十年以上，且蔬菜产量和质量都较高的种植区。选择3块1×1m范围土壤，按5点采样法随机收集10-20cm土壤，将土样混合均匀后，置于冰桶内，带回实验室于4℃冰箱保存备用。土壤基本理化性质见表1。

表1供试土壤基本理化性质

(2)配置培养基

溶磷菌选择培养基：nacl0.2g；mgso4·7h2o0.1g；mnso4·4h2o0.03g；kcl0.3g；(nh4)2so40.5g；feso4·7h2o0.003g；ca3(po4)23.0g；葡萄糖10g；琼脂15g；去离子水1l；ph中性7.0-7.2。

lb培养基：nacl10g；酵母粉5g；胰蛋白胨10g；琼脂15g；去离子水1l；ph中性7.0-7.2。

2、菌株分离、纯化

称取10g上述供试土壤悬溶于90ml无菌水中，28℃、120r/min振荡2h，选择稀释梯度分别为10^-4、10^-5、10^-6和10^-7，分别取100μl涂于溶磷菌选择培养基上，28℃下培养3-5d。挑取生长速度快或周围有透明圈的菌株，使用划线法于溶磷菌选择培养基分离纯化，直至纯培养后转接至lb培养基中斜面培养，获得菌种，并将筛选出的菌种标记为rp01，并于-80℃下保存。

二、短小芽孢杆菌(bacilluspumilus)rp01的鉴定

1、形态学鉴定

将上述保藏菌种rp01经溶磷菌选择培养基活化后，观察其菌落形态特征，通过观察可知，菌种rp01在溶磷菌选择培养基上能形成明显的溶磷圈，菌落表面湿润透明，难以挑起，边缘整齐，培养1-2d后，菌落直径2-3mm，培养3-5d后，菌落直径5-6mm。挑取菌种进行革兰氏染色、荚膜染色和芽孢染色后于显微镜(1600倍)下观察菌体形态，如图1所示，由图1可知，革兰氏染色菌体为阳性，孢子呈椭圆型，孢子囊未见膨胀，生长位置为中生，荚膜肥厚。

2、生理生化鉴定

参照东秀珠(2001)的常见细菌鉴定手册，对上述分离、纯化后的菌种进行生理生化鉴定，具体实验方法如下，鉴定结果见表2：

(1)接触酶试验：挑取一小环活化24h的rp01菌种，涂抹于已滴有5％(v/v)过氧化氢的载玻片上，如有气泡产生则为接触酶阳性反应，无气泡产生则接触酶为阴性反应。

(2)氧化酶试验：配制1.0％(w/v)二甲基对苯二胺水溶液，滴在滤纸上使滤纸刚好湿润。取活化24h的rp01菌种，用玻璃棒刮取少许菌苔涂在湿润的滤纸上。在10s内菌苔或其边缘呈现红色者为氧化酶阳性反应，在30s内出现红色者为迟缓阳性，不呈现红色或30s以后才呈现红色则属氧化酶阴性反应。

(3)甲基红(m-r)试验：甲基红试剂(即称取甲基红0.02g溶于60ml体积分数为95％的酒精中，再加40ml水混匀)，接种活化24h的rp01菌种于装有灭菌后的葡萄糖蛋白胨培养液的试管中，37℃培养24h后，沿管壁加入3-4滴甲基红试剂混匀，放置，观察是否变色，若培养液由橘黄色变为红色则为m-r阳性反应。

(4)乙酰甲基甲醇(v-p)试验：操作同m-r试验，v-p试剂为40％(w/v)koh溶液15滴，再加入等量α-萘酚溶液(α-萘酚5.0g溶于100ml无水酒精中)，混合均匀，再加入肌酸lmg，猛烈振荡，10min内变为红色即v-p阳性反应。

(5)淀粉水解试验：在牛肉膏蛋白栋培养基平板中加入0.2％(w/v)的可溶性淀粉，用接种环取少量活化24h的rp01菌种点接在配置好的培养基表面，28℃培养24h后，滴加少量的碘液均匀铺满于平板中。菌落周围如出现无色透明圈，则表示该菌具有分解淀粉的能力，则为淀粉水解阳性反应，无透明圈则为淀粉水解阴性反应。

(6)硝酸还原酶试验：接种活化24h的rp01菌种于硝酸盐还原培养液中，37℃培养48h，分成两管，其中一管加入格利斯亚硝酸试剂a(0.5g磺胺酸溶于150ml30％(v/v)醋酸溶液中)、格利斯亚硝酸试剂b(0.5gα-萘酚加入50ml蒸馏水中，煮沸后加入150ml30％(v/v)醋酸溶液)各1滴，如出现红色，则为阳性反应。不出现红色，则在另一管中加入少量锌粉，加热，再加入格利斯亚硝酸试剂a、b各1滴，如出现红色，则为硝酸还原酶阴性反应；如不出现红色，则为硝酸还原酶阳性反应。

(7)糖类发酵试验：将活化24h的rp01菌种穿刺接种于培养基(1.0g(nh4)h2po4，0.2gmgso4，0.2gkcl，酵母膏0.2g，琼脂5g，葡萄糖或木糖10g，蒸馏水1000ml，0.04％(w/v)溴甲酚紫酒精溶液20ml)中，适温培养3d后观察颜色变化，若指示剂变黄，表示糖醇发酵产酸，为阳性；不变或变蓝(紫)则为阴性。琼脂柱中若有气泡出现，则表示为产气反应。

(8)明胶液化试验：用穿刺接种法接种活化24h的rp01菌种于明胶液化培养基(蛋白胨5g；明胶150g；水1000ml；ph7.2-7.4)中，20℃培养48h后，观察培养基有无液化情况，若液化，则为明胶液化阳性反应。

(9)吲哚试验：将活化24h的rp01菌种接种于装有1％(w/v)胰蛋白胨水溶液培养基(ph7.5)的试管中，37℃培养24h后，在培养液中加入乙醚约lml，充分振荡后静置片刻，再沿管壁加入吲哚试剂(对位二甲基苯甲醛3.0g，戊醇75.0ml，浓盐酸25.0ml)。如有吲哚存在，乙醚层呈现玫瑰红色，则为吲哚阳性反应。

(10)柠檬酸盐利用试验：接种活化24h的rp01菌种于柠檬酸盐斜面培养基(柠檬酸钠2.0g；1.0gnh3h2po4；1.0gk2hpo4；5.0gnacl；0.2gmgso4；1.5g琼脂；0.04％(w/v)苯酚红10ml；水1000ml)上，37℃培养36h，若斜面呈蓝色则为柠檬酸盐利用阳性反应，不变色为柠檬酸盐利用阴性反应。

(11)苯丙氨酸脱氨酶试验：接种活化24h的rp01菌种于苯丙氨酸斜面培养基(5.0gnacl；1.0gna2po4；3.0g酵母膏；1.0gl-苯丙氨酸；15g琼脂；水1000ml)上，36℃培养24h，滴加10％(w/v)fecl3试剂3-5滴，自斜面上方流下，若出现绿色则为苯丙氨酸脱氨酶阳性反应。

表2分离、纯化后所得菌种rp01生理生化特征表

注：“+”表示反应为阳性，“－”表示反应为阴性

由表2可知，分离、纯化所得的菌种rp01的生理生化特征为：接触酶、v-p试验及柠檬酸盐利用等试验呈现阳性；氧化酶、m-r试验、硝酸还原酶、吲哚试验及苯丙氨酸脱氨酶试验呈现阴性；能液化明胶，不能水解淀粉。

3、分子生物学鉴定

16srdna序列鉴定上述保藏的菌种rp01的种属，具体方法如下：菌种活化后，接种于lb液体培养基(28℃、120r/min)振荡培养24h，再采用takaraminibestbacteriagenomicdnaextractionkitver.3.0提取细菌全基因组dna，以此为模板进行聚合酶链式反应(polymerasechainreaction，pcr)，即用细菌通用引物27f和1492r扩增16s核糖体序列，引物27f的序列为：5′—agagtttgatcatggctcag—3′，引物1492r的序列为：5′—tacggttaccttgttacgactf—3′。扩增条件为：25μlpremixtaq(takarataqtmversion2.0plusdye)，浓度均为5μm的引物27f和1492r各2μl，1.0μl模板dna，去离子水20μl。扩增程序为：95℃预变性5min，95℃变性60s，55℃退火60s，72℃延伸2min，循环30次，然后72℃延伸10min，得到扩增后的dna样品。将pcr扩增产物送交上海英潍捷基贸易有限公司纯化、测序，结果如seqidno.1。将测序后的16srdna序列提交ncbi(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)进行blast比对并对其同源序列用mega6.06软件的neighbor-join法构建系统发育树。基于16srdna系统发育分析结果表明该菌株与登录号为j254673的短小芽孢杆菌处于同一最小分枝，且与多株短小芽孢杆菌属菌株相似度达到99％以上，结合菌株的形态学特征、生理生化特征，并参照《常见细菌系统鉴定手册》，将其命名为短小芽孢杆菌(bacilluspumilus)rp01，简称rp01。

实施例2

短小芽孢杆菌(bacilluspumilus)rp01溶磷能力的测定

参照文献(虞伟斌，2010)的方法，配制lb液体培养基，取100ml分装于250ml三角瓶中。高压灭菌后，接种rp01，28℃、120r/min培养24h，稀释发酵液菌体浓度至10⁸cfu/ml，备用。

配制溶磷菌选择液体培养基，取100ml分装于250ml三角瓶中，在121℃下高压灭菌30min后，试验组接种2ml上述菌体浓度为10⁸cfu/ml的发酵菌液，对照组加2ml经高温灭菌的lb液体培养基，每个处理重复三次。均在28℃、120r/min培养7d。用稀释平皿菌落计数法(溶磷细菌选择培养基，28℃培养3d)测定发酵终止的菌数；用ph计测定发酵终止的ph值；取发酵液以5000r/min离心10min，收集10ml上清液，采用钼锑抗比色法测定发酵液中可溶性磷含量，结果见表3。

表3菌种rp01溶磷能力测试结果

注：同一列中标记不同小写字母表示处理间差异达5％显著水平。

由表3可知，接种rp01菌种后发酵液可溶性磷含量较对照组显著增加，ph较对照组降低，可见，rp01菌种在酸性条件下具有优异的溶磷能力。

实施例3

短小芽孢杆菌(bacilluspumilus)rp01对烟草幼苗促生能力的测定

将培养皿灭菌后，铺上滤纸，用蒸馏水润湿，将k326烟草种子均匀的铺在滤纸上，25±1℃催芽3-4d(期间保持培养皿滤纸湿润)。将催芽后的烟草种子转移到装有基质(60％腐植土+40％珍珠岩)的育苗穴盘中，每穴放2粒经催芽的烟草种子，其上用基质覆盖，出苗后每穴保留一株烟苗。

待烟草长到3-4叶1心时开始接种rp01菌液(菌液按实施例2方法制备)。设置3个处理：对照、菌液浓度10³cfu/ml和10⁶cfu/ml两个试验组。四次重复，每穴接种1ml菌液(对照接种1ml培养基)，每隔7d接菌1次，共接菌4次，待最后一次接菌后30d和60d，测定烟草株高，地径，叶面积，叶片数，根长。结果见表4。

表4接种rp01菌种30d和60d后烟草幼苗生长情况

注：同一列中“*”表示不同处理间具有显著性差异：“*”表示达到p≤0.05显著水平、“**”表示达到p≤0.01极显著水平。

由表4可知，虽接种浓度为10³cfu/mlrp01菌液后烟草幼苗的株高、总根长和叶面积与对照相比，差异并不明显，但是当接种浓度为10⁶cfu/mlrp01菌液后，烟草幼苗的株高、总根长和叶面积与对照相比显著增长，差异达到极显著，可见，当rp01达到一定浓度后，能明显促进烟草植株生长。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

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<110>重庆师范大学

<120>短小芽孢杆菌rp01及其应用

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