一种防治烟草青枯病的短短芽孢杆菌及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及农作物病害的生物防治，具体说是一株高效产生几丁质酶且对烟草青枯病具有明显抑制作用的短短芽孢杆菌，属于微生物及微生物应用领域。
【背景技术】
[0002]烟草青枯病Wsitwia是威胁我国烟草生产的主要病害，主要为害植株的根茎，严重降低烟草产量和品质。传统的防治措施主要采用化学防治、栽培防治和抗病品种选育等。烟草为叶用经济作物，长期大规模使用化学杀菌剂防治烟草青枯病可引致农药残留、抗药性和环境污染，使烟叶的品质下降，同时也限制烟叶的国内外贸易。而栽培防治和抗病品种选育措施具有局限性，该病害的防治尚无理想的安全有效控制措施。筛选和鉴定具有高效生防效果和光谱杀菌能力的微生物菌株是植物病害生物防治研究的重要内容，特别是具有高效产生几丁质酶和葡聚糖酶的菌株(Prasanna L, EijsinkVGHj Meadow Rj Gaseidnes S.2013.A novel strain of BrevibadIlus laterosporusproduces chitinases that contribute to its b1control potential.Appl Microb1lB1technol, 97: 1601-1611.)。高效生物微生物释放和土壤生态调控相结合有望成为烟草青枯病可持续治理的重要途径之一。通过合理的施用土壤添加剂如有机质和几丁质类物质增强生防微生物活性和诱导寄主植物抗性，可以明显提高病害控制的稳定性。
[0003]几丁质酶和β-1，3-葡聚糖酶已被证明为消解植物病原真菌和细菌细胞壁的主要降解酶系，其中几丁质酶作为生防因子由于其具有广泛的杀菌谱，并与如蛋白酶和β-1，3葡聚糖酶具有协同抗菌活性，而备受关注(Lorito Mj Harman GE，HayesCKj Broadway RMj Tronsmo A, Woo SLj Di Pietro A.1993.Chitinolytic enzymesproduced by Trichodema harzianum^antifungal activity of purified endochitinaseand chitob1sidase.Phytopathology, 83: 302-307.; Arora NKj Kim MJj Kang SC，Maheshwari DK.2007.Role of chitinase and β —1，3—glucanase activities producedby a fluorescent pseudomonad and in vitro inhibit1n of Phytophthoracapsiciand Rhizoctonia solani.Can J Microb1l, 53: 207-212.; Someya N，TsuchiyaKj Yoshida T，Noguchi MT，Akutsu RKj Sawada H.2007.Fungal cell walldegrading enzyme-producing bacterium enhances the b1control efficacy ofantib1tic-producing bacterium against cabbage yellows.J Plant Dis Protect,114: 108-112.) 某些微生物如细小芽抱杆菌eereiAs和哈茨木霉Trichoderma
等产生的几丁质酶具有广谱抑制病原真菌(Lorito Mj Harman GE，HayesCKj Broadway RMj Tronsmo A, Woo SLj Di Pietro A.1993.Chitinolytic enzymesproduced by Trichodema harzianum^antifungal activity of purified endochitinaseand chitob1sidase.Phytopathology, 83: 302-307.; Huang CJj Wang TKj ChungSC， Chen CY.2005.1dentificat1n of an antifungal chitinase from a potentialb1control agent, Bacillus cereus 28-9.J B1chem Mol B1l 38:82-88.);焚光假单孢杆菌产生几丁质酶和β -1, 3-葡聚糖酶对大雄疫霉菌和立枯丝核菌的细胞壁具有明显的消解作用。虽然几丁质酶广谱杀菌能力的重要性，短短芽孢杆菌及其产生的几丁质酶对烟草青枯病的生物防治研究尚未见系统报道。本项研究应用筛选具有高效产生几丁质酶的短短芽孢杆菌GB6-1，在离体条件下测定其对烟草青枯病菌的抑制作用，评价该菌对烟草青枯病的生物防治潜力，为进一步开发和利用该菌提供理论依据。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种短短芽孢杆菌菌株，该菌株对烟草青枯病菌具有高效生物防治功能。
[0005]本发明采用的技术方案是:
为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下:一种短短芽孢杆菌，分类命名:Brevibacillus Are [is，该菌汉 brevis GB6-1 的 16S rRNA 序列(1031bp)已上传至 NCBI的GenBank数据库(序列号:KP715564)，于2015年7月17日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号；保藏编号:CGMCC No: 11135。
[0006]本发明的基本技术方案为，将2013年8月13日采自贵州省毕节市大方县发生烟草黑胫病的烟田土壤，依据16SrRNA序列分析和培养形状等，确定该菌为短短芽孢杆菌。
[0007]通过大量的生物学实验证明，本发明的短短芽孢杆菌具有高效分泌几丁质酶和β -1, 3-葡聚糖酶特性，对烟草青枯病菌具有明显的抑制作用。
[0008]短短芽孢杆菌菌株的分离:土壤样品经无菌水梯度稀释至10 5，37°C接种至平板培养基(0.1%K2HP04、0.05%MgS04.7Η20、0.2% 胶体几丁质，pH 6.8)培养 2_3d 后，挑取周围有透明圈的菌落，在含0.2%胶体几丁质的平板上纯化，获得此产几丁质酶的菌株。
[0009]菌株的培养性状鉴定:将纯化好的菌株移入到几丁质和营养(NA)培养基中，37°C培养箱培养。第3d分别观看菌落颜色及是否具有透明圈，测量菌落大小及透明圈直径。革兰氏染色法染色。鉴别细菌，经初染、媒染、脱色、复染四步制作薄片，干燥，镜检。
[0010]菌株的分子生物学鉴定，16S rRNA基因片段序列比对，系统发育分析。
[0011]短短芽孢杆菌产生的几丁质降解酶系测定:几丁质降解酶系活性依据胶体几丁质生成的N-乙酰葡萄糖胺(NAG, N-acetyglucosamine)含量测定。
[0012]短短芽孢杆菌产生的β -1, 3-葡聚糖酶活性测定:β -1, 3-葡聚糖酶活性依据昆布多糖降解生成的葡萄糖含量测定。
[0013]短短芽孢杆菌对烟草青枯病菌的抑制作用:采用菌液对烟草青枯病菌的消解作用。
[0014]本发明的一个方面，一种包含短短芽孢杆菌的菌剂，所述菌剂可以是本领域技术人员所知任何技术手段制备任何形式的菌剂，例如通过发酵培养后进行冻干获得的干菌剂，也可以是液体形式的浓缩液态菌剂。
[0015]本发明的一个方面，所述包含短短芽孢杆菌菌株的菌剂在抑制烟草青枯病菌应用。
[0016]
本发明的有益效果和优点是:本发明的短短芽孢杆菌菌株烟草青枯病菌具有明显的抑制作用；并具有高效产生几丁质酶β-1，3-葡聚糖酶活性，本发明的短短芽孢杆菌菌株对烟草青枯病的生物防治具有很大的应用潜力。
【附图说明】
[0017]
图1为本发明中短短芽孢杆菌GB6-1在NA培养基上培养产生的菌落形态图。
[0018]图2为本发明中短短芽孢杆菌GB6-1在含0.2%几丁质的培养基上产生的菌落形态图。
[0019]图3为本发明中短短芽孢杆菌GB6-1的透射电镜照片。
[0020]图4为本发明中短短芽孢杆菌GB6-1的16SrRNA特异性序列。
[0021]图5为本发明中短短芽孢杆菌GB6-1的系统发育树。
[0022]图6为本发明中短短芽孢杆菌GB6-1在产酶培养基上5d内的产酶活性变化。
[0023]图7为本发明中短短芽孢杆菌GB6-1对烟草青枯病具有明显抑制作用的效果图。
【具体实施方式】
[0024]实施例1:本发明的短短芽孢杆菌菌株的分离
分离培养基:诱导产酶培养基，0.1% Polyp印tone, 0.05% MgS047H20，0.1% KH2PO4,0.2%NaCl，0.2% 1%胶体几丁质，PH调制6.8。1%胶体几丁质制作:称取1g几丁质(Sigma，St.Louis, MO，USA)于100 mL 85%的Η3Ρ04ψ，充分溶解，4°C过夜，加入500mL超纯水，电动搅拌使其充分分散，用超纯水洗至PH5.0左右，4°C保存备用。
[0025]扩繁培养基:MRS液体培养基，1g酪蛋白胨；10g牛肉浸提取物；5g酵母提取物；20g葡萄糖，定容lOOOmL，供抑菌测定用。
[0026]分离方法:称取Ig病土放到15mL带塞试管中，加入9mL水，室温下在摇床上200 r/min,摇晃lh。取上清液ImL梯度稀释至10 5倍，在诱导产酶培养基(0.1%Κ 2ΗΡ04、0.05%MgS04*7H20、0.2%胶体几丁质，pH 6.8)上划线，放于37°C培养箱3 d。挑取周围有透明圈的菌落，在含0.2%胶体几丁质的平板上纯化，获得此产几丁质酶的菌株。观察菌落生长情况，挑取有透明圈的菌落纯化培养并保存。
[0027]实施例2:本发明